生物技术的工程应用(一)课件

生物技术的工程应用（一）1动物克隆技术转基因技术基因敲除技术基因治疗干细胞技术单克隆抗体制备技术2

“多莉”克隆成功1997年2月22日，《Nature》英国爱丁堡罗斯林研究所3克隆的概念Clone无性系或无性繁殖系。做为名词：从一个共同的祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊生命群体；做为动词：指从一个共同祖先产生这一特殊生命群体的过程。一种人工诱导的无性繁殖方式4动物克隆技术是通过核移植，产生遗传结构与细胞核供体相同的动物个体的无性繁殖技术。又称核移植技术。经过核移植而产生的动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。根据核供体的来源不同：胚胎细胞克隆动物技术体细胞克隆动物技术5细胞核移植研究细胞核遗传全能性研究二十世纪60年代第一个用成体细胞核成功克隆动物JOHNGURDON(1933-)7胚胎细胞克隆研究1981年，Illmenses率先报告用小鼠幼胚细胞核克隆出正常小鼠。1986年，Willadsen等用未发育成熟的羊胚细胞的细胞核克隆出一头羊。1987年，克隆牛。1988年，克隆兔。1989年，克隆猪。二十世纪80年代开始，我国先后在五种动物上取得成功,其中包括兔、山羊、牛、猪、小鼠。82000年，杨向中教授用体外长期培养后的公牛耳皮细胞成功克隆出6头牛犊。2000年，克隆猴成功。2000年，克隆猪成功。2003年，美国研究人员用冷冻20多年的爪哇野牛皮肤细胞成功克隆出两头爪哇野牛，为保护濒危动物带来了新希望。102003年，雄性克隆骡在美国培育成功，该研究为从基因角度无法繁殖后代的杂种动物繁衍后代提供了新的途径。2004年，美国和韩国科学家成功克隆出人类早期胚胎，并从中提取出胚胎干细胞，这是科学家首次利用克隆技术获得人类胚胎干细胞。11“多莉”诞生的重要生物学意义证明一个已经完全分化了的动物体细胞仍然保持着当初胚胎细胞的全部遗传信息，并且体细胞可恢复失去的全能性形成完整个体。在培育体细胞成为核供体之前，人们可以利用“基因靶”技术精确地诱发核基因的遗传改变或精确地植入目的基因，从而可以按照人的意志去改选、生产物种。利用克隆技术复制哺乳类动物的最后技术障碍已被突破，在理论上已成为可能。12123141.核受体细胞的准备去核卵母细胞卵母细胞的来源：用激素对雌体进行超排处理，从输卵管冲出体内成熟的卵母细胞。从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘—卵母细胞复合体，在体外培养成熟后作为受体。153.细胞核移植胞质内注射：用一个外径5～8μm的注核针吸取供体核后直接注射进卵母细胞胞质内的方法。透明带下注射：把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后用电刺激进行细胞融合。174.重组胚的激活通过化学激活、电脉冲等方法，使卵母细胞进入到“受精”的状态。185.重组胚的体内或体外培养体内培养：羊和牛的重组胚用琼脂包埋后移入休情期的母羊结扎的输卵管中体内培养4-7d，发育至桑椹胚和囊胚。猪的核移植重组胚移入同期化受体母猪输卵管内作体内培养7d，发育为囊胚。

体外培养：大鼠、小鼠和兔的核移植胚多采用体外培养，发育至桑椹胚或囊胚。196.胚胎移植受体母畜选择条件：皮毛颜色与供体品种不同繁殖性能强、体格稍大的当地品种进行同期发情处理按常规方法将重组克隆胚胎移植至代孕母畜（寄母）的子宫中，待其发育到产仔。20“多莉”的诞生过程核供体细胞的准备：6岁母绵羊（白面母羊）的乳腺细胞，饥饿法使其进入休眠状态而使全部基因具有活性。核供体细胞的准备：注射促性腺激素，促使母羊（黑面母绵羊）排卵，28~33小时取其未受精卵，快速去核，放入10%FCS、1%FCS和0.5%FCS连续5天，使其进入G0期做受体细胞。核移植及重组胚激活重组胚的体内培养：新的卵细胞植入羊的结扎的输卵管内，6天后发育为桑椹胚或囊胚（8~16个细胞）。胚胎移植：将早期胚胎移入假孕母羊子宫中，产下“多利”即为6岁母羊的复制品，也为白色21动物克隆技术存在的问题分化的体细胞克隆对遗传物质重编（在细胞核内所有或大部分基因关闭的基础上，细胞重新恢复全能性）的机理还不清楚。克隆动物是否会记住供体细胞的年龄？克隆动物的连续后代是否会累积突变基因？在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用是什么？成功率低!部分个体表现出生理或免疫缺限。221982年，《Nature》将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中，培育出具快速生长效应的“转基因超级鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快2～3倍，体积大一倍。24转基因技术将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状发生可遗传的修饰，称之为转基因技术。转基因动物：用实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。25转基因动物的应用前景研究基因的结构与功能，了解动物生命现象的内在本质。建立多种疾病的动物模型，研究发病机理及治疗方法。人异种器官移植改善动物生产性能，提高动物育种效率。制备医用或食用蛋白的生物反应器。如：通过动物乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白。27生物反应器利用转基因活体动物的某种能够高效表达外源蛋白的器官或组织来进行工业化生产活性功能蛋白的技术。细胞生物反应器、乳腺生物反应器、血液生物反应器、卵生物反应器、尿生物反应器、精囊腺生物反应器、唾液生物反应器等。哺乳动物反应器、家禽生物反应器、家蚕生物反应器等。28转基因山羊——活动的制药厂药用蛋白基因转基因山羊。分泌的乳汁里就会含有药用蛋白。成熟的转基因山羊会与非转基因山羊配种，它们繁殖的后代同样带有药用蛋白基因。得到转基因羊群。29存在的问题1、食品安全问题：未知的可能副作用？外源基因在人体内表达？2、技术问题：成本高；成功率低、成活率低（0.2%～4.4%）；基因组是否能够有效整合、稳定遗传？30患上精神分裂症的老鼠名为DISC1的基因的改变是诱发精神分裂症的重要原因。缺乏这种基因的老鼠会患上精神分裂症。31基因敲除技术采用基因同源重组的方法，用体外合成的无效基因或突变基因取代相应正常基因，再应用转基因方法孵育出转基因动物，即基因敲除动物。32基因敲除技术的技术路线构建重组基因载体用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核中用选择培养基筛选已击中的细胞将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。33基因敲除技术的应用研究基因调控和基因功能建立人类疾病的基因敲除动物模型，为医学研究提供材料改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功能，研究发育生物学治疗遗传病，即基因治疗改造生物、培育新的生物品种34基因治疗广义：凡是采用分子生物学的方法和原理，在核酸水平上开展的疾病治疗方法都可称为基因治疗。狭义：将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用（也包括剔除或抑制某些导致疾病的基因），从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。35实施基因治疗的必要条件发病机制在DNA水平上已经清楚。要转移的基因已经克隆分离，对其表达产物有详尽的了解。该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作。36基因治疗的策略基因置换：用正常的基因原位替换病变细胞内的致病基因。基因修复：将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留。基因修饰：将目的基因导入病变细胞或其他细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有某些功能得以加强。基因失活：利用反义技术能特异地封闭基因表达特性，抑制一些有害基因的表达。免疫调节：将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内，改变病人免疫状态，达到预防或治疗疾病的目的。37基因治疗举例1990年9月14日，美国一个患有严重免疫缺陷症的4岁小女孩接受基因治疗并获得了成功。1991年，50名黑色素瘤晚期患者接受了基因治疗。研究者把外源的肿瘤坏死因子转入肿瘤浸润淋巴细胞，结果肿瘤浸润淋巴细胞能集中在肿瘤所在部位杀死肿瘤细胞。截止2004年1月31日,世界上已有918个基因治疗方案用于临床，治疗病例超过6000例。38治疗糖尿病新方法—基因治疗2009年2月27日，日本《每日新闻》报道东京慈惠会医科大学通过向患糖尿病实验鼠的胰腺植入特定基因，可成功使具有降血糖功能的胰腺b细胞大幅增殖。39移植基因方法可有效抑制艾滋病病毒

NatureMedicine15February2009洛杉矶加利福尼亚大学74名感染艾滋病病毒的志愿者一半志愿者被植入血液干细胞，这些干细胞被含有关键基因（编码核糖核酸酶）的受损病毒所感染，而其他人则植入了无害的相似物质。实验开始100周后：植入基因者的病毒数量显著减少。40帕金森氏症基因治疗方法问世美国《国家科学院学报》月刊，2007年11月20日12名帕金森氏症的患者患者脑部相关区域会被注射入一种无害的转基因病毒。在实验后，科学家对接受此种方法治疗的患者进行了脑部扫描。扫描证实，实验中的帕金森氏症患者脑中原本不正常的大脑回路在逐步恢复健康。41基因治疗载体可能会激发癌症Science，2007年7月27日华盛顿大学基因治疗载体会激发癌症“载体基因可能整合到你不希望它整合的位点”42干细胞stemcell未分化的细胞具有自我更新（self-renewal）和多向分化潜能（multilineagedifferentiation）的细胞。胚胎干细胞

ESembryonicstemcell成体干细胞adultstemcell43胚胎干细胞来自于早期胚胎、原始生殖细胞或畸胎瘤组织的干细胞。在胚胎发育中，受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团即为胚胎干细胞。具有形成该生物体所有组织和器官的能力，即“全能性”。囊胚，受精后5～7天44成体干细胞胚胎干细胞继续分化，形成的具有特定功能的干细胞如果无外加条件影响，一种组织的成体干细胞倾向于分化成该组织的各种细胞是动物体内组织和器官修复再生的基础人体内几乎所有组织都存在成体干细胞造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞……特定条件下，一种组织的成体干细胞可以“横向分化”成其他组织的细胞。45干细胞的鉴定根据干细胞的生理特征：慢周期性具有自我更新能力根据干细胞表面标志如表皮干细胞的表面标志有：整合素、CD34、角蛋白等。46干细胞技术获得干细胞系对干细胞进行体外诱导分化诱导分化细胞的永生化47干细胞技术的应用发育生物学的系统工具：研究胚胎发育过程、基因表达、遗传性疾病的发病机理等。转基因动物模型的载体体外分化模型的建立：研究与干细胞分化相关的基因及蛋白因子。治疗性克隆：得到人类胚胎干细胞，并应用于治疗疾病。药物实验研究和疾病模型建立：为新药的药理、药效及药物代谢研究提供体外模型。48思考基因工程技术的发展对于人类及自然界究竟是福是祸？49单克隆抗体的制备50动物细胞融合在自然条件下或用人工方法（生物、物理、化学等）使两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的过程。同种细胞之间、异种细胞之间细胞膜合并、染色体等遗传物质发生重组，形成一个新的有生命的细胞。常用方法：病毒诱导融合：如仙台病毒化学诱导融合：如聚乙二醇（PEG）电击诱导融合51生物导弹弹头——单克隆抗体52抗体antibody是B淋巴细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白质。主要存在于血清等体液中。能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。53抗体antibody54抗体≠免疫球蛋白抗体：生物学及功能概念。免疫球蛋白：结构及化学概念。所有抗体都是免疫球蛋白。并非所有免疫球蛋白都是抗体。55单克隆抗体？56抗原B淋巴细胞浆细胞抗体分泌刺激分化特异性结合57抗原决定簇又称抗原表位决定抗原性的特殊化学基团抗原物质的表面或内部一个天然抗原物质可有多种和多个决定簇58抗原决定簇1种抗原决定簇1个B淋巴细胞克隆1种特异性抗体59单抗与多抗由一种抗原决定簇刺激机体，从而产生的只针对该抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。

单克隆抗体monoclonalantibody，mAb多克隆抗体polyclonalantibody，pAb60单克隆抗体技术用骨髓瘤细胞与经特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术。61抗原1234脾B细胞1234骨髓瘤小鼠取腹水骨髓瘤细胞细胞融合经HAT培养基筛选得到杂交瘤细胞Ab1抗血清Ab1Ab2Ab3Ab4Ab2Ab3Ab4普通抗血清（多克隆抗体）单克隆抗体Ab1Ab3Ab4Ab262动物免疫分离脾细胞制备骨髓瘤细胞细胞融合HAT培养基选择杂交瘤细胞阳性细胞克隆化并扩大培养再次克隆克隆扩大培养扩大培养收集上清液动物接种收集腹水单克隆抗体纯化保存ELISA测血清63思考题有多少种细胞将经过HAT培养基的筛选考验？64细胞DNA合成的两条途径从头合成途径：由戊糖和磷酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的还原辅助因子参与反应。补救合成途径：在次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶核苷（T）存在下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化下合成DNA。65HAT培养基的作用机理H次黄嘌呤A氨基蝶呤T胸腺嘧啶核苷氨基蝶呤(A)是叶酸类似物，可以抑制二氢叶酸还原酶，从而使叶酸得不到补充而耗竭，导致细胞无法经从头合成途径合成DNA。66HAT培养基的作用机理骨髓瘤细胞是HGPRT缺陷细胞，自身不能通过补救合成途径合成DNA而增殖。B淋巴细胞虽含有HGPRT，但不能在体外培养无限期存活（只存活5~7d）。杂交瘤细胞由B细胞和骨髓瘤细胞融合而成，可利用B细胞的HGPRT通过补救合成途径合成DNA而存活。67HAT培养基的作用机理HGPRT缺陷DNA补救合成途径杂交瘤细胞DNA补救合成途径DNA补救合成途径DNA从头合成途径氨基喋呤抑制叶酸氨基喋呤抑制叶酸氨基喋呤抑制叶酸DNA从头合成途径DNA从头合成途径骨髓瘤细胞B细胞寿命仅5～7d68丹麦1911~1994提出免疫学系统基本知识德国1946~1995第一次制备了单克隆抗体阿根廷1927~2002第一次制备了单克隆抗体69有限稀释法：将细胞悬液逐次稀释后加入培养孔，可获得单个细胞形成的克隆，选择高分泌抗体的细胞株扩大培养或冻存。显微操作法：在倒置显微镜下吸出单个细胞培养。软琼脂平板法：细胞克隆形成后用显微操作法