芽胞杆菌属Bacillus的检验

1、芽胞杆菌属Bacillus的检验一群需氧、能产芽胞的革兰氏阳性大杆菌。共40多种，其中对人畜致病的较少，仅炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)具强烈致病性，侵害草食动物及人，引起动物和人类炭疽病。类炭疽杆菌(形态与炭疽杆菌相似)是实验室常见的污染菌，偶尔也能致病。蜡状芽胞杆菌(S. cereus)的某些菌株可产肠毒素，引致食物中毒；其他多为腐生菌，主要存在于土壤、水和灰尘中，如枯草芽孢杆菌(B. subtilis)。一、炭疽芽胞杆菌（B. anthracis）该菌俗称炭疽杆菌，人畜共患病原体，在医学和兽医学上都相当重要，是引起人类、各种家畜和野生动物炭疽（Anthrax）的病原

2、 。（一）形态及染色特征G+大杆菌，长而粗大，菌体平直，两端平截。长3.08.0m，宽1.01.5m；无鞭毛。在组织和血液中单在或短链状，培养后形成竹节状长链。该菌在组织或含血液培养基中可形成荚膜。有氧条件下形成芽孢，位于菌体中央，不膨出菌体。无鞭毛。体内外培养有较大形态差异：（1）体内（即病料中，如血液、组织）形态 单在或短链状(一般约25个)，似竹节状； 形成荚膜；不形成芽胞； 相连的菌端平截或微凹，游离端钝圆，本菌属的其他细菌接头钝圆，如蜡状芽胞杆菌。（2）体外（培养基）形态： 长链状（几十或上百个）； 形成椭圆形芽胞，位于菌体中央或近中央，直径小于菌体； 普通培养基上不形成荚膜。（3）

3、炭疽杆菌特征形态： 慢性局部炭疽病料: 菌体形态常不典型，呈细长弯曲或捻转的杆状； 血琼脂、血清琼脂或碳酸氢钠琼脂上，1020%CO2条件下可形成荚膜； 病料腐败后，菌体分解，但荚膜抗腐败能力较强，荚膜仍可残留，称为“菌影”。 （二）培养特性 1. 需氧或兼性厌氧，最适生长温度30-37，pH7.2-7.6，营养要求不高，普通培养基中生长良好。强毒株形成灰白色不透明、大而扁平、表面干燥；无毒或弱毒株形成稍小而隆起、表面较为光滑湿润、边缘比较整齐的光滑型菌落。 2. 血琼脂：一般不溶血，个别菌株轻微溶血；而该属其他成员多有明显溶血；3. 液体肉汤培养基： 24h呈絮状沉淀生长，上清透明清朗，不形

4、成菌膜和菌环；4.明胶穿刺培养，呈倒松树状，表面液化呈漏斗状。5. 在含0.5IU/ml青霉素的培养基中，可形成串珠反应，与其它需氧芽孢杆菌区别。当青霉素加至10IU/mL时，炭疽杆菌生长受抑，不生长或微弱生长，而该属其他细菌一般不被抑制。 串珠反应 ：在含青霉素0.5IU/ml的培养基中，幼龄炭疽杆菌因细胞壁的肽聚糖合成受到抑制，形成原生质体相互连接成串 。（三）生化特性 生化试验不是炭疽杆菌的主要鉴定项目。可了解以下内容： 分解葡萄糖， V.P阳性， 还原硝酸盐，不产生吲哚、 H2S，H2O2酶阳性。(四) 抵抗力 1、繁殖体：抵抗力不强，同一般无芽孢杆菌。常用消毒剂均能于短时间内将其杀死

5、。 2、芽胞体：抵抗力非常强，对热、干燥等具有较强的抵抗力； 室温干燥可存活十年，干燥背光处可存活40年以上。在动物皮毛上能活数年，混入泥土中可存活数年至数十年，每到春夏时期地面长出青草时，可将泥中的芽胞带至地面，牛羊食入而受感染。 3、牧场一旦被芽胞感染，传染性可保持20-30年。煮沸1h或干热1403h可杀灭芽孢。炭疽杆菌的芽胞对碘敏感，1:2500碘液10min即可杀死芽胞。(五) 抗原结构 1. 结构抗原 (1) 荚膜抗原：多肽，仅见于有毒菌株，与毒力和抗吞噬有关。 (2) 菌体抗原：多糖，与细菌毒力无关。性质稳定，加热煮沸甚至高压蒸汽处理，抗原性不被破坏。在病畜皮毛或腐败脏器中经长时

6、间煮沸仍能与特异性抗体反应形成环状沉淀，称为Ascoli 反应。 (3) 芽胞抗原：由芽胞的外膜和皮质组成，具免疫原性。2. 保护性抗原（PA） 是炭疽毒素（PA、LF、EF）的组成成分之一，具有免疫原性，能刺激机体产生保护性抗体。 （六）致病性动物吃含本菌芽胞的饲料或青草肠出芽增殖血败血症，脾肿大发黑炭疽(病程短而急，数日死亡)。 1、易感性 （1）绵羊、牛、鹿最易感急性败血性，尸僵不全、血凝不良、天然孔出血，臌气；脾急剧肿胀至34倍； （2）马属、骆驼、猪、山羊次之多为慢性局部感染, 如咽部； （3）狗、猫及食肉动物抵抗力强多表现肠炭疽； （4）禽类通常无易感性； （5）人类：因侵入途径不

7、同而出现不同症状。2、毒力因子（1）荚膜：炭疽杆菌的荚膜能抵抗宿主吞噬细胞的吞噬，有利于在机体内生存、繁殖和扩散。（2）炭疽毒素：主要由3种成分构成。 水肿因子(edema factor，EF): 脂蛋白 致死因子(lethal factor，LF): 蛋白质 保护性抗原(protective antigen，PA): 一种辅酶。 此3种成分单独对动物无毒性。前2种成分混合注射家兔或豚鼠皮下可致皮肤水肿；后2种混合注射可致肺部出血水肿，并使豚鼠致死；3种混合注射可出现炭疽典型中毒症状。 炭疽毒素主要是增强微血管的通透性，改变血液循环动力学，血液呈高凝状态，引起DIC和感染性休克。3、致病类型可

8、致人畜共患的急性、热性、败血性传染病。所致疾病分皮肤、肺、肠和败血性炭疽四种。（七）微生物学诊断 1、标本采集 按不同病型采取标本，动物尸体仅能割尾、耳或舌尖。一般常取水泡、脓疱内容物、焦痂、咯痰、粪及血液、脑脊液等。检验时必须注意：（1）病料镜检时一般有荚膜，如无荚膜则分离培养后接种实验动物再进行形态检查。 （2）注意与类似的细菌鉴别，如蜡状芽胞杆菌等。 （3）对疑似炭疽死亡的家畜严禁剖检，因其血液不凝，血溅流地面，血中细菌遇空气即生成芽胞，芽胞在土壤中可存活数十年，造成该地区长期的疫源。如必须检验时，只可取兽耳或尾，密封送检，死兽焚毁或深埋。2. 细菌学检查 （）镜检：大杆菌，两端平截，竹

9、节状 （）分离培养：用普通琼脂或血琼脂 （）纯培养: 镜检、串珠试验、生化试验 （）动物试验：将检验材料制成悬液或纯培养物给小鼠注射，24-36h小鼠死于败血症。 3. 血清学检查 抗原检测 （）Ascoli沉淀反应 将病兽皮革或尸体组织切碎，加水煮沸过滤，取滤液滴加于小管内的免疫血清，室温或37放置10min，如见两液接触面出现白色沉淀环即为阳性，表明滤液中有该菌的多糖抗原。此法可对腐败尸体及皮革进行追补诊断，但特异性不高，可出现假阳性。 （）间接血凝试验 （）协同凝集试验 （）串珠荧光抗体检查 （）琼脂扩散试验 抗体检查：比较恢复期和急性期血清特异性抗体升高情况，确诊或流行病学调查。二、蜡

10、样芽胞杆菌（B. cereus）在自然界分布广泛,常存在于土壤、灰尘和污水中,植物和许多生、熟食品中常见。蜡样芽孢杆菌在食品上于20以上的环境中放置,能迅速繁殖,并产生肠毒素。同时,由于本菌不分解蛋白质,因此,食品在感官上无明显变化,无异味,很容易误食而发生中毒。（一）形态及染色特征革兰氏阳性大杆菌，芽胞不突出菌体，菌体两端较平整，多数呈链状排列，多鞭毛，能动力。不形成荚膜,芽孢成椭圆形,位于菌体中央,芽孢发芽形成菌体后,芽孢衣迅速崩裂。DNA中的G+C含量为31.7%40.1%。引起食物中毒的菌株多为周鞭毛,有动力。（二）培养特性 1、需氧，最适生长30-32。2、在肉汤中混浊生长，有菌膜或

11、壁环，振摇易乳化。3、在普通琼脂平板上，菌落灰白色,不透明，边缘不整齐，表面粗糙，呈毛玻璃状或白蜡状。 4、在血琼脂平板上，菌落呈浅灰色，不透明，表面粗糙似白色毛玻璃状，有草绿色溶血环。5、在MYP（甘露醇-卵黄多粘菌素）平板上，菌落呈粉红色,具有白色混浊环。（三）生化特性1、分解葡萄糖、麦芽糖、淀粉、蔗糖、水杨苷，产酸不产气。2、不分解乳糖、甘露醇、阿拉伯胶糖、鼠李糖、木糖、肌醇、山梨醇、侧金盏花醇、木胶糖。3、靛基质试验阳性（+），硫化氢试验为阴性H2S（-），尿素酶阴性（-），V-P试验阳性（+），KCN试验阳性（+），柠檬酸盐及卵磷脂酶阳性（+）。还原美蓝,紫乳迅速胨化。能24h液化明胶。(四) 抵抗力1、耐热；游离芽孢能耐受10