叶绿素定量测定

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实验二十叶绿素含量的测定

叶绿素的含量与植物光合作用及氮素营养有亲近的关系，在科学施肥、育种及植物病理研究上常有测定的需要。

方法Ⅰ

一、目的

掌握叶绿素含量测定的基本源理和方法。

二、原理

叶绿素与其他显色物质相同，在溶液中如液层厚度不变则其吸光度与它的浓度成必定的比率关系。已知叶绿素a、b在652nm波长处有相同的比吸取系数（均

为34.5）。因此，在此波长下测定叶绿素溶液的吸光度，即可计算出叶绿素a、b的总量。

三、资料、仪器设施及试剂

资料：菠菜叶；芥菜叶或其他植物叶片。

仪器设施：电子解析天平；分光光度计；漏斗；25ml容量瓶；剪刀；滤纸；玻棒等。

试剂：95﹪乙醇、石英砂、碳酸钙粉。

四、实验步骤

叶绿素的提取

称取植物鲜叶0.20g（可视叶片叶绿素含量增减用量），剪碎放入研钵中，加少量碳酸钙粉和石英砂及3～5ml95﹪乙醇研成匀浆，再加约10ml95﹪乙醇稀释研磨后，用滤纸过滤入25ml容量瓶中，此后用95﹪乙醇滴洗研磨及滤纸至无绿色为止，最后定容至刻度，摇匀，即得叶绿素提取液。

测定

取光径为1cm的比色杯，倒入叶绿素提取液距杯口1cm处，以95﹪乙醇为空白比较，在652nm波长下读取吸光度（A）值。

五、计算

将测得的吸光度A652值代入公式(1),即可求得提取液中叶绿素浓度。所得结果再代入公式(2)，即可得出样品中叶绿素含量（－1mg·gFw）。A652C(mg·ml－1)=————（1）34.5公式中：C—叶绿素（a和b）的总浓度

A652—表示在652nm波长下测得叶绿素提取液的吸光度

34.5为叶绿素a和b混淆溶液在652nm波长的比吸取系数（比色杯光径1为1cm,样品浓度为1g·L时的吸光度）。

C（mg·ml－1）×提取液总量（ml）－1叶绿素含量（mg·gFw）=————————————————（2）

样品鲜重（g）

方法Ⅱ

一、目的

掌握叶绿素a、b含量测定的基本源理和方法。

二、原理

叶绿素a、b分别在663nm和645nm波长处有最大的吸取峰，同时在该波长处叶绿素a.、

b的比吸取系数K为已知，我们即能够依据Lambert－Beer定律，列出浓度C与吸光度A之间的关系式：

A663=82.04Ca+9.27Cb(1)A=16.75Ca+45.6Cb(2)645（1）、（2）式中的A663.A645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时测得的吸光度。－1。C、C为叶绿素a、b的浓度，单位为mg·La、b82.04、9.27为叶绿素a、b在波长663nm下的比吸取系数。16.75、45.6为叶绿素a、b在波长645nm下的比吸取系数。解（1）、(2)式联立方程，得：(3)C=12.70A663–2.69A645aCb=22.9A645–4.68A663(4)CT=Ca+Cb=20.21A645+8.02A663(5)

Ca、Cb为叶绿素a、b的浓度,CT为总叶绿素浓度，单位：（mg·L－1），.利用上面(3)、（4）、（5）式能够分别计算出叶绿素a、b及总叶绿素浓度。

三、资料、仪器设施及试剂

资料：菠菜叶、芥菜叶或其他植物叶片

仪器设施：电子解析天平；分光光度计；恒温水浴锅；25ml刻度试管；剪刀；试管；试管架；玻棒等。

试剂：80﹪乙醇。

四、实验步骤

叶绿素的提取

从植株上采用有代表性的叶片数张（除掉粗大叶脉）剪碎后混匀，迅速称取

0.2g(可视样品叶绿素含量高低而增减用量)，置于25ml刻度试管中，加80﹪乙

醇10ml左右，加塞放入60～80℃水浴中保温提取叶绿素（或常温下放在暗处浸提12～24h），至叶片全部褪绿为止，冷却后，用80﹪乙醇定容至刻度，此液即为叶绿素提取液。

测定

取光径为1cm的比色杯，加入叶绿素提取液距比色杯口1cm处，以80﹪乙醇

作为比较，分别于663nm及645nm波长下测定吸光度（A）值。五、结果计算

将测定获取的吸光度A663、A645值分别代入上面(3)、(4)、（5）式计算出Ca、Cb及

CT(即叶绿素a、b及叶绿素总量浓度)。再按下式计算出叶绿素a、b及叶绿素总含量。

Ca×提取液总量(ml)－1叶绿素a含量（mg·gFw）=—————————————

样品鲜重（g）×1000

Cb×提取液总量(ml)－1叶绿素b含量（mg·gFw）=———————————