天然药物化学试验

实验一天然产物化学成分系统预试验天然产物中所含的化学成分种类很多，在深入研究之前应首先了解其中含有哪些类型的化学成分，如生物碱、皂甘、黄酮类等等。这就需要进行各类化学成分的系统定性预试验。或根据研究的需要进行单项预试法来初步判断。一、实验目的与要求掌握未知成分的天然产物是怎样初步提取分离的，熟悉各主要成分的试管试验、沉淀反应和纸层析、薄层层析的方法并根据试验结果判断含有什么类型的化学成分。二、基本原理利用各类成分的颜色反应和沉淀反应，对天然产物的提取液进行检查可以初步判断其中的化学成分。由于提取液大多数颜色较深，影响对颜色变化的观察，可以使用薄层层析（TLC）或纸层析（PC）等方法对天然产物的提取液进行初步分离，再进一步检查。三、实验内容：利用不同成分在各种溶剂中的溶解度的不同，一般可采用以下3种溶剂分别提取，试验。.水浸液：取中草药粗粉5g加水60ml,在50〜60℃的水浴上加热1小时，过滤，滤液进行下列试验。

*在试管进行，△在滤纸或硅胶CMC-Na薄层板上进行，下检查项目试剂名称糖*1、酚醛缩合反应*2、菲林试剂—酚类△1%FeCl8试剂—鞣质△1、1%FeCl8试剂营类或多糖*1、酚醛缩合反应—*2、加6NHCl酸化，加热煮沸数分钟，冷后仔细观察有无絮状沉淀*3、菲林试剂，观察水解前后也。沉淀量有无增加。2皂昔*泡沫试验生物碱*1、碘化铋钾试剂*2、硅鸨酸试剂同。糖鉴定(1)a-萘酚一硫酸试剂 检查还原糖。①溶液I：10%a-萘酚乙醇溶液。溶液H：硫酸。取1ml样品的稀乙醇溶液或水溶液，加入溶液I2滴〜3滴，混匀，沿试管壁缓缓加入少量溶液11,二液面交界处产生紫红色环为阳性反应。(2)斐林试剂检查还原糖。溶液I：6.93g结晶硫酸铜溶于100ml水中。溶液II：34.6g酒石酸钾钠、10g氢氧化钠溶于100ml水中。取1ml样品热水提取液，加入4滴〜5滴用时配制的溶液I、II等量混合液，在沸水浴中加热数分钟，产生砖红色沉淀为阳性反应。如检查多糖和甘，取1ml样品水提液，加入1m110%盐酸溶液，在沸水浴上加热10min,过滤，(成盐去除杂质)再用10%氢氧化钠溶液调至中性，按上述方法检查还原糖。或者直接用高效液相色谱看色谱图。酚类鉴定试剂(1)三氯化铁试剂检查酚类化合物、鞣质1%〜5%三氯化铁水溶液或乙醇溶液，加盐酸酸化。取1ml样品的乙醇溶液，加入试剂1滴〜2滴，显绿、蓝绿或暗紫色为阳性反应。作色谱显色剂用，喷洒后，显绿或兰色斑点为阳性。.乙醇提取液取中草药粗粉5g,加5〜12倍量95%乙醇，在水浴上加热回流提取1小时，过滤，滤液留2ml作（1）项试验，其余回收乙醇至无醇味，并浓缩成浸膏状，浸膏分为二部分，一部分加少量2%HCL振摇溶过滤。分出酸液，作（2）项式验，附于滤纸上的一部分再以少量乙醇溶解，溶液作（3）项试验；另一部分浸膏以少量乙酸乙酯溶解，溶液置分液漏斗中加适量5%NaOH振摇，使酚性物质及有机酸等转入下层氢氧化钠水溶液中，剩下的乙酸乙酯为中性部分，用蒸馏水洗去碱性即可备用，将乙酸乙酯液2〜3ml，在水浴上蒸干，以1~2ml乙醇溶解作（4）项试验（1）项试验检查项目酚 类鞣 质试剂名称△1%FeCl3△1%FeCl3结 果（2）项试验

3、石油醚提取液取中草药粗粉1g,加10ml石油酷（沸程60〜90℃）,放置2~3小时，过滤，滤液置表面皿上任其挥发，残留物进行下列试验：检查项目甾体或三萜类挥发油和油酯试剂名称*1、醋酎一浓硫酸试验石油酸提取液滴于滤纸片上，观察有无油斑并在加热后能否发挥结果黄酮类鉴定试剂（1）盐酸-镁粉试剂检查黄酮（醇）、二氢黄酮（醇）类化合物。取1ml样品的乙醇溶液，加入数毫克镁粉，滴加数滴盐酸，必要时水浴上微热，显红-紫色为阳性反应。（3）三氯化铝试剂检查具有邻二酚羟基或3-羟基、4-酮基或5-羟基、4-酮基的黄酮类化合物。1%三氯化铝乙醇溶液或5%三氯化铝乙醇溶液。喷洒前、后将薄层板置日光下和紫外光灯下观察，呈黄色或黄绿色荧光为阳性反应也可在滤纸上或试管中进行。(3)醋酸镁试剂 检查黄酮类，二氢黄酮类化合物，及羟基蒽醍类衍生物。1%醋酸镁甲醇溶液。在滤纸或薄层板上，点1滴样品醇溶液，挥去醇后，点1滴试剂于样品斑点边缘，加热干燥，于紫外灯下观察，黄酮类显黄色荧光，二氢黄酮类呈天蓝色荧光。显橙红色为大黄素型蒽醍，显紫色为茜草型蒽醍。生物碱鉴定试剂(1)改良碘化铋钾试剂为生物碱通用显色剂。溶液I：0.85g次硝酸铋溶于10ml冰醋酸，加水40ml。溶液H：8g碘化钾溶于20ml水中。溶液I和H等量混合，于棕色瓶中可以保存较长时间。目前市场上有碘化铋钾试剂可供直接配制：7.3g碘化铋钾、冰醋酸10ml加水60ml。取1m1样品的稀酸溶液加1滴〜2滴试剂，产生桔红色浑浊或沉淀为阳性反应。如作薄层色谱显色剂，取混合液1m1、醋酸2ml、水10ml混合即得。喷洒后呈桔红色斑点为阳性反应(2)苦味酸试剂 为生物碱通用沉淀试剂。苦味酸1g溶于100ml水中。取1ml样品中性溶液，加入试剂1滴〜2滴，产生黄色晶形沉淀。(3)硅鸨酸试剂 为生物碱通用沉淀试剂。1g硅鸨酸溶于20ml水中，加10%盐酸使成pH2左右。取1ml样品的稀酸溶液，加入1滴〜2滴试剂，产生白色至褐色沉淀为阳性反应。四、药品试剂：中药饮片每组每种8克生物碱试剂(1)碘化铋钾(Dragendorff)试剂：出现桔红色或黄色沉淀。(2)苦味酸(Hager)试剂，样品液需调至中性后加试剂，出现黄色晶形沉淀。(3)硅鸨酸(Bertrand)试剂：出现淡黄色或灰白色沉淀，在薄层板上应时，加热后出现黑色斑点。酚类、鞣质试剂1%三氯化铁水或乙醇试剂氨基酸、蛋白质试剂茚三酮(Ninnydrin)试剂糖、多糖和甘试剂(1)a-萘酚试剂、Molish试剂(2)菲林氏反应(Fehling试剂):溶液I：69.3克结晶硫酸铜溶于1000毫升水中。溶液H：349克洒石酸钾钠及氢氧化钠100克，溶于1000毫升水中。皂营试剂浓硫酸试剂黄酮类试剂盐酸一一镁粉反应醋酸镁反应1%三氯化铝乙醇液香豆素试剂1%三氯化铁水溶液Gibb氏反应：4-氨基安替比林-铁氰化钾(Emerson)4、玻璃仪器：(每2人或3人一组，每组一套)(1)试管10个，滴管2个，玻棒1支(2)100ml圆底烧瓶一个，250ml圆底烧瓶一个，25cm球型或蛇型冷凝管一个，有机溶剂蒸馏回收装置1套，50ml烧杯3个，25ml具塞锥形瓶，(3)有孔白瓷板1个(4)滤纸，乳胶管、药勺仪器：(1)普通天平，(2)分析天平，(4)电水浴锅五、思考题实验学时：9学时实验二芦丁的提取、分离及鉴定一、目的要求.以芦丁为实例学习黄酮类成分的提取分离方法。.掌握用黄酮甘水解制取黄酮甘元的方法。.了解黄酮类化合物的一般性质。二、基本原理槐米系豆科属植物槐树SopHorajaponica.L.的花蕾，历来作为止血药，治疗痔疮、子宫出血、吐血、鼻出血，并有清肝泻火，治疗肝热目赤，头痛眩晕的功能。其主要化学成分为芸香甘(芦丁)，含量高达12%〜20%,芸香甘广泛存在于植物中，现已发现含有芸香甘的植物高达70种以上，尤以槐米和乔麦中含量最高。药理实验证明芸香甘有调节毛细血管渗透作用，临床上用作毛细血管性止血药，常作为高血压症的辅助用药。槐米中主要成分的物理性质.芸香甘（芦丁， rutin）：cho.3ho，淡黄色针状结晶，mpl74℃〜178℃,无水物为188℃〜190℃。溶解度：冷水中1：8000,热水中1：200,冷乙醇中1：300,热乙醇中1：30,冷吡啶中1：12,微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、氯仿、石油醚等溶剂。易溶于碱液，呈黄色，酸化后又析出，可溶于硫酸和盐酸，呈棕黄色，加水稀释又析出。UV九EtoHnm：259,299sh,359。max.槲皮素（quercetin）：cho.2ho,黄色结晶，mp313℃〜314℃,无水物为316℃。15 107 2溶解度：冷乙醇中1：290,沸乙醇中1：23,可溶于甲醇、乙酸乙酯、吡啶、丙酮等溶剂，不溶于水、乙醚、苯、氯仿、石油醚。UV九EtoHnm：255,269sh,301sh,max370。芸香甘（芦丁， rutin）.芸香甘分子中具有酚羟基，显弱酸性，在碱水中成盐增大溶解能力，用碱水为溶剂煮沸提取，提取液加酸酸化后又成为游离的芸香甘而析出。并利用芸香甘对冷水和热水的溶解度相差悬殊的特性进行精制。.黄酮甘可通过酸水解得到昔元和糖，并可通过薄层色谱法和纸色谱法进行检识。.利用黄酮类化合物对紫外光有特定吸收的特征进行结构测定；也可制备乙酰化物进行结构鉴定。三、实验内容1自槐花米中提取芦丁：.提取方法：称取槐花米粗粉20g（压碎），加沸水300ml,加热煮沸30min,四层纱布趁热过滤，残渣同法再操作一次，合并两次滤液，放置冰箱中析晶，待全部析出后，减压抽滤，用蒸馏水洗涤芸香甘结晶，抽干，得粗制芸香甘，置空气中干燥后，称重。.重结晶方法：取粗芦丁2g,加去离子水或蒸馏水400ml,加热煮沸，趁热抽滤，放置过夜析晶（或放冷析晶），抽滤，得精制芦丁。记录：粗芦丁得率多少？精制芦丁得率多少？熔点？.芦丁的水解：取芦丁1g,加2%H2sO’80ml,小火加热微沸回流30分钟至1小时。开始加热10分钟为澄清溶液，逐渐析出黄色小针状结晶，即槲皮素，抽滤取结晶（保留滤液20毫升，以检查其中所含单糖），沉淀物为芸香甘甘元（槲皮素），用蒸馏水洗至中性，抽干水分，晾干，称量。得粗制槲皮素，再用乙醇重结晶得精制槲皮素。加50%乙醇(按1克90ml量)加热回流使槲皮素粗晶溶解，趁热抽滤，放置析晶，抽滤得精制品，在减压下110℃干燥可得槲皮素无水物。测熔点，进行薄层层析鉴定。取芸香甘水解后的滤液20ml,加饱和氢氧化钡溶液中和至中性(搅拌下进行)，滤去白色的硫酸钡沉淀，滤液浓缩至2ml〜3ml或蒸于后，加2ml〜3ml乙醇溶解，作为糖的供试液。.鉴定呈色反应取芸香甘及槲皮素精品约10mg,各用5ml乙醇溶解，制成样品溶液，按下列方法进行试验，比较昔元和昔的反应情况。(1)Molish反应取样品溶液1ml,加100%a—萘酚溶液1ml,振摇后斜置试管，沿管壁滴加0.5ml硫酸，静置，观察并记录液面交界处颜色变化。(2)盐酸一镁粉反应 芸香甘与槲皮素溶液分别置于两试管中，加入金属镁粉少许，盐酸2滴〜3滴，观察并记录颜色变化。(3)醋酸镁纸片反应 取两张滤纸条，分别滴两滴芸香甘、槲皮素的乙醇溶液，然后各加1%醋酸镁甲醇溶液两滴，于紫外光灯下观察荧光变化，记录现象。(4)利三氯化铝纸片反应在两张滤纸条上分别滴加芸香甘、槲皮素醇溶液后，各加1%三氯化铝乙醇溶液两滴，于紫外光灯下观察荧光变化，记录现象。（5）锆一柠檬酸反应取样品溶液2ml,加2%二氯氧锆甲醇溶液3滴〜4滴，观察颜色，然后加入2%柠檬酸甲醇溶液3滴〜4滴，观察并记录颜色变化。色谱鉴定（1）芸香甘和槲皮素的薄层色谱样品自制芦丁、槲皮素对照品芦丁、槲此素展开剂（1）正丁醇-醋酸-水（4：1：5上层或4：1：1）；（2）25%醋酸水溶液；（3）85%醋酸水溶液显色（1）可见光下观察，再在紫外光下观察；（2）经氨气熏后再观察；（3）喷三氯化铝试剂后再观察点样：提取的槲皮素及芸香甘的乙醇溶液和对照品的乙醇溶液。展开剂：正丁醇一醋酸一水（4：l：5）上层溶液。展开方式：预饱和后，上行展开。显色：喷洒三氯化铝试剂前后，置日光及紫外光灯（365nm）下检视色斑的变化。观察记录：记录图谱及斑点颜色。（2）芸香甘与槲皮素的聚酰胺色谱层析材料：聚酰胺薄膜。点样：提取的芸香甘与槲皮素的乙醇溶液和对照品的乙醇溶液。展开剂：乙醇-水（7：3）,水饱和的正丁醇一醋酸（10：0.2）。展开方式：上行展开。显色：喷洒三氯化铝试剂前后，置日光及紫外灯光（365nm）下检视色斑的变化。观察记录：记录图谱及斑色颜色。（3）糖的色谱鉴定层析材料：新华层析滤纸NO.2。点样：（三）中糖的供试液及葡萄糖、鼠李糖对照品溶液。展开剂：正丁醇一醋酸一水（4：l：5）上层溶液。展开方式：上行展开。显色：氨性硝酸银试液，喷洒后先用电吹风冷吹至于，再吹热风至出现斑点为止。观察记录：记录图谱及斑点颜色。四、药品试剂药品：每组槐花米20克主要仪器及试剂仪器:（1）烧杯（100ml,500ml）；（2）圆底烧瓶（100ml,150ml）；（3）冷凝管