苦参碱抑制宫颈癌HeLa细胞增殖作用及机制课件

1、苦参碱对宫颈癌HeLa细胞的作用摘自齐鲁医学杂志1.摘要 目的： 探讨苦参碱对人宫颈癌HeLa细胞体外增殖的抑制作用及其分子机制。2.摘要 方法： 以不同浓度(0.5, 1.0, 1.5,2.0 g/L)的苦参碱分别处理Hela细胞24、48、72h后，应用MTT法检测细胞增殖抑制率，WesternBlot方法检测培养48h细胞中真核细胞翻译起始因子4E（eIF4E）、4E结合蛋白1（4E-BP1）蛋白表达情况。3.摘要 方法： 1. 0 g/L的苦参碱作用Hela细胞1、3、6、12 h后，Western Blot方法测其eIF4E、4E-BP1蛋白磷酸化水平。4.摘要 结果：苦参碱明显抑制

2、Hela细胞增殖，呈时间和剂量依赖性： 在相同时间内，随着苦参碱浓度的增加，Hela细胞的增殖抑制率明显升高(P0. 05); 2.0 g/L.苦参碱作用72 h对Hela细胞增殖抑制率最大，为(65. 30士2. 17)%。 在同一浓度时，随着苦参碱作用时间的延长，Hela细胞的增殖抑制率也明显升高(P0.05)。 1. 0 g/L苦参碱作用于Hela细胞不同时间后，细胞eIF4E、4E-BP1蛋白磷酸化水平均降低，且呈时间依赖性(P0.01)。 6.摘要 结论： 苦参碱可以明显抑制体外培养宫颈癌Hela细胞的增殖，其作用可能是通过抑制eIF4E以及4E-BP1的磷酸化，从而抑制蛋白翻译来实

3、现的。7.关键词苦参碱;Hela细胞;真核细胞翻译起始因子4E;4E结合蛋白1 8. 苦参碱(Matrine)化学分子式为C15H24N20,是从中药苦参的干燥根中提取的具有抗病毒、抗感染、平喘、增强机体免疫力、升高白细胞、保肝等广泛药理作用的活性物质。简 介9. 近年来研究表明，苦参碱还具有明显的体内、体外抗肿瘤作用，在肝癌、胃癌、肺癌、白血病中均能明显抑制肿瘤细胞的增殖且没有化疗药物的毒副作用。但是，关于苦参碱的抗肿瘤作用的机制研究较少，尤其是苦参碱对肿瘤细胞中蛋白质翻译通路的影响研究更少。简 介10. 本研究选择人宫颈腺癌HeLa细胞作为研究对象，将调控细胞增殖信号通路中重要因子真核细胞

4、翻译起始因子4E、4E结合蛋白1作为研究切入点，探讨苦参碱对体外培养的HeLa细胞增殖的影响及其可能的分子机制，以探讨其在妇科恶性肿瘤治疗中的应用价值。简 介11.材料与方法 实验材料HeLa细胞株，由第三军医大学野战外科研究所保存。苦参碱购白西安飞达生物公司。DMEM高糖培养基、胎牛血清为Gibco公司产品。四甲基偶氮唑蓝(MTT)由美国Sigma公司提供。eIF4E、磷酸化的eIF4E ( p-eIF4E) 、 4E-BPl、磷酸化的4E-BP1(p-4E-BP1)抗体均购自Cell Signa-ling公司。肌动蛋白抗体购自北京四正柏生物科技有限公司。12.材料与方法-实验方法 细胞株培

5、养 HeLa细胞培养于含体积分数0. 10胎牛血清的DMEM高糖培养基中(下称完全培养基)，置37、含体积分数0. 05 CO2、饱和湿度培养箱中培养，待细胞长至融合度为80%90%传代，所有实验均采用对数生长期细胞。13.材料与方法-实验方法MTT法检测HeLa细胞增殖抑制率 将HeLa细胞6103个/孔接种于96孔培养板，细胞贴壁后分别加入终浓度为0.5,1.0,1.5,2.0 g/L的苦参碱处理细胞，对照组加入等体积无血清培养基，使每孔终体积为200L，空白调零组只加200L的完全培养基，每组设6个复孔。14.材料与方法-实验方法MTT法检测HeLa细胞增殖抑制率 继续培养24,48,7

6、2h后，加入5g/L的MTT 20L,37孵育4h,弃上清，每孔加入200L的DMEM，振荡使结晶溶解，上机检测490 nm波长处吸光度(A)值，计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率=(1一实验组平均A值/对照组平均A值)100%。实验重复3次，取平均值。15.材料与方法-实验方法Western Blot检测eIF4E、4E-BP1蛋白表达 HeLa细胞2105个/孔接种于96孔板，贴壁后分别用终浓度为0.5,1.01.5,2.0 g/L的苦参碱处理细胞，作用48 h后终止培养，常规收集细胞蛋白，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转移至PVDF膜上，50g/L脱脂奶粉室温封闭2h，加入一抗(稀释比例按说

7、明书进行)。16.材料与方法-实验方法Western Blot检测eIF4E、4E-BP1蛋白表达 4孵育过夜,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG(1:10000)，室温孵育2h，每次孵育后用加Tween的Tris-HC1缓冲盐溶液(TBST)洗膜3次，每次10min。17.材料与方法-实验方法Western Blot检测eIF4E、4E-BP1蛋白表达 化学发光试剂(ECL)显色，在X线洗片机(HQ-320XT)上曝光，实验重复3次。以-actin为内参，应用图像分析软件对特异性条带做定量分析，以目标条带与内参的A值比反映蛋白相对表达量。18.材料与方法-实验方法Western Blo

8、t检测eIF4E、4E-BP1蛋白的磷酸化水平 HeLa细胞2105个/孔接种于96孔板，贴壁后，实验组加入终浓度为1. 0 g/L的苦参碱，分别作用1,3,6,12 h后终止培养，提取细胞总蛋白，用特异性磷酸化抗体分别检测p-eIF4E（Ser209)、p-4E-BP1(Thr37/46)蛋白表达水平。 19. 统计学处理 应用SPSS 16.0及PPMS 1.5统计学软件进行数据处理，数据间比较采用方差分析，两两比较采用LSD法。 统计学处理20.苦参碱对HeLa细胞增殖的影响在相同作用时间下，随着苦参碱浓度的增加，HeLa细胞的增殖抑制率明显升高，差异有显著意义(P0.05)。在同一浓度

9、下，随着苦参碱作用时间的延长，HeLa细胞的增殖抑制率逐渐升高(P0.05)。结果21.苦参碱对HeLa细胞增殖的影响 苦参碱浓度和作用时间对HeLa细胞增殖抑制率的影响有交互作用(P0. 05)，其中2.0 g/L苦参碱作用72 h对HeLa细胞增殖抑制率达到最大，为(65.302.17)%。见表1。结 果22.结 果 23. 苦参碱对eIF4E 以及4E-BP1蛋白表达的影响 不同浓度的苦参碱作用于HeLa细胞48 h后，苦参碱组eIF4E、4E-BP1蛋白的表达与对照组比较，差异无显著性(P0.05)，见图1、表2。结 果24. 图1 不同浓度苦参碱对HeLa细胞蛋白水平的影响结 果25

10、.结 果26. 苦参碱对eIF4E、4E-BP1蛋白磷酸化水平影响 浓度为1.0 g/L的苦参碱作用于HeLa细胞不同时间后，其eIF4E、4E-BP1的磷酸化水平较对照组均明显降低(P0.01)，且呈时间依赖性，随作用时间的延长，差异逐渐增大。见图2、表3。结 果27. 结果图2 1.0g/L 苦参碱作用不同时间对HeLa细胞中蛋白磷酸化水平的影响28. 结 果29. 宫颈癌的发病率在妇科恶性肿瘤中居首位，化疗是其治疗的重要手段之一，常规化疗药物的毒副作用限制了其应用，而中药因为毒性小成为抗肿瘤研究热点。苦参碱属喹诺里西啶类，是中药苦参含量最高的生物碱成分之一。此外，苦参碱对多药耐药细胞株也

11、具有诱导凋亡作用。但是关于苦参碱在宫颈癌中应用的研究较少。讨 论30. 蛋白质翻译的调控影响了包括细胞的增殖、生存和死亡在内的重要过程。其中，eIF4E是依赖性帽mRNA翻译过程中的限速因子，诸多研究表明其可以诱导细胞恶性转化和肿瘤发生，且与肿瘤的侵袭转移能力及病人分期、预后相关。本研究结果显示，苦参碱对HeLa细胞eIF4E蛋白表达无明显影响，但是对其磷酸化水平具有明显的抑制作用。讨 论31. 而FAN等的研究表明，p-eIF4 E是eIF4E蛋白活化形式，可以识别帽状结构并促进翻译起始，提示苦参碱可能并不影响肿瘤细胞中eIF4E的表达，而是通过降低eIF4E磷酸化水平来抑制蛋白翻译，从而发挥抑制细胞增殖的作用。讨 论32. 本研究结果还显示，苦参碱可明显降低HeLa细胞中4E-BP1的磷酸化水平，而对4E-BP1的总蛋白表达量无明显影响，这使得细胞中去磷酸化4E-BP1含量增多，而去磷酸化的4E-BP1可以与eIF4E结合，阻止eIF4F翻译起始复合物的形成，从而阻止mRNA的翻译，提示苦参碱可能通过抑制4E-BP1及eIF4E磷酸化而抑制HeLa细胞的蛋白翻译起始过程。讨 论33. 目前研究结果显示，参与4E-BP1和eIF4E活性调控