酶活力测定课件

第十一章、酶活力测定

11/1/20221第一节、α-淀粉酶活力测定

1、作用2、分类3、测定方法11/1/20222一、分光光度法

１.原理α-淀粉酶广泛存在于植物、哺乳类动物和微生物中。能将淀粉分子链中的α-１,４葡萄糖甘键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈篮紫色的特异性反应迅速逐渐变红棕色直至消失，其颜色消失的速度与酶活力有关，故可通过测定反应后吸光度计算其酶活力．11/1/20223３.测定步骤待测酶液的制备：称取酶粉1.000g（或吸取液体酶1.00ml），先用少量的pH6.0缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此反复捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（将酶液稀释至被测试液吸光度在0.12-0.36范围内），摇匀。同过四层纱布过滤，滤液为待测酶液。11/1/20225酶活力测定：吸取可溶性淀粉溶液20ml与试管中，加入pH6.0缓冲液5ml，摇匀后于60℃恒温水浴中预热10min。加入稀释好的待测酶液1ml。立刻计时，摇匀，准确反应5min。立刻吸取反映液1ml于稀碘液作空白波长660nm，1cm比色皿，迅速测定吸光度（A）根据吸光度查表，求得测定酶液的浓度（c）。11/1/20226

４.计算酶活单位定义：在60℃，pH6.0条件下，1h液化1g可溶性淀粉的酶量为1个酶活力单位。α-淀粉酶活力（u/g或u/mL）=c×n式中c----测试酶液的浓度（u/ml）；n----样品的稀释倍数。以结果表示至整数。11/1/20227二、目视比色法

１.原理α-淀粉酶水解淀粉为小相对分子质量的糊精和少量的麦牙糖及葡萄糖，使淀粉与碘呈蓝紫色反映逐渐变红棕色直至消失，观察并测定颜色的消失速度可以衡量酶活力的大小。11/1/20228３.测定步骤：待测酶液的制备：同“分光光度法”测定：取2ml标准终点色溶液于白瓷板孔穴内，作为比较颜色的标准，其余孔穴各加1.5ml稀碘液。吸取可溶性淀粉溶液和5mLpH6.0缓冲液于试管中。在60℃恒温水浴中预热10min。然后准备加入0.5mL稀释酶液，立即记时。充分摇匀。定时用滴管取出约0.5mL反应液，滴入盛有稀碘液的白瓷板空穴内，当孔穴内颜色由蓝紫色逐渐变为与标准终点色（红棕色）相同时即为反应终点，记录反应时间t（min）。11/1/202210５.讨论（1）商品α-淀粉酶粉剂活力为1500～2500u/g，稀释倍数一般为100～200倍。（2）可溶性淀粉的质量对α-淀粉酶活力有一定影响，为统一起见，可溶性淀粉采用浙江菱湖淀粉厂产的酶制剂专用可溶性淀粉。。

11/1/202212２.试剂（1）pH4.60.1mol/LHAc缓冲液；（2）0.05mol/LNa2S2O3标准溶液，称取13gNa2S2O3·5H2O和0.2gNa2CO2，用新鲜煮沸过的冷水溶液并稀释至1000mL配制一周后以碘酸钾（或重铬酸钾）标定。（3）0.1mol/L碘溶液，棕色瓶保存。（4）1mol/L硫酸溶液。（5）0.1mol/LNaOH溶液。（6）20g/L可溶性淀粉溶液。（7）200g/LNaOH溶液。（8）10g/L淀粉指示剂。11/1/202214二、物理化学分析法３.测定步骤待测酶液的配制，称取酶粉，准确至0.0002g（或吸取液体酶1.00mL），先用少量的乙酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上清夜小心倾入适当的容量瓶中。沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。通过四层纱布过滤，滤液供测定用。11/1/202215酶活力测定：于甲、乙两支比色管中，分别加入可溶性淀粉溶液25ml和PH4.6乙酸缓冲液5ml，摇匀后至40℃恒温水浴中预热5min。在甲管（样品）中加入待测酶液2ml，立刻摇匀，在此温度下准确反应30min,立刻各加NaOH溶液0.2ml，摇匀。将两管取出迅速冷却，并于乙管（空白）中补加待测酶液2ml。吸取上述反应液各5ml，分别置于碘量瓶中，准确加入碘溶液10ml，再加0.1mol/LNaOH溶液15ml，摇匀，密塞，于暗处反应15min。取出，加1mol/L硫酸溶液2ml，立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定，直至蓝色刚好消失为其终点。不同稀释倍数，应做相应的空白试验。11/1/202216４.计算酶活单位定义：在上述条件（40℃、PH4.6）下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位。糖化酶活力（u/g或u/ml)=(V1-V2)×c×90.05×32.2/5)×(1/2)×n×211/1/202217式中V1—空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积（mL）；V2—样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积（mL）；C—Na2S2O3标准溶液的浓度（mol/L）；90.05—与1.00mL1mol/LNa2S2O3标准溶液相当的以g表示的葡萄糖的质量；32.2—反应液的总体积（ml）；

11/1/202218第三节蛋白酶活力测定

１.原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解底物酪蛋白，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）。在碱性条件下，Folin-酚试剂极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝与钨蓝，在一定范围内，蓝色的深浅与酪氨酸的浓度成正比。这样，可以利用测定蛋白酶在单位时间内催化酪蛋白产生的酪氨酸的量求得蛋白酶的活力。11/1/202220２.试剂Folin-酚试剂见“蛋白质含量测定”。0.4mol/L碳酸钠溶液。0.4mol/L三氯乙酸溶液。缓冲溶液①PH7.5磷酸缓冲液，适用于中性蛋白酶。②pH3.0乳酸缓冲液，适用于酸性蛋白酶。③pH10.5硼酸缓冲溶液，适用于碱性蛋白酶。上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。

11/1/202221３.测定步骤（1）标准曲线的绘制取9支干燥试管，分别加入酪氨酸标准溶液0，1，2，3，4，5，6，7，8mL,补水至10mL,混匀后，从中分别取溶液1mL,各加0.4mol/L碳酸钠溶液5mL、（1+2）Folin-酚试剂使用溶液1mL,置于40℃水浴中显色20min，取出，于680nm波长，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0号管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。11/1/202223（2）待测酶液的制备称取酶粉1-2g，准确至0.0002g（或吸取液体酶1ml），用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清夜小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲爷，如此溶解、捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀释至适当浓度，供测试用（稀释至被测试液吸光度在0.25-0.40范围内）。11/1/202224试管A（空白）试管B（酶样试剂，需作加酶液1ml加酶液1ml40℃，2min40℃，2min加三氯乙酸2mL（摇匀）加酪蛋白1mL（摇匀）40℃，10min40℃，10min加酪蛋白1mL（摇匀）三氯乙酸2mL（摇匀）取出静置10min,过滤；取1mL滤液；加碳酸钠溶液5mL；加Folin-酚试剂使用液1mL；40℃，显色20min；于680nm波长，比色皿测其吸光度11/1/202226４.计算酶活力单位定义：在上述条件下，1min水解酪蛋白产生1ug酪氨酸的酶量为一个酶活力单位蛋白酶活力（u/g或u/mL）=A×K×4/10×n式中A—样品平行实验的平均吸广度；K—吸光常数；4—反应液的总体积（mL）；10—反应时间10min，以1min计；n—稀释倍数。11/1/202227５.讨论（1）酪蛋白配制应严格按操作方法，否则影响测定结果。（2）若测定固体曲霉时，一般稀释200～500倍；酶液则要稀释500倍为宜。11/1/202228２.试剂（1）底物溶液的制备①称取聚乙烯醇②量取40g/LPVA溶液150mL，加橄榄油50mL用高速组织，捣碎机搅动6min（分2次搅动，每次3min，中间休息5min），即成乳白色PVA乳化液。该溶液宜现用现配。如贮存在冰箱中，有效期为1周。（2）pH7.5、0.025mol/L磷酸缓冲液11/1/202230（3）0.05mol/LNaOH标准溶液。（4）5g/L酚酞

11/1/202231３.测定步骤（1）待测酶液的制备：根据估测酶粉活力再进行稀释，一般是酶活力4000、5000、6000u/g，稀释倍数分别为600、750、900倍。酶液容度应控制在样品与对照消耗碱量之差在2～5mL范围内。11/1/202232（2）酶活力的测定取两个100mL烧杯，于第一个空白杯和第二个样品杯中各加底物溶液4mL和0.025mol/LpH7.5磷酸缓冲液5mL，再于空白杯中加入95%乙醇15ml，于40℃水浴中预热5min，然后于两杯中，各加待测酶液1ml，立即混匀计时，在40℃水浴中准确反应15min，于样品中立即补加95%乙醇15ml终止反应，取出。在烧杯中放一枚转子，置于电磁搅拌器上，在搅拌下，用0.05mol/LNaOH标准溶液滴定至PH10.3，为起终点，记录消耗0.05mol/LNaOH标准溶液的体积。11/1/202233②指示剂滴定法：取两个100ml三角瓶，分别于空白瓶和样品瓶中各加底物溶液4ml和磷酸缓冲液5ml，再于空白瓶加入95%乙醇15ml，于40℃水浴预热5min。然后，在两瓶中各加待测酶液1ml，立即混匀计时，在40℃水浴中准确反应15min，在样品瓶中立即补加95%乙醇15ml终止反应，取出于空白瓶和样品瓶中各加酚酞指示液2滴，用0.05mol/LNaOH标准溶液的体积。用0.05mol/LNaOH标准溶液滴定,直至微红并保持30s不退为其终点,记录消耗0.05mol/LNaOH标准溶液的体积.11/1/202234４.计算酶活力定义：在上述条件（40℃，pH7.5）下，1min催化脂肪水解产生1umol脂肪酸的酶量为一个酶活力单位。脂肪酶活力（u/g或u/mL）=（V1-V2）×c×1/0.05×50×1/15×n×（V1-V2）×c×n×200/311/1/202235５.讨论用不同聚合度的聚乙烯醇测出的数据不同，故应使用同一聚合度的聚乙烯醇才能进行比较。贮放的乳化液若上层有油析出，应重新搅动呈乳化状才能使用，否则不容易被脂肪酶水解。

11/1/202236第五节葡萄糖异构酶活力测定１.原理葡萄糖异构酶正确的名称是木糖异构酶，能将D-木糖、D-葡萄糖、D-核糖等糖可逆转化为相应的酮糖。异构酶的活力尚无一种统一的测定方法，通常是以葡萄糖为底物，在一定条件下使之异构化，然后测定生成的果糖。或者以果糖为底物，经异构化反应后测定所生成的葡萄糖。果糖含量可用咔唑法测定。11/1/202237３.测定步骤⑴待测酶液的制备取2.35g湿重的乳酸杆菌细胞，加入8g氧化铝和30mLpH7.0的Tris缓冲液于组织捣碎机上捣碎，定容，离心或过滤后上清夜为粗酶提取液。⑵酶活力测定①向小试管中加入pH7.0缓冲液1.3mLLMnSO4溶液0.3mL、CoSO4溶液0.3mL和2mol/L葡萄糖溶液1mL，加入酶提取液0.1mL，反应系统中体积为3.0mL，50℃反应30min后，0.2ml100g/L三氯醋酸终止反应，用咔唑法测定生成的果糖。另取煮沸灭活酶提取液0.1mL同上操作为空白对照。11/1/202238②将酶促反应液稀释400倍后吸取1mL（果糖含量在100ug以下）放入试管，于冰浴中冷却，加入硫酸溶液6mL,激烈振荡摇匀后，加入半胱氨酸0.2mL，再摇匀后立即加入咔唑乙醇溶液0.2mL，置于40℃水浴中显色30min,取出后入冰浴中平衡20min，立即在560nm波长，试剂空白，测定吸光度Ap。另取空白对照液和标准果糖各1mL，按以上操作测其吸光度AB（空白对照）及As（标准果糖溶液）。11/1/202239第六节纤维素酶活力测定１.原理纤维素酶是一种多组分的酶，包括C1酶、Cx酶和β-葡萄糖苷酶。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素；Cx酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖；而β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3，5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的氨基化合物，用比色法测定。通常，测定滤纸酶活力可反映纤维素酶的活力。11/1/202240⑶酶活力测定①滤纸酶活力的测定：取4支20mL具塞刻度试管，各加入pH4.5的柠檬酸缓冲液，1号试管作为空白对照。2、3、4号试管中加入0.5mL酶液。各管同时在50℃水浴中预热5min，然后加入50mg滤纸条（新华定量滤纸，1cm×6cm），准确保温1h，取出后立即加入1.5mLDNS试剂（动作要迅速）以终止酶反应，并向1号管中补加0.5mL酶液。将各管充分摇匀后在沸水浴中加热5min，取出冷却后用水定容至20mL。以1号试管溶液液为空白，在540nm波长处测定吸光度11/1/202241②C1酶活力的测定：取4支20mL具塞刻度试管，各加入10mL脱脂棉，加入1.5mLpH5.0、0.05mol/L的柠檬酸缓冲液，1号试管作为空白对照。将各管同时在45℃下预热5min，向2、3、4号试管中加入0.5mL酶液混匀，在45℃下保温24h。保温结束后立即向各管中加入1.5mLDNS试剂以终止酶反应，并向1号管中补加0.5mL酶液。各管充分摇匀后置沸水浴中加入5min，取出冷却后用水定容至20mL，以1号试管溶液为空白，在540nm波长处测定吸光度。计算上述3个吸光度的平均值，在标准曲线上查出相应的葡萄糖质量。

11/1/202242③Cx酶活力的测定：将酶液稀释5倍测定Cx酶活力，以CMC-Na为底物。取4支20mL具塞刻度试管，各加入pH5.0的柠檬酸缓冲液（内含0.5%CMC-Na），1号试管作为空白对照。将各