高效液相色谱分离技术B

第七章高效液相色谱法三、示差折光检测器四、蒸发光散射检测器五、化学发光检测器§7-3反相色谱一、固定相二、流动相三、保留机理四、色谱条件选择§7-1普通流程及分离原理一、介绍二、普通分离流程三、原理四、色谱分离特点§7-2

检测器一、紫外吸收检测器二、荧光检测器0高效液相色谱分离技术B第1页六、树脂预处理及再生七、试验技术八、离子交换法应用§7-5

凝胶色谱一、基本原理二、凝胶种类三、操作方法四、应用§7-4离子交换色谱一、离子交换二、填料三、IEC保留机理四、离子交换色谱条件选择五、影响离子交换相关原因0高效液相色谱分离技术B第2页§7-6

高效液相色谱试验技术一、柱技术二、洗脱方式三、流动相四、分离模式选择0§7-7高效液相色谱应用一、制备分离二、样品前处理三、HPLC应用四、应用实例高效液相色谱分离技术B第3页第七章

高效液相色谱法

以液体为流动相色谱法称为液相色谱法。采取普通规格固定相及流动相常压输送液相色谱法则为经典液相柱色谱，其柱效低、而且普通不具备在线检测器，通常作为分离伎俩使用。HPLC是以经典液相柱色谱为基础，引入了气相色谱理论与试验方法，流动相改为高压输送，采取高效固定相及在线检测等伎俩，发展而成分离分析方法。该法含有分离效能高、分析速度快及仪器化等特点，因而称为高效液相色谱法。高效液相色谱分离技术B第4页

§7-1普通流程及分离原理一、介绍

1.与经典液相柱色谱法相比

(1)柱内径↓，填充剂粒度↓、均匀性↑，新型固定相问世→分离效率↑。

(2)柱长↓，填充剂机械强度↑，供液压力和进样压力↑，流动相流速↑（1~5ml/min）→分离速度↑（7~8个峰/10min）。

(3)采取光学原理检测器→灵敏度↑。

高效液相色谱分离技术B第5页

2.与GC相比

(1)样品受限制少，对易分解、不轻易气化、分子量大、高极性有机物（70~80%有机物）可用HPLC分析。

(2)不用制备衍生物，降低了误差。

(3)进样量大（500~800μL），易制备。

(4)分离效率降低。高效液相色谱分离技术B第6页二、普通分离流程高效液相色谱仪及普通分离流程见图7-1。三、色谱原理1、概念HPLC：以溶剂或某种溶液为流动相，以装在柱子里固体为固定相，用高压输液泵将流动相压入柱子，使样品组分在柱子里进行分离柱色谱法。2、分类依据色谱柱所用填充剂不一样，HPLC分离原理有：吸附色谱，分配色谱,键合相色谱，离子交换色谱，凝胶色谱等。高效液相色谱分离技术B第7页图7-1

高效液相色谱分离技术B第8页用液液分配色谱机理来讨论高效液相色谱普遍性问题。

色谱分离过程(见图7-2)。（a）在装好填料柱子中加上样品，然后用溶剂洗脱，样品中各组分（若有A、B、C三个组分）分子沿流动相流动方向移动。（b）和（c）表示组分移动。（d）表示经过一段时间洗脱以后，A、B、C三个组分已经被分离开，不一样组分在柱子中移动速度不一样而得到了分离，也就是说不一样组分在柱子上存在差速迁移现象。

另外，对照（a）和（d）能够发觉刚上样后，溶质分子形成色带（又叫谱带）较窄，而到了（d）中，各组分谱带显著变宽，这说明同一组分沿柱子移动时，存在着扩散问题，即谱带扩散。图7-2三组分样品分离过程示意图高效液相色谱分离技术B第9页四、色谱分离两大特点：差速迁移、谱带扩展差速迁移：不一样组分在柱子中移动速度不一样而使其混合物得到分离，即不一样组分在柱子上存在差速迁移现象。引发原因：在分配色谱中，因为不一样组分在固液两相分配系数不一样引发；在离子交换色谱中，主要是因为各组分对固定相静电引力不一样造成。谱带扩展：同一组分沿色谱柱移动时，色带由窄变宽，即同一组分在柱子上存在谱带扩展现象。产生原因：因为同一个化合物不一样分子，在经过柱子时平均迁移速度不一样造成。其原因是因为涡流扩散和各种传质情况差异造成了同一物质不一样分子差速迁移。高效液相色谱分离技术B第10页

§7-2高效液相色谱检测器

当前应用较多有紫外吸收检测器、荧光检测器、电化学检测器、化学发光检测器、蒸发光散射检测器、安培检测器及示差折光检测器等。

1.紫外吸收检测器（ultravioletdetector,UVD）

紫外检测器是HPLC应用最普遍检测器，利用紫外分光光度计原理对各组分进行检测，属浓度型检测器。灵敏度、精密度及线性范围均很好。既用于等浓度，也用于梯度洗脱。但只能用于对紫外线有吸收组分检测，且流动相选择有一定不足，其截止波长必须小于检测波长。高效液相色谱分离技术B第11页

2.荧光检测器（fluorophtometricdetector,FD）荧光检测器利用荧光分光光度计原理对各组分进行检测，其灵敏度高于紫外吸收检测器，但只适合用于能产生荧光或其衍生物能发荧光物质。主要用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合物及酶等检测。在用于氨基酸检测时，需用衍生法制备衍生物，其衍生法分为柱前与柱后衍生两种，惯用邻苯二甲醛或异氰硫基苯为衍生化试剂，是分析氨基酸应用最广方法。高效液相色谱分离技术B第12页3.示差折光检测器（RI）

属于通用型检测器。其检测原理是液体都有折光指数，极少有两种液体含有相同折光指数，所以化合物都可用这种检测器检出。当流动相恒定地流过检测池时，其折光指数不变，仪器得到一条基本平直基线。当有组分峰流过去时检测池时，折光指数发生改变，统计仪记下这信号，即为色谱图。其缺点：灵敏度较少低，检出下限为10-7g/mL；易受温度和流速影响；不能进行梯度洗脱。

高效液相色谱分离技术B第13页

4.蒸发光散射检测器（evaporativelightscatteringdetector,ELSD）蒸发光散射检测器是20世纪90年代出现最新型通用检测器，可用于挥发性低于流动相任何样品组分检测，但对于有紫外吸收样品组分检测灵敏度较低，因而主要用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体类等几十类化合物。高效液相色谱分离技术B第14页

这种检测器是示差折光检测器理想替换品。其检测原理是：将流出众谱柱流动相及组分先引入已通气体蒸发室，加热，使流动相蒸发而除去；样品组分在蒸发室内形成气溶胶，而后进入检测室；用强光或激光照射气溶胶产生光散射，测定散射光强而取得组分浓度信号。高效液相色谱分离技术B第15页

5.化学发光检测器化学发光检测器是近年来发展起来高选择性及高灵敏度新型检测器，其设备简单，本身发光，不需光源，价格廉价，是一个有发展前途检测器，可用于药品代谢分析及免疫研究。其检测原理是：将流出众谱柱组分与发光试剂混合，产生化学发光反应，光辐射可用光导纤维传输，由光电倍增管检测，从而取得信号。高效液相色谱分离技术B第16页几个主要检测器基本特征高效液相色谱分离技术B第17页§7-3反相色谱（RPC）HPLC发展早期，其填料惯用固体吸附剂作固定相，这种色谱叫液—固吸附色谱；另一类填料常采取在固相载体上涂上一层固定液作为固定相（其代替物是键合填料），这种色谱是液—液分配色谱。键合填料即将配基直接键合在固体基质上作为固定相。反相色谱填料是其中之一。所谓反相色谱或正相色谱，其叫法是依据填料和流动相相对极性来区分。流动相极性弱于固定相液相色谱法叫正相色谱。如以硅胶为吸附剂，以有机溶剂为流动相吸附色谱中，因为硅胶（SiO2·XH2O）表面大量硅羟基存在，其极性强于流动相，故是正相色谱。流动相极性强于固定相液相色谱叫反相色谱。如以有机溶剂加水作流动相，以烷基、苯基键合相填料作固定相色谱就是反相色谱。反相高效液相色谱是应用最广一类高效液相色谱法。高效液相色谱分离技术B第18页一、固定相由固体刚性基质和键合在基质上配基组成。（1）基质（担体）：硅胶。其表面有大量深浅和孔径不一样孔隙，这么就使硅胶表面积大大扩大了。普通惯用孔径在6-12nm。（2）配基：配基都是不一样类型有机基团。采取直接键合方法固定到基质上。其方法：经过有机氯硅烷与硅胶表面硅羟基反应键合上去。即：高效液相色谱分离技术B第19页①非极性键合相

这类键合相表面基团为非极性烃基，如十八烷基键合相（十八烷基键合硅胶，octadecylsilane,ODS,C18）以及辛烷基（C8）、乙基、甲基和苯基键合相。其中苯基可诱导极化，所以也可视为弱极性键合相。

国内产品有YWG-C18和YWG-C8

和YWG-C6H5，国外代表性产品有：NucleosilC18，SpherisorbODS-2，Zorbox-C8等。HPLC中80%分离工作所用固定相都是ODS，流动相为不一样百分比水和甲醇，所以是反相技术。为提升固定相极性，可缩短烷基链长度，选取YWG-C8为固定相。YWG-C6H5为反相，用于分离芳香族化合物。

高效液相色谱分离技术B第20页

②中等极性键合相常见中等极性键合相有醚基键合相。这种键合相既可作正相又可作反相色谱固定相，视流动相极性而定。国内产品有YWG-ROR′，进口产品有Permaphase-ETH。这类键合对应用较少。

③极性键合相惯用极性键合相有氨基、氰基键合相用。这种键合相既可作正相又可作反相色谱固定相。国内产品有YWG-NH2、YWG-CN和YQG-NH2、YQG-CN；进口产品有NucleosilNH2或CN，LichrosorbNH2或Zorbox-CN。高效液相色谱分离技术B第21页二、流动相极性溶剂。惯用：有机溶剂(如甲醇、异丙醇、乙腈、二氧六环)＋水在这些溶剂中，水洗脱能力最弱。所以在反相色谱梯度洗脱中，A液以水为主，B液以有机溶剂为主。洗脱过程中逐步向流动相中添加有机溶剂，就到达了逐步增加洗脱强度目标。相反，假如向水中添加无机盐，则是减弱了洗脱剂强度，增强了样品组分在柱子上保留。RPC中应用最广流动相是:水—甲醇、水—乙腈注：甲醇和乙腈普通用色谱纯，而水应该是二次蒸馏水或蒸馏水经脱离子处理高效液相色谱分离技术B第22页三、保留机理（两种模型）（1）疏溶剂理论一个分子有亲水部分和疏水部分两类基团。亲水基团如—OH、-NH2、-COOH和-SH等极性官能团，疏水基团如苯环-CH3、-CH2-等基团。当一个非极性溶质或分子中非极性部分放入一个极性溶剂中时，这个非极性部分（即疏水性基团）与极性溶剂之间相互产生了一个斥力，分子中非极性部分总是趋向于与其它非极性部分聚集，以降低与极性溶剂接触面积，减小表面张力，使体系能量最低。这种溶质分子非极性表面区域在水中倾向于减小与极性溶剂接触面积效应叫做疏水作用或疏溶剂效应。高效液相色谱分离技术B第23页在RPC中，有机水溶液作流动相，溶质在非极性配基（烷基、苯基等）上保留，就是因为溶质中疏水基团倾向于与配基结合而造成。溶质中疏水性越强，与配基结合地越牢。所以有机同系物中伴随烷基链长增加，其保留值也增大。高效液相色谱分离技术B第24页样品分子和固定相上配基在流动相中都是溶剂化。当样品分子保留在柱子上时，样品分子与配基接触，二者之间结合面上溶剂化分子被“挤”走，进入流动相。被“挤”走溶剂分子有Z个。当样品分子被洗脱下来时，样品分子进入了流动相，样品分子与配基接触面重新被溶剂化，重新溶剂化所需溶剂分子是Z个，与保留时被“挤”走溶剂分子相等。（2）计量置换模型高效液相色谱分离技术B第25页计量置换模型数学表示式为：

lgK′=lgI-Zlg[D0]式中K′为容量因子；lgI为常数；Z为配基础与样品分子接触面在样品分子被保留时释放出来溶剂分子数；[D0]为洗脱剂中强溶剂浓度。在反相色谱中，样品与配基靠疏水作用结合。而洗脱液如水—甲醇体系中，醇比水更轻易使疏水性配基和样品溶剂化，在保留与置换中，醇在起作用，所以上式中[D0]为甲醇浓度。当柱子、溶剂、样品分子、温度固定后，Z为常数。以lgK′对lg[D0]作图可得一条直线。经过此表示式，使洗脱剂浓度与保留值建立了直线关系式。高效液相色谱分离技术B第26页四、反相色谱色谱体系选择当样品组分不是离子型化合物，优先选取反相色谱来进行分离。RPC体系选择次序：首先选柱子再选流动相，然后再考虑检测器、温度、洗脱方式、进样量等条件。（1）柱子：常选ODS柱（其配基为十八烷基）。该柱子优点：疏水性强，分离性能好，样品分子在柱内保留值大，应用面广。另外：①对于生物蛋白质（大分子量），普通用C4-C8填料柱；②含-CN或-NO2化合物，普通用苯基型填料柱；③多糖、类固醇这么强极性物质能够使用氨基柱、氰基柱。氨基柱配基为-RNH2，它能够在一定条件下，分别当正相柱、反相柱和离子交换柱使用，是一个特殊填料。

高效液相色谱分离技术B第27页（2）流动相首选：甲醇＋水体系若纯甲醇洗脱能力还不够强，则要添加或换用其它洗脱能更强溶剂。惯用溶剂洗脱能力强弱次序为：水乙腈甲醇二氧六环四氢呋喃异丙醇（3）检测条件若物质有发色团有紫外吸收，用紫外检测器。检测波长最惯用254nm，因为此波长下灯源光度最强。若样品组分无紫外吸收，则可选示差折光检测器。（4）柱温

rt总之，选择色谱条件是依据“样品组分”确定。高效液相色谱分离技术B第28页§7-4离子交换色谱法（IEC）

一、离子交换

1.离子交换色谱概念

利用离子交换剂作为固定相，以适宜溶剂作为流动相，使被分离混合物中各组分按其离子交换亲和力不一样而得到分离。

2.离子交换剂（离子交换树脂）离子交换剂是不溶性高分子化合物，其分子中含有解离性离子交换基团，当一定量水溶液经过交换柱时，能与存在于溶液中阳离子或阴离子物质起可逆交换作用。高效液相色谱分离技术B第29页

3.离子交换剂分类

阳离子交换树脂强酸型弱酸型—PO3H—COOH,—OCH2COOH—C6H4OH—SO3H阴离子交换树脂强碱型

弱碱型—N(CH3)3X

—NR2—NHR—NH2高效液相色谱分离技术B第30页

4.离子交换树脂交换原理

(1)强酸型阳离子交换树脂（SCX）电离程度不受溶液pH改变影响，在pH1~14范围内均能进行离子交换反应。高效液相色谱分离技术B第31页

①聚苯乙烯强酸型树脂：

普通为黑褐色，是最惯用强酸型阳离子交换树脂，以苯乙烯为单位，向上下左右延伸网状结构是它母体。母体上连结许多—SO3H。高效液相色谱分离技术B第32页常见型号：国产树脂中强酸1×7（上海树脂厂#732）、强酸型#1（南开大学树脂厂）和国外产品Dowex50、AmberliteIR-120、ZeoKarb225、Zerolit225、wofatitK、PermutitQ、IiwatitS100都属于这种。特征：这种树脂很稳定，使用得当，经过几百次交换，交换当量也改变不大。对各种试剂也较稳定，如较长时间浸在5%氢氧化钠、0.1%高锰酸钾、过氧化氢水溶液、0.1M硝酸中也不会改变性能。不溶于水和普通有机溶剂，耐热性也比其它树脂好，必要时能够在沸水浴上l00℃左右处理。

高效液相色谱分离技术B第33页②酚磺酸型树脂是在聚乙烯树脂出现以前就被广泛应用强酸性树脂，能够用对羟基苯磺酸和甲醛缩合而成。国产树脂中华东强酸阳42和国外产品AmberliteIR-100、IR-105、Dowex30、Zerolit215、ZeoKarb215、wofatitK、wofatitKS都属于这种。这种树脂普通为黑色，交换量比苯乙烯树脂小，遇碱或氧化剂时，性能易改变。在不一样pH碱性溶液中离子交换作用不一样，因为有以上缺点，故应用范围较小。

高效液相色谱分离技术B第34页

(2)强碱型阴离子交换树脂

(SAX)

电离程度不受溶液pH改变影响，在pH1~14范围内均能进行离子交换反应。高效液相色谱分离技术B第35页

树脂母体和苯乙烯强酸性树脂相同，区分在于母体上连结有季铵。国产树脂中强碱性201（南开大学树脂厂）、强碱性201×7（上海树脂厂717）和国外产品NalciteSAR、Dowex1、Dowex2、AmberliteIRA-400、AmbertitelRA-410、AmbertiteXE-98、PermutitSⅠ、PermutitSⅡ、LewatitMⅡ、ZerolitFF等都届于这种。这种强碱性树脂对酸、碱和有机溶剂亦较稳定，但在浓硝酸中不稳定。游离型（OH型）比盐型（Cl型）耐热性差，超出40-45℃就不稳定，所以普通商品都是Cl型。高效液相色谱分离技术B第36页

(3)弱酸型阳离子交换树脂

(WCX)—COOH电离程度受溶液pH改变影响很大，其交换能力随溶液pH下降而降低，在酸性溶液中几乎不发生交换反应。所以羧酸阳离子树脂交换反应必须在pH＞7溶液中才能正常进行，对酸性更弱酚羟基树脂，则应在pH＞9溶液中才能进行反应。高效液相色谱分离技术B第37页

含有-COOH

树脂，母体有芳香族和脂肪族两种。脂肪族类型中用甲基丙烯酸和二乙烯基苯聚合较多。芳香族类型用二羟基苯酸和甲醛聚合较多。国产树脂中弱酸l0l×l28（上海树脂厂#724）、弱酸性#10l（南开大学树脂厂）和国外产品AmbertiteIRC-50、WofatitC、Zerolit226都属于弱酸性阳离子交换树脂。高效液相色谱分离技术B第38页

(4)弱碱型阴离子交换树脂

(WAX)

基团电离能力弱，和弱酸型阳离子树脂一样，电离程度受溶液pH改变影响很大，其交换能力随溶液pH降低而增大，在碱性溶液中几乎不发生交换反应。所以交换反应必须在pH＜7溶液中才能正常进行。高效液相色谱分离技术B第39页

含有-NH2，＝NH，等基团阴离子交换树脂。国产树脂中弱碱330（上海树脂厂#701）、弱碱311×2（上海树脂厂#704）、华东弱碱阴32l、弱碱性#301（南开大学树脂厂）、弱碱性330（同1）和国外产品AmbertiteIR4B、WofatitM、wofatitN、LewatitM、Dowex3、FermutitW等都属于此种。其基本结构以下。含有-NH-基团碱性较强，含有—NH2或＝NH碱性较弱。这种树脂有黄、橙、黑等颜色。高效液相色谱分离技术B第40页强性和弱性离子交换树脂区分：交换速度不一样：强酸和强碱性树脂交换快转型时体积改变不一样：强酸和强碱性树脂由游离型转为盐型时，体积改变小，水洗轻易到达中性；弱酸和弱碱性树脂由游离型转为盐型时，体积显著改变，水洗不轻易到达中性；不过强酸性树脂由盐型转为游离型时需要大量酸处理。高效液相色谱分离技术B第41页二、填料1、配基和交换基团离子交换色谱法，在早期都采取高分子聚合物，如苯乙烯－二乙烯苯为基体离子交换树脂作固定相。因这种固定相含有膨胀性、不耐压、表面微孔型结构影响传质速率，所以在高效液相离子交换色谱法中已被离子型键合相所代替。高效液相色谱分离技术B第42页

最常见离子型键合相是以薄壳型或全多孔微粒硅胶为载体，表面再经化学键合成各种离子交换基团。阴离子键合相惯用强酸性磺酸型（－SO3H），而阳离子键合相惯用强碱性季铵盐型（－N+R3Cl-）。国产离子化学键合相有YWG-SO3H、YWG-N+R3Cl-和YSG-SO3H、YSG-N+R3Cl-。高效液相色谱分离技术B第43页2、填料交换容量和吸附容量填料柱容量：可用交换容量或吸附容量表示。（1）离子交换容量用单位量填料含有可交换基团数量表示。其单位：微摩尔/克（μmol/g）或微摩尔/毫升（μmol/mL）。（2）柱子吸附容量在特定色谱条件（动态或静态）下，填料吸附某样品组分最大量。用mg/g、g/L或μmol/g、μmol/mL表示。吸附量是可变：其值随测定方法、流动相成份和样品改变而改变。高效液相色谱分离技术B第44页（3）交换容量与pH值关系交换容量受溶液pH值影响很大，尤其是弱离子交换色谱填料。因为它们交换基团需要在一定pH值条件下才能完全电离，故受pH值影响更大。见图7-3。图7-3PH值对交换容量影响高效液相色谱分离技术B第45页由图可知：①强阳离子交换色谱填料pH＞1时才有显著交换容量，pH大时，交换容量几乎不再改变；而弱阳离子交换色谱填料pH＞6时才有显著交换容量，且PH越大，交换容量越大。②强阴离子交换色谱填料，pH＜10时才能使用；而弱阴离子交换色谱填料，pH＜8时才有显著交换容量，且PH越小，交换容量越大。由上可知，强阳和强阴离子交换色谱填料，含有比弱阳（阴）离子交换色谱填料更大pH值使用范围，能适应较多化合物在不一样pH条件下进行分离或使用pH梯度进行洗脱，所以应用较广。不过对于一些保留太强样品，选取弱离子交换色谱填料更方便些。高效液相色谱分离技术B第46页三、IEC保留机理（起主要决定作用：静电力）将交换基团和样品分子近似地看作为两个点电荷，它们之间作用力F为：F=q1·q2/εr2式中q1、q2分别为两个点电荷电量；ε为介质介电常数；r为两点电荷之间距离。在IEC中，交换基团大小及电荷在固定pH值条件下是不发生改变，所以样品组分与交换基团作用力F随样品组分带电情况及作用距离不一样而改变。正是这种各组分与交换基团之间有不一样作用力而使它们得以分离。高效液相色谱分离技术B第47页分析保留值大小在离子交换色谱中，假如流动相pH值改变，就会改变样品分子电离平衡，从而改变样品组分带电情况，使保留值发生改变。在阳IEC中，样品组分应该带有正电荷，多是因为样品分子中含有各种氨基形成正电荷。离解平衡：R-NHR′+H+

＝RN+H2R′而在阴IEC中，样品分子应该带负电荷，多是因为羧酸根或其它酸根离解形成负离子。离解平衡：RCOOH＝RCOO-+H+可见，在阳IEC中，当pH值减小时(即H+浓度增大)，促使样品组分形成更多正电荷。这会使样品组分对阳离子交换剂表面带负电交换基团亲协力增加，使保留值增加。在阴IEC中，当pH值增大时(H+浓度减小)，促使样品组分上酸根离解，形成更多负电荷，因而使样品组分对阴离子交换剂表面带正电交换基团亲协力增加，使保留值增加。高效液相色谱分离技术B第48页问题：当样品为蛋白质时，分析蛋白质在阴、阳离子交换色谱中，PH值改变对保留值影响。注意：在选择弱阴、阳离子交换填料时，既要考虑填料在一定PH值下离解度（PH越小：WAX离解度越大，WCX离解度越小），又要考虑在一定PH值下流动相保留值（PH越小：阳IEC中保留越小，阴IEC中，保留越大）。这两个是矛盾。∴在选择条件时要注意，尤其是流动相PH确实定。对于两性蛋白质无上面注意事项，阳离子不行就选阴离子交换填料。高效液相色谱分离技术B第49页图7-4蛋白质保留值(●)与其表面纯电荷(▲)及流动相PH关系示意图高效液相色谱分离技术B第50页四、离子交换色谱条件选择▲样品在溶液中能形成离子，则首选离子交换色谱。1、柱子选择△离子交换色谱柱子选择比其它色谱法更复杂。因为交换基团有四种类型。样品离解也有不一样方式，所以要依据样品和试验室条件选择适用柱子。选择柱子时可遵照以下标准：（1）依据试验室条件和试验要求△定性、定量还是分离。△分析型柱子：内径4－8mm,长度5－25cm,流速0.5-3ml/min。(定性、定量用硬基质填料)△分离能够用高分子球基质。高效液相色谱分离技术B第51页(2)按照样品性质含有各种氨基（-RNH2，-NHR，-NR2）组分，可在溶液中接收质子，形成正离子，所以要用阳离子交换色谱柱子分离。含有各种羧基化合物，能够在溶液中放出质子，形成负离子，所以要用阴离子交换色谱填料。等电点PI值大蛋白质，易形成阳离子，可优先选取阳离子交换色谱；等电点PI值小蛋白质，易形成负离子，可优先选取阴离子交换色谱。高效液相色谱分离技术B第52页普通小分子，选普通填料。而蛋白质等分子量很大化合物，选取大孔径填料(惯用内孔径在25-50nm)。(3)填料孔径选择2、流动相选择盐＋水组成溶液。（盐溶于水以后形成离子作为样品组分顶替离子）洗脱强度：由顶替离子浓度定。浓度越大，洗脱能力越强。对样品及仪器无损害。例：NaCl作为流动相时，Cl－对不锈钢有腐蚀性，要控制使用。高效液相色谱分离技术B第53页对样品溶解度无影响。所以惯用含有缓冲作用盐梯度洗脱：盐浓度由弱→强。改变洗脱强度能够浓度梯度或PH梯度。3、检测条件选择参见反相色谱部分。4、其它条件选择操作温度普通选取室温，高效液相色谱分离技术B第54页五、影响离子交换相关原因1、溶液酸碱度交换溶液中氢离子浓度显著增高时，会抑制阳离子交换基团电离和目标离子交换反应。通常强酸性交换剂交换液pH应大于2。弱酸性交换剂交换液pH应在6以上。一样在阴离子交换剂中，强碱性交换剂交换液pH应在12以下，弱碱性应在7以下。高效液相色谱分离技术B第55页2、目标离子交换性能：主要取决于母体化合物解离、目标离子电荷、半径及酸碱性强弱。解离常数大，酸碱性强者置换轻易，但洗脱相对来说较难。离解离子价数愈高，电荷愈大，则它引力愈强，愈易交换在交换树脂上。碱金属、碱土金属及稀土元素还与它们原子序数相关，碱金属原子序数大，则交换吸附就强，稀土元素原子序数小，其交换吸附强。高效液相色谱分离技术B第56页3、被交换物质在溶液中浓度离子交换操作通常是在水溶液或含有水极性溶剂中进行，这么有利于离解与交换。浓度越低，离子交换剂选择性大。浓度过高，将降低物质解离，有时会影响吸附次序及选择性。另外，还会引发树脂表面及内部交联网孔收缩，影响离子进入网孔。所以普通试验操作时所用溶液浓度应该略稀，有利于提取分离。高效液相色谱分离技术B第57页

4、温度影响温度改变对稀溶液离子交换性能影响不大，但在0.1mol/L以上浓度时，温度升高对水合倾向大离子轻易交换吸附。同时离子活性系数增大，对弱酸、弱碱交换剂来说其交换率有较大影响。普通温度增高，离子交换速度加紧，在洗脱时亦可提升洗脱能力。但对不耐热交换剂应注意提升温度条件，防止引发交换剂破坏。

5、溶剂影响通常在水中进行交换，亦可采取含水溶剂，但在极性小溶剂中难以进行或不进行交换，同时还造成离子交换选择性降低或消失。高效液相色谱分离技术B第58页阳离子交换树脂临界温度阴离子交换树脂临界温度华东强酸阳42华东强酸阳42Na型95℃H型40℃华东弱碱阴32150℃AmberliteIR-120

Na型120℃H型100℃AmberliteIRA-400AmberliteIRA-400Cl型90℃OH型49℃AmberliteIR-120Na型120℃AmberliteIRA-410andAmberliteIRA-411Cl型82℃OH型40℃AmberliteIRC-50Na型120℃Dowex50Na型120℃H型150℃Dowex1andDowex2Cl型100℃OH型50℃Dowex50Na型95℃表1离子交换树脂干燥临界温度高效液相色谱分离技术B第59页六、树脂预处理及再生（1）树脂选择与准备：选择树脂类型时，首先必须了解其性能如交换量大小、颗粒大小、耐热性、酸碱度，然后进行预处理。普通树脂，粒子都较大，大部分是35—20目（0.49—0.83毫米），亦有50目，可作为植物成份粗提及初步划分，但不适用子离子交换层析。离子交换层析普通需要较细树脂，所以需要把它干燥，粉碎后，过筛或利用浮选法进行选择。

高效液相色谱分离技术B第60页（2）预处理除去可溶性小分子有机物和铁、钙等杂质。首先把新树脂浸在蒸馏水中1～2d，使它膨润后，装在层析管中，按下法处理：①强酸性阳离子交换树脂预处理：新树脂普通是Na型。先用树脂体积20倍2mol/L盐酸以1ml/(cm2·min)左右速度进行交换，使它变为H型后用水洗到流出液呈中性，然后用树脂体积l0倍量1mol/L氢氧化钠（或食盐）进行交换，使它变为Na型。再用水洗到流出液不含Na为止（焰色反应无黄色）。再重复一次盐酸→氢氧化钠（或食盐）处理。最终用树脂体积10倍量lmol/L盐酸进行交换，使它变为H型，然后用蒸馏水洗到流出液呈中性为止。高效液相色谱分离技术B第61页

②强碱性阴离子交换树脂预处理：

新树脂普通呈Cl型，依次用树脂体积20倍1mol/L氢氧化钠溶液（使它变为OH型）洗涤→树脂体积10倍量水洗涤→用树脂体积lO倍量lmol/L盐酸溶液洗涤（使它变为Cl型）→用蒸馏水洗至流出液近中性为止。再重复一次氢氧化钠→盐酸处理。最终用树脂体积10倍量1mol/L氢氧化钠溶液进行交换，使它变为OH型。OH型树脂轻易吸收空气中二氧化碳，所以保留时要注意，临用时把C1型树脂变为OH型很好。高效液相色谱分离技术B第62页③弱酸性阳离子交换树脂预处理：新树脂普通是Na型。依次用树脂体积l0倍量lmol/L盐酸溶液（使它变为H型）→用水洗到流出液呈中性为止→用树脂体积10倍量lmol/L氢氧化钠溶液（使它变为Na型，此时体积膨胀）→用树脂体积10倍量水洗涤至中性。假如流出液依然呈弱碱性。再重复一次盐酸→氢氧化钠处理。最终用树脂体积10倍量1mol/L盐酸溶液使它变为H型。用水洗到中性。高效液相色谱分离技术B第63页④弱碱性阴离子交换树脂预处理：新树脂普通是Cl型。预处理与强碱性阴离子交换树脂基本相同。变为Cl型后，用水洗涤时因为水解关系不轻易洗到中性。普通用树脂体积l0倍量水洗涤就能够。除盐酸外有时也用硫酸，也可用氯化铵代替氯化钠。交换终点能够用以下方法来判定。请参考下表。高效液相色谱分离技术B第64页交换前试剂交换后交换终点判断方法NaRHRNH4RHRRClROHR2SO4HClNH4ClNaClNaOHNaOHH2SO4NaClHRNH4RNaRNaRROHR2SO4RClNa火焰反应甲基红等酸性指示剂奈氏试剂检测铵离子酚酞硝酸酸化，硝酸银检测氯离子甲基红等酸性指示剂氯化钡检测硫酸根离子表2树脂预处理终点交换点判断高效液相色谱分离技术B第65页（3）再生：

用过树脂，如还要交换同一个样品，把盐型变为游离型即可。如要交换其它样品，要用预处理方法再生。不用时加水，保留在广口瓶中。若遇耐热性离子交换树脂，则可在加温条件下处理，市售商品往往是湿，若碰到干燥状态树脂时，不要马上加水，这么易引发龟裂，影响物理性能。可先加饱和氯化钠湿润后再按前述方法处理或再生。高效液相色谱分离技术B第66页七、试验技术关于树脂量、层析管粗细、展开溶剂量和流速关系，能够参考下表。

柱子直径cm柱子高度cm树脂量干燥品/g粒子目数洗脱剂量/ml0.15MNH3流速ml/min7.65.13.82.51.71.20.86141302013.69.66.4110033513541124.21.360～8060～8080～10080～10080～10080～10080～1203000095003900120034012070

40201041.50.5表3酚磺酸型阳离子交换柱操作条件高效液相色谱分离技术B第67页表4苯乙烯强酸型阳离子交换柱操作条件

柱子直径cm柱子高度cm树脂量干燥品/g粒子目数洗脱剂量/ml0.15MNH3流速ml/min7.65.13.82.51.71.20.846312315107.24.88302551063093.21.060～8060～8060～8060～8060～8080～100100～12058000175007300210062022070

502512620.6高效液相色谱分离技术B第68页表5强碱性阴离子交换柱操作条件

柱子直径cm柱子高度cm树脂量干燥品/g粒子目数洗脱剂量/ml0.15MNH3流速ml/min3.82.51.71.20.82315107.24.8100288.33.00.9100～200100～200250～500250～500250～50037001000310111337.53.01.50.750.33高效液相色谱分离技术B第69页

装柱：把树脂放在烧杯中，加水充分搅拌，将气泡全部赶掉。放置几分钟使大部分树脂沉降，倾去上层浮粒和微粒，重复上述操作到上层液透明为止。粒度小树脂，搅拌后要放置稍久，因为较难沉降。假如急于倒水，往往损失较大。将准备好树脂，加少许水搅拌后一次性倒入保持垂直层析管中，使树脂沉下，让水流出。注意不要让气泡进入树脂中。

高效液相色谱分离技术B第70页加样：加样时要注意不要把树脂冲散。放一块玻璃浮球或一层玻璃丝即可。样品量与树脂量百分比：每一个树脂都有一定交换容量（1克干燥树脂理论上能交换样品毫克当量数），如国产弱碱330树脂交换当量为9（毫克当量／克），强碱为3.5，强酸1×7为4.5等。强酸l×74.5毫克当量／克，就是说这种树脂l克能够交换丙氨酸89.09×4.5毫克（注：丙氨酸分子量为89.09）。假如用阳离子交换树脂，样品能够加到全交换当量l/2。用阴离子交换树脂，样品能够加到全交换当量l/4～1/3。样品和树脂量关系：要注意柱子上吸收带长度不超出层析柱长度1/10。

高效液相色谱分离技术B第71页八、离子交换法应用

离子交换法可用于分离氨基酸、肽类、生物碱、有机酸、酚类等天然化合物。①惯用于有效部位分离：普通可用水提取液经过强酸性（磺酸型）树脂，再经过强碱性（季铵型）树脂，分别洗脱，分成酸性、中性、碱性部位。

②生物碱分离：可用强酸性树脂从中草药水浸液或稀酒精提取液或酒精提取部分水溶部位直接交换生物碱，用氨水或氨性酒精洗脱，所得部位，再用其它分离伎俩分离。此法因为树脂可重复使用，尤其对水溶性生物碱提取分离，较经典方法有利。③用于有机酸及酚性物质提取分离：④氨基酸提取分离：普通利用不一样pH缓冲液梯度洗涤到达分离目标。高效液相色谱分离技术B第72页§7-5排阻色谱法（SEC）凝胶色谱法是上世纪60年代发展起来一个分离分析技术，有各种名称如凝胶色谱分子筛色谱尺寸排阻色谱等使用固定相是凝胶。凝胶是含有许多孔隙网状结构固体，有分子筛性质。高效液相色谱分离技术B第73页

一、基本原理当被分离物质分子大小不一样时，能够进入到凝胶内部能力也不一样。凝胶中孔隙大小与分子大小有相仿数量级。当混合物经过凝胶时，比孔隙小分子能够自由进入凝胶内部，而比孔隙大分子就不能进入，所以在移动速度方面就出现差异，从而使不一样相对分子质量各组分得到分离。高效液相色谱分离技术B第74页图7-5凝胶色谱法原理高效液相色谱分离技术B第75页其分离原理可用下式表示：VR=V0+kViVR：保留体积（洗脱体积）V0：柱床内存在于凝胶外面水相体积—外水体积Vi：凝胶颗粒内部所含水相体积—内水体积k：分配系数高效液相色谱分离技术B第76页

被分离物质分子很大，被完全排阻于凝胶颗粒之外：VR=V0，k=0；被分离物质分子很小，能完全自由进入凝胶颗粒内部：VR=V0+Vi

，k=1

中等大小分子，只能到达部分凝胶颗粒内部：V0＜VR

＜V0+Vi

，0＜k＜1二、凝胶种类含有分子筛效应凝胶，主要有葡聚糖（商品名为Sephadex）、琼脂糖（商品名为Sepharose）聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel）及含有一定网眼玻璃珠。还有这些凝胶衍生物。最惯用是葡聚糖凝胶。高效液相色谱分离技术B第77页1.亲水性凝胶

(1)葡聚糖凝胶蔗糖发酵→葡聚糖（

-1,6-苷键）→交联剂环氧氯丙烷与葡聚糖发生交联反应→生成多孔性网状结构葡聚糖凝胶(其结构见下页)

（商品名：Sephadex）。环氧丙烷是引入甘油基将各个多聚葡萄糖单位交联起来，凝胶网眼大小由多聚葡萄糖分子量和制备时环氧氯丙烷用量决定。高效液相色谱分离技术B第78页高效液相色谱分离技术B第79页葡聚糖特征与类型：亲水性较强，在水和电解质溶液中膨胀成为柔软而富于弹性胶体。其吸水能力与葡聚糖凝胶交联度有亲密关系。交联度大，孔径小，吸水少，膨胀程度小；交联度小，孔径大，吸水多，膨胀程度大。所以，葡聚糖孔径大小能够其吸水量大小来表示，常以G-10至G-200号码标识。G后面数字是其吸水量（mL·g-1干胶）乘以10所得值。如G-25即表示吸水量为2.5。市售有G-10、G-12、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150、G-200等型号。G-75以上凝胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶。G-75以下称为硬胶。高效液相色谱分离技术B第80页表6交联葡聚糖性质高效液相色谱分离技术B第81页凝胶层析是一个物理分离法。葡聚糖基本上不带电荷、呈惰性，不与被分离物质发生反应，所以分离效果很好。然而因为是葡萄糖聚合物，因而仍有少许活性羟基，能吸附少许蛋白质等被分离物质。为了克服这个缺点，普通使用含有离子强度达0.08NaCl等中性盐作洗脱液。（2）其它

聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel）、琼脂糖凝胶（Sepharose）等，适合于分离分子较大和不溶于水化合物。高效液相色谱分离技术B第82页2.疏水性凝胶在交联葡聚糖凝胶分子上引入一个基团，增大其亲脂性，便得到疏水性凝胶。比如，在SephadexG-25分子上引入羟丙基（ROH→ROCH2CH2CH2OH），得到疏水性凝胶：葡聚糖凝胶LH-20，现有亲脂性又有亲水性，可用于分离酯类化合物、类固醇等。高效液相色谱分离技术B第83页

三、操作方法

1.凝胶选择

普通依据凝胶分离范围进行选择。假如分离相对分子质量相差悬殊组分：比如脱去蛋白质溶液中盐类，可选择型号较小凝胶（G-10，G-15，G-25），颗粒为100~150目。分离相对分子质量比较靠近组分，凝胶颗粒要细（200目）且大小要近乎均一。

2.装柱凝胶→用水或缓冲液浸泡使其充胀→用流动相浸泡→装柱高效液相色谱分离技术B第84页（1）凝胶溶胀（水化）商品葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶均为干燥颗粒。使用前必须水化溶胀。商品琼脂糖凝胶呈悬浮胶体可直接使用，玻璃珠无需溶胀。凝胶溶胀有两种方法：室温溶胀沸水溶胀注1：各种葡聚糖凝胶在两种溶胀方法中所需时间不一样。必须浸泡足够时间方便凝胶充分溶胀。两种方法中，沸水溶胀不但节约时间，还能够杀灭凝胶中污染细菌并排除气体。高效液相色谱分离技术B第85页注2：凝胶溶胀后，需用蒸馏水洗涤几次，每次应将沉淀迟缓细小颗粒随水倾去，以免在装柱后产生阻塞现象，降低流速，洗涤后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。柱子大小和凝胶用量确实定：称取1g所需型号葡聚糖干胶，放在5mL量筒中，用室温溶胀方法充分溶胀，观察溶胀后凝胶体积。然后在层析柱中加水到所需柱床高度，将水倒出，量取体积。依据1g干胶溶胀后体积和所需柱床体积，即可推算出干胶需要量。高效液相色谱分离技术B第86页（2）装柱子装柱操作过程以下：将层析柱垂直固定在铁架上，打开柱下口开关。将溶胀好凝胶放在烧杯中，使凝胶表面水层与凝胶体积相等。用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内。此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成凝胶柱。当抵达所需凝胶高度时，马上关闭下口，使凝胶完全沉降。凝胶柱普通离柱顶3—5cm，以覆盖一层溶液。高效液相色谱分离技术B第87页柱子、凝胶类型、用量和上样量关系：凝胶层析中，在把小分子物质（MW<1500），如无机盐或其它物质与大分子物质（MW>20000）分离时，层析柱体积普通约为样品4—10倍，高度与直径百分比为5∶1至15∶1之间。这类柱也称为“脱盐柱”。惯用网眼很小凝胶如G-25。用以将生物大分子物质彼此分开分级层析柱，体积应为样品体积25—100倍。柱长度与直径百分比为20∶1—100∶1。高效液相色谱分离技术B第88页装柱操作注意事项：灌注凝胶时要求将均匀凝胶一直加到所需柱床高度，不能时断时续，不然将出现分层或“纹路”等毛病。若出现这些现象，能够用玻璃棒将已经形成柱床逐步搅起，直至出毛病地方，再继续加入搅匀凝胶悬液。若在罐好凝胶后才发觉“纹路”、分层等现象时，要重新装柱，以免影响层析效果。在做大型凝胶柱时，灌注凝胶是否均匀往往从表面上看不出来。所以使用前应用一些带色大分子物质如细胞色素C、血红蛋白或专用蓝色葡聚糖—2000（Bluedextran-2000）经过凝胶柱，以检验形成带色斑带是否整齐，若斑带歪斜，应该重新装柱，直至到达要求。高效液相色谱分离技术B第89页注1：刚从冰箱中取出凝胶液，不能马上用来灌柱，应平衡至室温后再用，不然装好凝胶柱会产生大量气泡影响层析。注2：在整个灌注凝胶过程及使用中，凝胶柱面上一定要覆盖着一层溶液，以免进入空气。若进空气，在加入溶液时，凝胶柱中易形成气泡。注3：装好凝胶柱，使用时应该用相当于柱体积两倍或更多洗脱液流过洗脱柱，以压实凝胶。高效液相色谱分离技术B第90页3、上样上样时，应该注意上样量多少，样品粘稠度及离子强度。这三个原因会影响到以后层析效果。普通来说“脱盐”层析时，上样体积可为柱体积10%—25%；生物大分子分级分离，约为柱体积1%—5%。样品粘稠度普通不宜大于洗脱液粘稠度2倍以上，不然洗脱峰会变宽和歪斜。离子强度要到达0.08，以免产生机械性吸附。高效液相色谱分离技术B第91页上样操作：打开层析柱下口开关，放出凝胶柱面上多出溶液，或用橡皮头吸管吸收，使液面与凝胶表面相平齐。将样品加在凝胶表面，打开下口开关，控制流速，使样品慢慢渗透凝胶内。当慢慢渗透凝胶样品溶液面与凝胶柱面相平齐时，关闭下口，完成上样。然后在凝胶柱面上加一层（3—5cm）洗脱液，接上洗脱瓶准备洗脱。注1：切忌液面低于凝胶表面注2：勿将凝胶柱面冲起形成凹面，也不能沿管壁流下，以免样品沿柱壁与凝胶间隙漏下。高效液相色谱分离技术B第92页4、洗脱（等浓度洗脱）

洗脱过程中保持恒定流速是取得良好分离效果主要条件。因为凝胶层析分离作用主要取决于分子扩散进入凝胶机会，流速过快有些分子来不及在分子筛中分配而流出；过慢时已分离分子会因扩散而混合。因而要保持适当恒定流速。洗脱液流速取决于它静水压（指洗脱液液面高出层析柱出口液面高度）（或接触空气两个液面间高差）。静水压越大，流速就越快。试验室通惯用马氏瓶来控制流速，注意不要让瓶中液面低于玻璃管下口。高效液相色谱分离技术B第93页图7－6恒压洗脱装置高效液相色谱分离技术B第94页注1：对于G-75以上软胶来说，每种凝胶都有自己所能承受最大静水压，假如静水压超出凝胶承受能力，凝胶将发生变形而被压紧，流速也会随之降低。注2：用试管分步搜集色谱柱流出液，分别测定各管光密度，并以其为纵坐标，以搜集管次序号为横坐标，在坐标纸上绘图，取得含有洗脱峰曲线即洗脱曲线（图7-7）。相邻峰交叉越少表明分离效果越好。高效液相色谱分离技术B第95页图7-7洗脱曲线示意图高效液相色谱分离技术B第96页5、凝胶洗涤与保留再生：①普通只要用洗脱液冲洗后即可连续使用。若凝胶颗粒沉积压紧，流速减慢，则需倒出，清洗后重新装柱。②有微量污染可用0.9mol/L氢氧化钠（内含0.5mol/L氯化钠）处理冲洗，再用水洗至中性。③凝胶色泽改变，流速降低，表面有污染物等时，惯用温热（50℃左右）0.5mol/L氢氧化钠和0.5mol/L氯化钠混合液浸泡，再用水洗净。短时保留：可浸泡在溶液中，存放在4℃冰箱中。若放在室温保留应加入0.02%叠氮化钠（NaN3）或0.01%乙酸汞等防腐剂，以防发霉。用时以水洗去防腐剂即可使用。长久保留：可用水洗净，分次加入百分浓度递增乙醇脱水，最终再用乙醚除乙醇，烘干即可。高效液相色谱分离技术B第97页四、应用

特适合于大分子量聚合物、蛋白质、核酸等分析。对样品要求：可溶于流动相中。

1.脱盐

25克固体葡聚糖凝胶+0.05MpH=7.2Tris缓冲液（2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇-盐酸缓冲液）→充胀→装柱（待脱盐蛋白质溶液体积=1/5柱床体积）→加样→用上述缓冲液洗脱→紫外分光光度计（

=280nm）检测洗脱下来蛋白质。高效液相色谱分离技术B第98页2.酶解产物在SephadexG-50柱上预分级分离

一个普通蛋白质假如经过一些特异酶或化学方法进行降解，则会生成相当复杂肽混合物。为了进行结构研究，必须分离和纯化“粗”水解产物中组成多肽链全部肽，这是件非常复杂工作。所以，“粗”水解产物必须进行预分级分离。在当代方法中，凝胶过滤最适于此种目标。高效液相色谱分离技术B第99页

将凝胶与4份0.01mol／L氨水溶液在室温搅拌30min，然后沉降，倾去细颗粒上层液。沉降葡聚糖凝胶G-50再与约3份0.01mol／L氨水溶液搅拌并倒入柱中。柱用5倍与床体积0.01mol／L氨水溶液洗涤。将200mg被分离物质溶于3~5ml0.01mol/L氨水溶液中，让样品慢慢吸入凝胶柱中，用0.01mol/L氨水溶液洗脱，流速250~300ml／h，搜集各管在紫外280nm处有吸收洗脱液，合并，冷冻干燥。2高效液相色谱分离技术B第100页§7-6高效液相色谱试验技术一、柱技术液相色谱柱是色谱关键部件，应该了解柱子结构、填料性质、装柱操作和保养维持技术。1、装填（用“高压匀浆法”装填）（1）装柱机准备高压匀浆法装柱装填机及配套流程见图7-8。

图7-8色谱柱高压匀浆法装填高效液相色谱分离技术B第101页（2）柱子清洗：有两种清洗法可供选择。一是有机溶剂清洗法，柱子依次用二氯甲烷、丙酮、水洗洗洁净。二是酸洗法，把柱头及柱管放在1：1硝酸中超声20-30min，再用清水超声处理几次，至洗涤水显中性。（3）装柱条件选择：装柱条件主要是装柱压力(是使用压力几倍)、装柱时间(在20-60min之间)、匀浆体积(随机附有匀浆管)等。（4）匀浆配制：装柱填料要用一定溶剂使其分散制成匀浆。装反相色谱柱惯用四氯化碳和二氧六环（约2：1）。装流动相是盐水溶液填料可用异丙醇。高效液相色谱分离技术B第102页方法：先称取所需填料量1.1-1.2倍，加入与匀浆管体积数相等量分散溶剂，超声2-3min，使填料分散均匀，并尽可能地赶去填料孔内气泡。将清洗过柱子一头柱头装好，另一头柱头卸下，将柱子装在匀浆管上，然后将匀浆从超声器上取出倒进匀浆管。此时，匀浆应充满整个匀浆管。接上管子后马上开泵装柱。（5）装柱：装柱过程中不能停顿，以免装填不匀。方法：装柱时间到了以后，不能马上拆下柱子。应关阀门，然后等候5-20min，让柱内压力自然降低，柱子出口不再滴液时方可拆下柱子，装上柱头。并拧上两头密封螺丝。高效液相色谱分离技术B第103页2、柱子保养柱子不用时，用不会长霉菌液体充满柱内，并拧紧两头密封螺丝。惯用封存液有：甲醇、50%甲醇、万分之二叠氮化钠水溶液。3、柱子堵塞处理柱子堵塞经常是柱子入口端筛板被杂质堵塞。能够拆下入口端柱头，用能够溶解杂质溶剂超声或煮沸处理；也能够用1：1HNO3煮30min。4、柱子填料凹陷打开柱头，用同种填料在湿润下填平即可高效液相色谱分离技术B第104页二、洗脱方式洗脱方式有三种：等浓度洗脱、梯度洗脱、脉冲洗脱。等浓度洗脱：是流动组成、pH值、流速不改变洗脱方式。（使用示差检测器时，or在排阻色谱中，只能使用等浓度洗脱。）梯度洗脱：在一次分离中用改变流动相组成或pH来逐步增加流动相洗脱能力洗脱方式。（梯度洗脱用两种洗脱液，分A液和B液。A液洗脱能力弱，B液洗脱能力强。洗脱开始时用A液，然后依据梯度洗脱程序自动向流动相中添加B液，增大洗脱强度。）（使用紫外检测器和荧光检测器时反相色谱和离子交换色谱中能够使用梯度洗脱。普通，在样品组分较多，组分之间容量因子K′或保留时间相差大时，应该使用梯度洗脱，不然保留强溶质峰太宽或者一些峰分离不开。）脉冲洗脱：用一段少许洗涤剂，让它象一条密集脉冲带流过柱子，以洗下某个特定物质。（这种方法适合用于很昂贵洗脱液，须在柱子平衡、上样、洗涤后使用。）（亲合色谱中使用）高效液相色谱分离技术B第105页三、流动相（1）流动相作用①样品组分能溶解在其中，随流动相流出柱子。②流动相参加了分离过程。除了排阻色谱外，流动相中强洗脱剂与样品组分对配基有一个竞争作用，它会把样品组分从配基上顶替下来，即解吸作用。另外，改变流动相组成不但能够改变洗脱能力、分离度和选择性，还会影响一些生命活性物质活性回收率。（2）流动相选择遵照以下标准：①样品组分能溶于流动相并不起化学反应。②对仪器无腐蚀作用。对人无毒害。③对柱填料无破坏作用，如硅胶基质填料，流动相pH值应在2-8之间，不然会破坏填料。④要考虑与色谱方法和检测器配套。高效液相色谱分离技术B第106页四、分离模式选择依据是：试验室条件、样品组分理化性质、分离目标和要求三方面。色谱分离模式选择参考图。P212（3）流动相处理①流动相若不纯，则要作纯化处理。方法：水要用去离子水或蒸馏水。有机溶剂常要先作化学处理后重蒸。盐要重结晶除去一些有害重金属离子。②配制好流动对应作过滤和脱气处理。过滤时用孔径0.2μm膜，除去机械杂质。脱气处理有超声、抽真空、回流三种方法，以除去溶液中气体。国外还惯用He气，使流动相瓶中保持一定He气分压作为脱气一个伎俩，因代价高，国内不惯用。高效液相色谱分离技术B第107页色谱分离模式选择参考图有机磷酸脂、脂溶性维生素、农药、芳烃、单糖、二糖类脂类、甙衍生物、脂溶性维生素、多环芳烃核苷酸、核酸碱、低聚核苷酸、聚胺、氨基酸、抗体、甾体轭合物、止痛药人血清蛋白、胚胎、牛血清蛋白、合成高聚物、蛋白、糊精血红蛋白蛋白LDH同功酶蛋白、多糖、核酸、肌红蛋白、溴化氰裂解物应用农药、肽、儿茶酚胺、PTH氨基酸、核苷酸、甾类、氨基酸、抗体、类黄酮、有机酸高效液相色谱分离技术B第108页

§7-7高效液相色谱应用

一、制备分离用HPLC进行制备分离，其性能远比气相色谱优越。可用于制备纯品（只分离不分析）或气相色谱前处理（HPLC-GC联用）。使用内径为8mm色谱柱，可制备mg级纯品，用于结构测定，也可作为HPLC纯试剂，为GC提供标样。高效液相色谱分离技术B第109页（1）制备色谱分类类型用途柱子内径(mm)长度(cm)填料粒度(μm)流动相流速(ml/min)上样量分析色谱定性、定量分析2－55－255－8＜2＜1mg半制备型制备小量纯样品5－2015－5010－252－205－100mg制备型制备克级样品20－5020－7020－5015－1500.1－10g工业制备型几十克以上样品几十到几百＞100＜几十克高效液相色谱分离技术B第110页（2）分析型和制备型色谱差异①分离样品量不一样。分析型不超出1mg。制备型最少进样几毫克以上。②柱子大小及仪器不一样。制备：用大柱子和制备色谱仪。③分离目标、要求不一样。色谱分离三个指标，即分离度、分离速度和样品负荷量。这三者是相互关联。分型型色谱中，在极短时间内得到高分离度，不考虑分离量，因为其目标是要得到样品组成及含量数据。制备色谱中，目标：得到纯度高某物质，而且往往要求尽可能地降低成本。要求：分离度是以确保纯度为标准，分离量在确保纯度情况下越大越好。高效液相色谱分离技术B第111页④分析型色谱—

线性色谱：柱子不过载。样品组分保留值（K′）和柱效（η）不随样品量改变而改变。K′与流动相相流速无关，分离度（Rs）和塔板数（n）与流速相关。峰形与样品量无关，但峰面积与样品量成正比。制备色谱—有两种情况。一是柱子不过载，与分析型色谱有类似现象；二是柱子过载，这就是非线性色谱。在柱子过载后，K′、n随样品量改变而改变（样品量增大，K′减小,n增大)。流速对分离度和塔板数影响较小。 ⑤分析型色谱不搜集组分洗脱液，制备色谱中要搜集相关产品洗脱液。高效液相色谱分离技术B第112页（3）不一样混合样品制备方法在制备色谱中，主要考虑：确保产品纯度、降低消耗。在一个混合样品中，需要制备组分常有以下三种情况，并应采取不一样方法分离制备。如图7-9。欲分离制备组分是一个主要组分欲制备组分有两个主组分被制备组分是微量组分图7-9制备色谱中被制备组分三种组成情况高效液相色谱分离技术B第113页第一个情况，欲分离制备组分是一个主要组分，如图7-9（a）。①经过改变容量因子K′，相对保留值α和增大塔板数n来提升分离度Rs（图7-10中a、b）。②增大进样量直到柱子负荷极限，但要确保使待分离组分与其它K′靠近组分有良好分离。此时能够搜集待分离组分。③深入增大进样量，柱子在过载情况下运行，甚至会发生峰重合。此时应按中心切割法搜集洗脱液（见图7-10中d）。图7-10取得主组分最大制备量路径高效液相色谱分离技术B第114页第二种情况欲制备组分有两个主组分，而且K′较靠近。制备方法：两次分离。①首次制备时，暂不考虑分离度，在制备柱大量过载情况下，按“中心切割法”搜集含这两个组分峰洗脱液（见图7-11中b）。②将搜集液在尽可能高分离度条件下再次分离，搜集流出液，并检验各自纯度（见图7-11中c）。图7-11K’相近物质对最佳分离高效液相色谱分离技术B第115页③对于两个分离不完全组分，可按下列图切割搜集。两峰两头，能够得到高纯物质。而中间部分是两个物质混合物，应再作分离（见图7-12）。图7-12两个不完全分离组分搜集高效液相色谱分离技术B第116页第三种情况，欲制备组分是微量组分。图7-9中c①按第一个情况①②，选择最正确分离度，在柱子负荷极限时，可观察到该组分存在（见图7-13），②在过载情况下，搜集该组分对应洗脱液。③将搜集液浓缩，再在最正确分离度情况下再一次分离制备和搜集该组分。图7-13微量组分制备

制备样品中，分离时绝不止这三种经典情况，所以在依据实际制订适当分离方案。高效液相色谱分离技术B第117页

二、样品前处理

HPLC色谱柱柱头易被污染，被测样品一定要严格进行前处理。提取后普通用薄层色谱或柱色谱进行预分离，再用预处理柱深入去杂质。HPLC普通不需要制备衍生物，但：

1.为使样品中各组分能被检测器检出，需制备衍生物。比如：分析脂肪酸或氨基酸时，若用UVD检测器，要用对硝基苯甲酰氯与试样反应，生成酯类化合物，使其在紫外光下有吸收。

2.对不易分离强极性有机物，比如脱落酸，可进行酯化，以提升分离效果。高效液相色谱分离技术B第118页1、HPLC在不一样领域主要应用三、HPLC应用及实例高效液相色谱分离技术B第119页HPLC在几方面应用(1)蛋白质和氨基酸①蛋白质样品→提取，纯化→蛋白质分析专用柱，磷酸盐缓冲液作流动相，紫外检测器（λ=210nm）→分离，例：用Waters1-125蛋白柱，分离出7种相对分子质量不一样蛋白质（铁蛋白：M=540000，牛血清蛋白：M=67000，蛋清蛋白：M=45000，肌红蛋白：M=17000，核糖核酸酶：M=13700，细胞色素：M=12500，鸟苷：M=283）高效液相色谱分离技术B第120页

②氨基酸用离子交换色谱或反相色谱。脱脂样品20~30mg（含蛋白质3~5mg）加6M盐酸8ml于110℃水解22h→浓缩，离心→离子交换柱，不一样pH磷酸缓冲液洗脱→用水合茚三酮制备衍生物→比色仪（λ=570和444nm）检测，最小检测量：100pmoles（微微摩尔）例：LKB4150氨基酸分析仪90min内完成一个样品18种氨基酸分析。

离心后也可用C-18反相柱，乙腈—乙酸乙酯，甲醇梯度洗脱→用邻苯二甲醛制备衍生物→紫外检测器检测。高效液相色谱分离技术B第121页

预处理样品→PICO﹒TAGTM水解器水解→用异硫氰酸苯制备衍生物→PICO﹒TAGTM柱，反相分配梯度洗脱→紫外检测器（λ=254nm）检测，最小检测量：1pmole。例：Waters-PICO﹒TAG氨基酸分析仪12min内完成一个样品18种氨基酸分析。高效液相色谱分离技术B第122页

(2)萜类从单萜到四萜均可用HPLC分析。尤其适合于含氧、含氮二、三萜。

正相柱硅胶柱：YWG，流动相：己烷或庚烷，二氯甲烷，乙酸乙酯。用己烷或庚烷作底剂，用二氯甲烷、乙酸乙酯调整极性，加到底剂中。

反相柱

YWG-C18，流动相：甲醇∶水

检测器：含共轭双键化合物用紫外检测器，其它用示差折光检测器或蒸发光散射检测器。高效液相色谱分离技术B第123页

(3)甾体、生物碱和糖类分析甾体、生物碱和糖类，HPLC优于GC。

①甾体固定相：YWG-C18，流动相：乙腈∶水，检测器：紫外。

②生物碱固定相：YWG-C18，流动相：甲醇∶水，以此控制生物碱对离子亲合能力，到达分离目标，调整出峰次序，检测器：紫外。高效液相色谱分离技术B第12