H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备、鉴定及其模拟表位的筛选课件

华中农业大学2003级硕士研究生论文答辨H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备、鉴定及其模拟表位的筛选报告内容文献综述研究目的与意义技术路线结果与分析小结文献综述禽流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)

神经氨酸酶(neuraminidase,NA)高致病性禽流感

H5和H7危害

禽流感禽流感血凝素HA功能HA表位[文献综述]丝状噬菌体具有一条单链环状DNA基因组外源基因整合到噬菌体基因组中外源蛋白与噬菌体衣壳蛋白融合表达,展示在噬菌体表面噬菌体展示原理[文献综述]制备抗H5亚型禽流感病毒HA的单克隆抗体单抗纯化单抗鉴定噬菌体淘筛测序鉴定阳性噬菌体抗血清制备技术路线HI试验中和试验模拟肽功能确定单克隆抗体的制备流程[技术路线]

结果与分析杂交瘤细胞的制备免疫原：DW毒株

(Ａ/Chicken/Hubei/327/2004)

筛选方法：HI试验

融合２次，共获得13株单抗

杂交瘤细胞染色体计数及相应单克隆抗体亚类杂交瘤细胞株Hybridoma染色体数目Thenumberofchromosomes单抗亚类Antibodyisotypes1D1186（84-87）IgG2a1H887（86-88）IgG12B790（88-93）IgG2a2C985（83-86）IgG2a2H488（85-90）IgG2a4C986（85-88）IgG11C482（80-85）IgG2a1D484（81-89）IgG2a1E1292（84-96）IgG12E1185（83-90）IgG14C1286（81-88）IgG2a4G293（88-97）IgG15E1284（83-87）IgG1脾细胞40－SP2/062-68－杂交瘤细胞染色体数目均高于两亲本细胞染色体数目

HI试验分析单抗的特异性

抗体

病毒

单抗（Mcab）

1D111H82B72C92H44C91C41D41E122E114C124G25E12AIV-H5+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

AIV-H9-

-

-

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-------AIV-H7-

-

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-------NDV-

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-

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-------IBV-

-

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-

-------注：+表示HI试验阳性，―表示HI试验阴性

AIVH5中和效价（Neutralizationtiter）1H81D112B72C92H44C9A/CK/Hubei/327/20041:731:7241:2048>1:163841:14451:2048A/Goose/ZF/ZFE/20041:109>1:40961:1624>1:163841:40961:5236A/CK/XF/XFJ/20041:271:6311:100>1:163841:1781:128A/Duck/XF/XFY/20041:256>1:4096>1:4096>1:163841:81921:6457第1批6株单抗对4株禽流感病毒的中和效价

微量中和试验１M：

proteinmarker1：

Mcab1C4单抗1C4提纯后SDS（12％）电泳图提纯后的抗体可见有两条带，一条重链带50Kd左右，一条轻链带27Kd左右轮数Round加入物Input洗脱物Output产出率Vield第一轮firstround1.32×10111.46×1021.11×10－9第二轮secondround1.2×10111.17×1039.75×10－9第三轮thirdround1.95×1011

6.4×1053.28×10－6第四轮fourthround1.98×1011

6.3×1073.18×10－4

四轮亲和筛选对噬菌体的富集

以纯化单抗1C4为筛选配基，进行了四轮淘筛，随着淘筛次数增加，产出率都在提高

噬菌体结合活性分析大部分噬菌体克隆都与单抗1C4有反应，而与BSA反应很弱，其中有6个克隆（#1，#7，#8，#10，#11，#14）反应的A差值较大（>0.6）,因此将这6个噬菌体克隆测序。噬菌体DNA测序及同源性比较6个序列高度一致，翻译成肽序列为DHTLYTPYHTHP．用ClustaW软件比较12肽和HA的同源性：没有发现完全一致的序列，但在306－312处有相似序列PXHXXHP。提示这一段区域可能与抗体识别位点相关。

竞争抑制实验结果竞争抑制试验

取其中阳性噬菌体扩增液上清与不同浓度的H5亚型禽流感病毒等体积混合，加入到单抗1C4包被的酶标板中，其余操作步骤同ELISA

抑制率＝（未抑制Ａ630-抑制Ａ630）/未抑制Ａ630×100％。率制抑病毒稀释倍数

%小鼠免疫试验结果组别HI抗体效价（log2）中和效价阳性噬菌体01：16阳性噬菌体+佐剂01：20原始肽库扩增液0阴性空白（PBS