定稿 大豆异黄酮组论文 二等奖

正丁醇/水双液相体系提取豆粕中的大豆异黄酮张国峰李浩泉傅泽林许银周言李金阳周锦兰*（华中科技大学化学与化工学院，武汉430074）摘要本文以正丁醇/水双液相体系萃取豆粕中的大豆异黄酮，对液料比、液液比、温度、以及pH值等四个主要因素进行了实验条件优化。实验确定正丁醇：水体积比为2：1,液料比为8：1,温度为60°C,pH值为1作为最佳条件，在此条件下豆粕中大豆中异黄酮的单次提取量为2.31mg/g。与文献报道乙醇体系相比较，此法具有有机溶剂用量少，提取时间短，异黄酮提取率略高及容易除去浸出蛋白质等优点。关键词大豆异黄酮，萃取，双液相溶剂体系ExtractingIsoflavonesfromSoybeanMealusingn-butanol/watertwo-phasesolventsystemZhangGuo-feng,LiHao-quan,FuZe-lin,XuYin,ZhouYn,LiJin-yang,ZhouJin-lan*(SchoolofChemistryandchemicalengineering,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430074)Abstract：Inthepresentstudy，anewprocesswasdevelopedtoobtainisoflavonesfromsoybeanmealusingn-butanol/watertwo-phasesolventsystem.Optimumexperimentalconditionswereestablishedusingthesinglefactorexperiments.Withn-butanol/waterratioof2:1(v/v),liquid/solidratioof8:1(v/w),T=60CandpH=1,thesingleextractionofisoflavonesreachedthehighestvalueof2.31mg/g.Therefore,superiorresultswereachievedforusinglessorganicsolvent,shorterextractiontimeandeasyeliminationofthelixiviatedprotein,comparedwiththeethanolsolventsystemreportedKeywordsSoybeanisoflavone，Extraction，Two-phasesolventsystem1•引言大豆异黄酮(soybeanisoflavone)是大豆生长过程中形成的一类次生代谢产物，在自然界中的主要存在形式为染料木苷(Genistin)、染料木黄酮(Genistein)、黄豆苷(Daidzin)和黄豆苷元(Daidzein)等12种成分，可分为三个系列，每个系列都包括游离型苷元，糖苷型异黄酮，乙酰基糖苷异黄酮和丙二酰基糖苷异黄酮四种形式⑴，其骨架结构如图1。研究表明，大豆异黄酮具有很多重要的生理功能，如降低血液胆固醇,防止骨质疏松，抑制癌细胞生长，预防心血管疾病，作为雌性激素治疗药物的替代品，改善妇女更年期综合症等⑵。它因其独特的生物学活性而越来越受到社会和学术界的关注，是近年来研究的热点。但在自然界中大豆异黄酮资源十分有限，在含量较高的大豆中也仅含0.1%〜0.5%,因此探讨一条大豆异黄酮高提取率高纯度的工艺路线具有十分重要的意义。图1:大豆异黄酮的骨架结构国内外学者已对豆粕中大豆异黄酮的提取方法进行了一些相关研究，提取方法有有机溶剂萃取法⑶、超声波萃取法⑷、微波辅助萃取法⑸、超临界萃取法等［矶文献报道的溶剂萃取方法所用的溶剂是乙醇、甲醇和丙酮等，用这些有机溶剂萃取时存在溶剂消耗大、耗时、提取率低和产物杂质多等问题，故在工业生产中受到了较大的限制⑺。因此，改进豆粕中大豆异黄酮的提取方法，寻找合适的萃取溶剂对充分利用大豆异黄酮尤为重要。双液相体系用来提取天然物中活性成分的方法是一种较新颖的方法⑻，是一种有效的萃取技术，但未见用于豆粕中大豆异黄酮萃取分离的报道。本文以正丁醇/水双液相为萃取体系，探究了一种简单、高效、方便的萃取大粕中大豆异黄酮的方法。2•实验部分2.1仪器与试剂大豆：市售；石油醚（沸程60°C〜90°C）；正丁醇（99.0%）；CH3COOH,CH3COONH4,NH4C1，NH3・H2O等均购于上海国药集团；AR。染料木素（Genistein）,成都曼斯特公司。DF-101S集热式恒温磁力搅拌器；日本岛津UV2550紫外分光光度计等。2.2样品处理2.2.1豆粕的预处理将市售大豆粉碎，研磨之后，经50目筛子筛分，然后用索氏提取器以石油醚（沸程为60C~90C）为溶剂在微沸状态下脱脂8小时，继而干燥所得的豆粕，并密封干燥避光保存，备用。2.2.2大豆中大豆异黄酮的提取准确称取3g左右脱脂大豆粉于50ml烧瓶中，加入不同比例的正丁醇和水，构成双液相体系，浸泡烧瓶中豆粕过夜。在实验设定条件下放入控温磁力搅拌器中搅拌，分离得上层有机萃取液，用含水饱和的正丁醇溶液定容至50mL，取1mL定容液稀释到25mL,测定不同条件下的萃取液的吸光度值。2.2.3大豆异黄酮在水饱和的正丁醇溶液中的工作曲线大豆异黄酮含量测定采用紫外分光光度法⑼。准确称取5.2mg染料木素于50ml容量瓶中以含水饱和的正丁醇溶液定容，得染料木素的标准储存液。然后分别移取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml标准储备液稀释到25m1。以水的饱和正丁醇溶液作参比，将标准液在波长200-400nm条件下扫描，在264nm波长下有最大吸光度值。测定不同含量标准物在264nm的吸光度值A,得标准曲线，如图2：

3结果与分析3.1液料比的影响异黄酮的萃取率主要受液料比，两相体积比(Vbl:VH2O),水相pH值，萃取温度等因素的影响。n-butanolH2O我们以vb1:VH2O=2:1、水相pH=7、在室温下用6：1到10：1的液料比进行实验。结果见表1。n-butanolH2O表1:液料比的影响Vn-butanol:VH2O液料比pHT/°CA2：16：17RT0.4512：17：17RT0.4722：18：17RT0.5012：19：17RT0.4702：110：17RT0.434实验结果表明：在本体系中，大豆异黄酮的得率在液料比为8：1时出现峰值(即吸光度值最大)，故确定其为体系的最佳液料比。3.2两相体积比(Vbtl：VH2O)的影响n-butanolH2O控制因素液料比为8：1、水相pH=7、在室温下分别用Vbl:VH2O=1：1、2：1和3：1进行实验,n-butanolH2O实验结果如表2：表2：两相体积比(Vb1:VH2O)的影响n-butanolH2OV/vtt液料比pHT/CA11UU.LIX11U1 JL1:18:17RT0.4212:18:17RT0.5013:18:17RT0.517分析结果可以发现，在不同条件下，随着Vb 1/VH2O的增加，提取率上升，但后来趋近平缓且增加n-butanolH2O幅度不大。同时实验中发现完全以正丁醇作为萃取剂时，A=0.294,得率也仅为1.01mg.g-1。说明本体系中水相起着至关重要的作用。在Vbl:VH2O=2:1和3：1两者的萃取效率相差不大，综合考虑生产成本n-butanolH2O和减少有机溶剂的用量等因素，选择2：1作为体系的最佳液液比。3.3水相pH值对提取率的影响控制液料比为8：1、Vb1:VH2O=2:1，在室温下分别用缓冲溶液控制水相pH=l、3、5、7、9、n-butanolH2011,探究水相的pH对得率的影响。结果见表3。表3：水相pH值对提取率的影响7、.、/Vtt液料比pHT/°CAnuuLanui 丄丄2^02:18:11RT0.6332:18:13RT0.6162:18:15RT0.5882:18:17RT0.5172:18:19RT0.5102:18:111RT0.501分析图表可以看出随着pH增大，吸光度值呈下降趋势。这是因为异黄酮分子中含有多个酚羟基no］，使其具有一定的酸性，在酸性的溶液中大豆异黄酮容易析出，有利于萃取，故得率提高。3.4提取温度的影响在30〜80°C下进行实验，随着温度的升高，在40°C、50°C与60°C〜70°C下分别形成两个小的平台，而70°C后有下降趋势，这是由于异黄酮是热敏性物质，长时间的高温会导致异黄酮会发生部分降解，而且在较低温下提取更加节约能源，故确定60C为最佳提取温度，结果如下表4：表4：温度的影响影响V,/V液料比pHT/C Anbutanol H2O 2：117300.5422：117400.5912：117500.5932：117600.6242：117700.6222：117800.590综合上述实验结果，我们确定最佳的萃取条件为：T=60°C,液料比为8：1，Vbl:VH2O=2：1，n-butanolH2OpH=1。在此条件下，重复实验得：A=0.724,经计算的所选大豆中的大豆异黄酮的含量为2.47mg/g。3.5正丁醇冰双液相体系与乙醇体系萃取效率的比较为比较正丁醇/水双液相萃取液体系与乙醇萃取的异同，我们将丁醇/水双液相为萃取条件定为：Vbl:Vh2o=2：1，液料比8：1，pH=1，在60C条件下提取1h，重复提取2次；将乙醇萃取体系条件n-butanol H2O 丄按照参考文献［10］，即：Vhl:VH2O=5：1，液料比15：1，萃取温度为80C，提取3h,重复提取2次。ethanolH2O实验结果如图3：

二SecondYield3.02.52.01.51.00.50.03.18mg/g二SecondYield3.02.52.01.51.00.50.03.18mg/gn-Butanol/water3.07mg/g80%ethanol图3：正丁醇/水双液相体系与乙醇体系萃取效率比较从上图可以看出：按上述萃取条件用正丁醇/水体系、乙醇/水体系分别对豆粕进行两次萃取，正丁醇/水双液相体系总得率略高于乙醇体系。与乙醇法相比，本方法具有明显的优点：(A)可节约大量的有机溶剂；(B)极大地缩短了提取时间。(C)乙醇法由于蛋白质易与异黄酮发生缔合作用而影响异黄酮的精制［in，而本体系因水相存在，大部分蛋白质溶于水层后可以直接通过分液去除，给后续提纯带来便利。4结论本研究通过单因素实验实验设计，探索了在正丁醇冰(n-butanol/H2O)双液相提取体系中，液料比、液液比、提取温度、水相pH四个因素分别对正丁醇/水双液相体系下提取大豆异黄酮物质的影响，并对其在大豆异黄酮的提取过程中可能的影响原因对了简要的探讨。由实验结果可知：n-butanol/H2O双液相提取体系中最佳的萃取条件为：T=60°C,液料比为8：1，Vb,:Vh2o=2：1，pH=1，在此条件下所萃取豆n-butanolH20粕中大豆异黄酮的含量为2.47mg/g。参考文献1、 (a)KudouS,ShimoyamadaM,ImuraT.Anewisoflavoneglycosideinsoybeanseeds(GlycinemaxMerrill),glycitein7-0-0-D-(6"-0-acetyl)-glucopyranoside.J.Agric.Biol.Chem.,1991,55:859-860KudouS,FleuryY,WeltiD.M.isoflavoneglycosidesinsoybeanseeds(GlycinemaxMerrill).J.Agric.Biol.Chem.,1991,55:2227-22332、 (a)郭瑞华，霍文，刘正猛，等.豆豉中大豆异黄酮及苷元降血糖活性及其机理的研究•时珍国医国药，2007,18:1606-1607(b)刘亚琴，黄兆铨.大豆异黄酮抗动脉粥样硬化作用的研究进展.心脑血管病防治，2007,7(2):120-122金梅花，许惠仙，金花,等.大豆异黄酮和皂貳对结肠癌细胞增殖和凋亡的研究.大豆科学,2008,6：1028-1031Hai-boZ,Jian-tingC,QinD,etal.Theanticanceractivityofgenisteinonimplantedtumorofhumanprimarygastriecarcinomacellsinnudemice.ChineseJournalofPathophysiology,2007,23:2379-2384吴倩,金念祖,余静，等.大豆异黄酮总提取物对去卵巢裸鼠雌激素依赖型乳腺癌细胞移植肿瘤的影响.科学通报，200&53:2754-2759张录，刘秀丽，陈颖，等•大豆异黄酮对更年期妇女骨质疏松作用的临床研究•中国医药指南,2009,7:41-42刘静,苏宜香,邓娟，等.大豆异黄酮干预对妇女骨密度影响的META分析.营养学报,2008,30:502-5073、 (a)蔡立,郁建平，占建波.豆粕中大豆异黄酮提取纯化工艺研究•食品科学,2008,29:185-188(b)郭睿，姚占静,张春生，等.大豆异黄酮提取工艺研究•陕西科技大学学报,200&2:68-714、 谢明杰，宋明，邹翠霞，等•超声波提取大豆异黄酮•大豆科学，2004,23:75-76.5、 (a)丁兰，李毅，李敏晶，等•一种新型微波辅助萃取法用于中药刺五加中总黄酮萃取的研究•高等学校化学学报，2003,24:1403-1405(b)张永忠，石冬冬•微波法预处理提取大豆异黄酮的研究.粮油食品科技，2003,11:8-10.6、 RostagnoMA,AraujoJMA,SandiD.Supercriti