核医学第二讲体外分析

1、体外分析 1960年美国的Berson和Yalow 将核技术与免疫学技术相结合建立了放射免疫分析法，并首先用于测定血浆胰岛素浓度，由于该法对医学的巨大贡献，1977年Yalow获得了Nobel奖。Yalow2体外分析以放射性核素或其他非放射性物质标记的配体(Ligand)为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。 3体外分析技术体外放射分析非放射标记免疫分析放射免疫分析（RIA）免疫放射分析 (IRMA)受体的放射配基结合分析(RBA)酶免疫分析(EIA)化学发光免疫分析(ECLA)时间分辨荧光免疫分析(TrFIA)4 Radioimmunoassay

2、,RIA 放射免疫分析5RIA的基本原理竞争抑制结合反应： 放射免疫分析是在体外条件下，由足量的非标记抗原（Ag）与定量的标记抗原（*Ag）对限量的特异性抗体（Ab）的竞争抑制结合反应。6基本原理 Ag-Ab + Ag *Ag AbAg+*Ag-Ab + *Ag(B)(F) *Ag与Ag 免疫活性相同*AgAg AbAg= * Ag , AgAb=*AgAbAg *Ag , *AgAb (B) *Ag(F)Ag *Ag , *AgAb (B) *Ag (F)7Ag*AgAb*AgAbAgAb*Ag+Ag8 AgAb Ag.Ab Ag* Ag*.AbAg*与Ag由于免疫化学性质一致，共同竞争性与

3、Ab结合当Ag*和Ab的量保持恒定，Ag*与Ag之和大于Ab时，则Ag*.Ab复合物的形成受Ag含量的制约，二者之间存在函数关系，即随着Ag浓度的增加，Ag*.Ab复合物也减少，因为Ag*对Ab的结合被Ag竞争性抑制9标准曲线的绘制方法用一系列已知浓度的标准抗原和一定量的标记抗原在一定条件下同限量的特异性抗体进行反应；在反应达到平衡后，利用适当的分离方法分离B和F；分别测量B和F的放射性；用反应变量（如B/F）作为纵坐标，反应剂量作为横坐标（即一系列标准抗原）作一条曲线，就得到不同浓度的标准抗原对反应变量的竞争抑制曲线，这就是剂量反应曲线。 10Ag2550100200400800*AgAb分

4、离B、FB1%B2%B3%B4%B5%B6%123456B%？11B%标 准 曲 线12在实际的操作中，一般要设立：最大结合管（零标准管Bo）：标准抗原的量为0，只有标记抗原和特异性抗体时，标记抗原与抗体充分反应后分离B和F，所测得的B的放射性为Bo。这是没有标准抗原与之竞争时，标记抗原和抗体的结合达最大值。非特异结合管（NSB）：标记抗原除了要和特异性抗体结合以外，还要和一些杂质蛋白或容器的管壁等结合，对我们的分析结果产生影响。NSB管是用蒸馏水代替特异性抗体，在相同条件下反应后测得的放射性。RIA中的测定管13总放射性管（T）：反应后不分离就直接测得的放射性就是总放射性。表示标记抗原抗体复

5、合物和游离的标记抗原的总放射性。标准管（B1Bn）：放有不同浓度的标准抗原，再加入相同量的标记抗原和特异抗体。一般在反应后分离出沉淀，测定沉淀的放射性作为B。样品管（Bx）：用同剂量的样品代替标准管中的标准抗原，在相同条件下反应和分离，同样取沉淀测得其放射性，就可以在绘制的标准曲线上找到样品的浓度。14标准曲线左：横座标为等份刻度；右：横座标为对数刻度 15RIA基本技术标准品（标准抗原）标记抗原抗体分离技术标准曲线16标准抗原的要求标准抗原与待测抗原、标记抗原具有基本相同的免疫活性，即质同。他们的化学结构和化学性质要相同，对特异性抗体的亲和力要相同。并且，标准抗原与待测抗原所处的介质条件要相

6、同。17标准抗原的定量要准确：整个RIA分析系统的定量基础就是标准抗原的量，因此标准抗原的定量一定要准确，即与国家规定的标准品相比有良好的可比性。只有保证标准抗原的准确定量，才能保证RIA分析系统的准确度和精确度。18标准抗原必须高纯度：标准抗原应该含有尽可能少的化学杂质，以避免杂质对反应和计量的影响。标准抗原的稳定性要好：要保证在试剂盒的运输、储存和在实验过程中应该不发生降解，分离、破坏等。19标记抗原指抗原分子中有一个或两个原子被放射性核素所取代。 最常用的是125I，因为他的比活度比较高，标记和测量都相对容易，且半衰期合适（60天）利于商品化。 20标记抗原的要求质同，即标记抗原与标准抗

7、原、待测抗原的化学性质和免疫活性要相同。 标记抗原要有适当高的放射性比活度。比活度高则在允许的相同的测量统计误差的前提下，所使用的标记抗原的量必然减少，那么在反应中与之竞争的待测抗原的量也相应减少，方法的灵敏度就提高了。但过高的比活度，也会引起诸如辐射自分解和免疫活性受损的问题。 21标记抗原要有足够高的放射化学纯度，一般要大于95%。放射化学纯度不高，可能使一些放射性的杂质对RIA的免疫反应和动力学参数产生影响。由于存在放射性核素的衰变，因此在长期储存后的标记抗原一般要经过重新提纯后才能再次使用。22标记抗原的稳定性要好：和标准抗原相比，标记抗原由于有了放射性核素射线的影响，更容易发生分解。

8、在标记抗原的储存上，应遵循标记化合物的保存原则即低温、降低比放射性、清除自由基等。23特异性抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体。抗体的质量之间关系到RIA分析方法的灵敏度和特异性。24多克隆抗体一般是用抗原免疫年轻、健康的纯种小动物（一般是羊或兔子）而诱发产生的抗血清。制备的方法成熟、简便、生产量大；但是里面成份复杂，免疫反应的动力学规律复杂。单克隆抗体是通过杂交瘤技术筛选制备的，成份单一、稳定、特异性强；但成本较高。25抗体的要求（三高）高亲和力高特异性高滴度26抗体的检测指标1. 亲和常数K（affinity constant）：亲和常数反应了抗体与抗原的亲和力。K值越大，形成抗体抗原复合物速

9、度快，解离少，灵敏度高，准确度和精确度都好。K=结合常数k1 / 解离常数k2 。 272.交叉反应率指抗体识别相应抗原类似物的能力，反应了抗体的特异性。在生物体内的复杂环境中，许多生物活性物质都有很多相似的类似物，例如甲状腺素中就有T3、T4、rT3等，雌激素里又有雌二醇、雌三醇等。 交叉反应率越低，则说明抗体与抗原类似物的交叉反应就越小，其识别抗原类似物的能力就越强，特异性就越强。 28常用50%置换法来测定交叉反应的百分率。即将被测物质和其类似物，分别作竞争抑制曲线，比较两者在其结合率为零管结合率（B/B0=50%）时的剂量响应浓度，其比值即为交叉反应百分率，也就是该抗体对被测物某种类似

10、物的相应活力。 293.滴度又称稀释度，反映了抗血清中有效抗体的浓度。指在没有标准抗原存在的时候，结合50%的标记抗原时抗血清的稀释度。其方法就是用缓冲液将抗血清稀释为不同的浓度，各置于试管中，然后各加一定量的标记抗原进行反应，等到反应平衡后分离B和F，测出B的放射性，算出B%，以B%为纵坐标以抗血清的稀释度为横坐标作出抗血清稀释曲线，B%为50% 所对应的抗血清滴度为工作滴度。 30RIA的分离方法指分离标记抗原抗体复合物（B）和游离标记抗原（F）的方法。根据使用的分离剂不同可以分为：非特异性分离方法：利用物理、化学或生物化学的方法如吸附、过滤、沉淀等。特异性分离方法：利用免疫反应的特异性来

11、进行分离的方法。常用的分离方法有双抗体法 固相法等31分离方法的要求分离完全、快速。不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不使抗原-抗体复合物解离或形成新的复合物。受环境因素（温度、PH值等）的影响小。操作简便，分离剂来源丰富、价廉。32标准曲线的拟合方式标准曲线是衡量待测样品中配体浓度的客观尺度和基准反映检测质量的指标标准曲线要最大限度地反映量效关系便于自动化分析，使用灵活每一批分析必须做一条标准曲线。WHO推荐的数据处理模型是四参数单位点质量作用模型和四参数logistic模型33 RIA特点 特异性强灵敏度高，可检测10-910-12 g水平稳定性好操作简便适于多种生物活性物质RIA

12、测量的是免疫活性34误差的分类和来源 根据来源不同的误差，可以把实验中产生的误差分为两类：系统误差随机误差35是由于试剂、仪器或操作方法上一个固定的缺陷而造成整批结果倾向性的偏差，影响了结果的正确性。如标准品不标准、加样器不准等系统误差引起的测定结果的偏差是固定的偏大或偏小。系统误差是可以避免的。系统误差36是由于实验过程中各种偶然因素造成同一样品多次测定的结果不一致。如加样、分离、放射性测量等误差的出现是随机的，与真实值的偏离是双向性的，可大可小。 随机误差无法避免。随机误差37质量控制质量控制就是使用合适的方法以检查、表示和消除来自试剂药盒和测量体系的误差，并使这种误差降低到某一允许水平。

13、具体作用有：1检查误差的程度，决定测定结果的取舍。2识别误差的来源并消除其原因。3改进测定方法的设计以提高质量。 38RIA质量控制指标 实验室内部的质量控制侧重于对检测质量的控制，保证从样品收集到发出结果报告的整个过程中能及时发现各种误差，并分析原因，找出纠正的方法。 质量控制的指标包括：精密度、准确度、灵敏度、特异性、稳定性 39精密度指同一样品重复测定的一致程度，即测定的重复性，通常用变异系数CV和标准差SD表示CV=SD/X批内CV：同一样品同批测定的变异系数批间CV：同一样品不同批次测定的变异系数RIA中应做复管或三管40是指测量值与真值的符合程度，其偏离真值的误差就叫做偏差。在实际

14、工作中我们用设置质控样品、测定回收率或进行健全性评价的方法来判断准确度。 准确度41回收率测定回收率（） （回收管测定值对照管测定值）/回收管加入的已知量100或回收率（） 回收管测定值/（对照管测定值回收管加入的已知量）100对照管：加入样品回收管：加入样品和已知量的分析物回收率一般为90110之间42质量控制样品是含有已知剂量待测物的血清样本。质控样品和待测样品为同一种物质，具有相同的生物和免疫活性。质控样品的浓度应准确定量并有合理的浓度范围。通常是根据待测物在人体血清内的正常浓度制定高、中、低三个剂量水平的质控样品。使用时将质控样品分置在待测样品的不同位置中同时检测。质量控制样品43质控

15、图44主要用于评价标准品与待测样品的免疫活性是否一致。用反应缓冲液将样品稀释成不同的剂量，绘制样品稀释曲线，如果样品与标准品免疫活性相同，得到的曲线应该是一组平行的曲线，所以又称为平行性实验。 健全性45是指RIA方法刚能与不含有标准抗原的零标准管在统计学上区别开来的抗原最低剂量，即该RIA方法的最小可检测量。确定灵敏度的方法主要有： 同一样品10次测量结果的B/B090的剂量的平均值作为最小可测量。 以10次测量结果的B0管结合率均值减去2SD（标准差）的结合率的剂量对应值为最小可测量。灵敏度46 方法的特异性主要取决于抗体的特异性。 用抗体的交叉反应率来表示。特异性47稳定性 测量结果的稳

16、定性可以通过剂量反应曲线的各个参数的稳定性来间接反映。 如标准曲线的斜率和截距，非特异性结合率，零标准管结合率及其75%、50%、25%处的剂量值(ED75、ED50、ED25)。48操作基本步骤加样：注意所有的试管加样总体积要保持一致，所处的介质环境也要一致。孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间不同，一般是37。分离：选择好的分离方法进行分离。测量：测量游离或结合物部分的放射性。数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算。 49免疫放射分析immunoradiometric assay, IRMA50基本原理免疫放射分析是一种非竞争性的抗原抗体反应。 将放射性核素标记在抗体上，用过量的抗体

17、与抗原结合，反应平衡后，用分离方法除去多余的抗体，测量抗原-标记抗体复合物的放射性。利用抗原-标记抗体复合物的放射性活度与抗原剂量之间的函数关系来测定待测抗原的量。 51双位点法(Ab2为McAb)具有代表性的固相免疫放射分析法：固相Ab1+Ag (固相)Ab1.Ag (过量) + 过量Ab*2(McAb) 固相Ab1.Ag.Ab*2 +剩余Ab*(洗去) sandwichAb1AgAb2*52B%B%拟合的标准曲线拟合的NSB拟合的标准曲线拟合的NSBIRMA的标准曲线及非特异结合曲线RIA的标准曲线及非特异结合曲线53RIA与IRMA区别RIA IRMA标记抗原 标记抗体定量抗体和标记抗原

18、 过量抗体和标记抗体竞争性结合 非竞争性结合抗原和标记抗原抗体 抗原和标记抗原抗体复合物呈负相关 复合物呈正相关 灵敏度、特异性更高 标记物的稳定性好 待测抗原需有两个抗原决定簇， 故不适于小分子多肽 54标记免疫技术发展方向放射免疫技术 免疫放射技术多克隆抗体 单克隆抗体放射性标记免疫技术 非放射性标记免疫技术55非放射性标记免疫分析技术Enzyme immunoassay,EIAChemiluminescence immunoassay,CLIATime-resolved fluoroimmunoassay,TrFIA56酶标记免疫技术EIA原理：酶标记（HRP、AP、GO等）生成酶标记抗

19、原抗体复合物相应的酶的底物（如TMB、5-AS）生成有颜色的产物（如黄色、棕色）分光光度计测定颜色深浅（OD值）以决定待测含量57经典ELISA双抗法：测抗原固相载体Ab 固相AbAg 固相Ab-AgHRP-Ab 固相Ab-Ag-HRP-Ab 底物 颜色反应 分光光度计测定OD间接法：测抗体固相载体Ag 固相AgAb 固相Ag-AbHRP-抗人IgG 固相Ag-Ab-HRP-抗人IgG底物 颜色反应 分光光度计测定OD 58化学发光免疫分析技术 经典的CLIA是用发光化合物异鲁米那和吖啶酯为标记物，在碱性条件下遇过氧化物便能发 生单光子发射，光子数量和发光标记抗原抗体复合物呈正比59化学发光酶

20、免疫分析（CLEIA）标记物：碱性磷酸酶（ALP）底物：金刚烷测定：发光强度60化学发光免疫分析碱性磷酸酶 发光发光底物Dioxetane光电倍增管测量光强度ALP标记Ag或Ab，形成Ag.Ab反应去除游离部分温育BECKMAN公司Access分析原理分为竞争法与夹心法两类61电化学发光免疫分析（ECLIA） 是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应 激发物：三丙胺 发光底物：三联吡啶钌 标记物：三联吡啶钌的衍生物N-羟基琥珀酰胺酯标记抗体62ECLIA反应过程在电阳极上1.TPA失去电子氧化为阳离子自由基TPA，二价（基态）三联吡啶钌被氧化为三价的三联吡啶钌2. 阳离子自由基TPA性

21、质不稳定，自发地失去一个质子变成自由基TPA（还原剂）3. 自由基TPA将一个电子给三价的三联吡啶钌，从而生成二价的三联吡啶钌（激发态），TPA则分解为二丙胺和丙醛4. 激发态二价三联吡啶钌发射波长620nm光子，重新生成基态的二价三联吡啶钌5. 上述过程周而复始，只消耗TPA63时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）镧系元素（如铕Eu）经激发后能发出特征性荧光，其荧光寿命较一般干扰荧光长数倍，故称时间分辨如：经0.5s （340nm）脉冲光激发，延迟400 s ，用613nm检测并记录荧光强度400s ，间歇200 s 再次激发，每一工作周期仅1ms，每秒钟可重复检测1000次64时间分辨荧光检测的基本原理示意图荧光衰