年产1000万支重组人干扰素α-2b原液生产车间工艺设计

PAGEPAGE11年产1000万支重组人干扰素α-2b原液生产车间工艺设摘 要干扰素是具有抗细胞分裂与免疫调节功能的一类蛋白质。按照细胞结构和来源可分为α、β、γ三个类型。其中现代研究证明干扰素α-2b丸剂等多种剂型，市场前景广泛。1000支重组人干扰素α-2b关键词：层析原液发酵罐车间设计IFNα2bProcessDesignofRawliquidproductionWorkshopwithanAnnualoutputof10millionRecombinantHumanInterferonα-2bABSTRACTInterferonisakindofproteinwithanti-celldivisionandimmunomodulatoryfunction.Accordingtothecellstructureandsourcecanbedividedintoα、β、γthreetypes.them,modernresearchhasprovedthatinterferonα-2bhasobviousclinicaleffectinthetreatmentoftumor,fungalskindisease,rheumatoidarthritisandotherdiseases.TheinclusionbodywasobtainedbyusingrecombinantE.coliculture,andtheinclusionbodywaspurifiedbycomplexpurification.Fromtheoriginalliquidcanbemadeintoinjection,powder,gel,suppository,pillsandotherdosageforms,themarketprospectsarewide.Basedontheresearchonthepreparationandpurificationofrecombinanthumaninterferonrecentyears,anannualproductionworkshop α-2b10millionrecombinanthumaninterferonwasdesigned.Keywords:laminaranalysis stoste fermentert plantdesign IFNα2b目 录绪论 4重组人干扰素概述 4行业市场发展概况 4重组人干扰素相关研究方向 4全厂工艺流程 5车间工艺设计标准 5原液检定主要标准 5成品检定主要标准 5工艺用水主要标准 6原辅料简介 6重组干扰素α-2b 6培养基 6大肠杆菌裂解液配方 7变性剂 4阴离子层析柱 7阳离子层析柱 8凝胶层析柱 8注射剂辅料 8基本工艺流程图 8生产流程要点 8种子复苏与扩大培养 8发酵罐发酵 9破菌与包涵体洗涤 9包涵体变性 9包涵体复性 9蛋白质分离纯化 9设计工艺计算 9全场物料衡算 10工艺指标 10200L发酵罐生产干扰素物料衡算 10种子发酵罐物料计算 10发酵车间相关物料计算 11破碎车间相关物料计算 11分离纯化车间相关物料计算 12生产一批注射剂物料衡算 13年产1000万支干扰素α-2b生产物料衡算 14全车间热量衡算 16发酵工艺流程图 16种子罐单次培养耗热量Q1 16发酵罐单次发酵消耗热量Q2 16注射用水工艺耗热量Q3 17单次蒸气灭菌耗热量Q4 17单次发酵总耗热量Q总 17热量单耗 17全车间无菌压缩空气衡算 17单发酵罐每小时无菌空气用量V1 17每小时其他无菌空气耗量V2 17发酵间每小时最大空气耗量Vmax 18无菌空气单耗 18全车间用耗冷衡算 18分离纯化耗冷量Q1 18破碎耗冷量Q2 18单次发酵总耗冷量Q总 18全车间单耗冷量 18工艺用水衡算 19注射用水量W1 19各车间主要设备选型 20发酵间设备 20种子罐 21发酵罐 21高速剪切均质机 21分离纯化间设备 21灌装间设备 23水系统 24蒸汽发生器 25离心机 25灭菌设备 26车间设计与布局 276.总结 28参考文献 29谢 辞 28附 录 错误!未定义书签。绪论重组人干扰素概述重组人干扰素（IFN杆菌工程菌中，经过发酵、裂解破菌、变性、复性、分离纯化后得到的具有免疫调节、抗细胞分裂与广谱抗病毒的低分子糖蛋白物质。按细胞来源与氨基酸组成分为aβ型干扰素、γ型干扰素。其中α型干扰素又有二十多种亚型，由165α-2b分布在人体的第9p22区上，分子量为19237Da，氨基酸序列组成中有4半胱氨酸，其形成的两对二硫键对于干扰素的结构与生物功能起着重要作用。干扰素可以参与调节细胞抗肿瘤免疫反应，提高人体免疫功能，特别是对真菌性皮肤病有不错的疗效。行业市场发展概况现阶段国外企业主要生产的干扰素多是长效干扰素药物与具有靶向功能的干扰素药物，例如有罗氏企业生产的聚乙二醇干扰素 α-2a、拜耳制药生产的重组人干扰素β-1b、德国默克的重组人干扰素 β-1a、生原公司的重组人干扰素 β-1a。内长效干扰素市场基本被罗氏、拜耳、默克等外资企业所垄断，国内企业竞争集中在普通干扰素领域。主要厂家有三生制药、长生基因药业、长春生物制品研究所等。重组人干扰素α-2b重组人干扰素α-2b是一种胞内蛋白，在生产上制备的基本思路是：利用基因重组技术将干扰素α-2b基因导入到工程菌内，通过发酵增殖、破菌、粗提、包涵体复性、蛋白纯化，得到重组人干扰素α-2b蛋白原液。重组人干扰素的生产绝大多数是通过由细胞内表达的方式来实现的，需要的基因工程菌基本采用原核生物，少数是用人源细胞或其他动物细胞作为工程细胞。最早国内外是以大肠杆菌作为工程菌来进行研究的，所以研究成果较多也较为成熟。根据研究发现表达量主要取决于质粒的设计水平、宿主菌的选择、工艺设计、基因转录与翻译水平等方面。蒲广西等人通过利用重组毕赤酵母作为载体提高了干扰素纯度，降低了生产成本[1]；陈海宁等人通过对比酿酒酵母与大肠杆菌在表达干扰素活性方面的差异得出了用酿酒酵母要优于大肠杆菌的结论[2]；丁鹏根据毕赤酵母对个别密码子具有偏好性的特点，将干扰素α-2b3翼删除，使其降低对翻译的抑制作用提高了表达效果[3]。当前，小分子干扰素的药物半衰期短是制约干扰素药效的重要因素，所以研究长效干扰素成为了近些年来国内外干扰素研究的新趋势。除了常采用 PEG进行修外,还有采用缓释制剂、血清白蛋白融合、构建突变体等方法制作而成的缓释药品。由于技术与成本的原因，我国国内很少有企业生产长效干扰素制剂。全厂工艺流程车间工艺设计标准本课题设计年产1000万支重组人干扰素，依据我国《中华人民共和国药品管理法》与《中国药典（2015年版）》中的相关内容作为工艺设计的基本要求与原则指导。原液车间工作内容基本包括：种子复苏、种子扩大培养、发酵罐发酵、蛋白质纯化，并考虑相关辅助工艺配套设施。按《药品生产质量管理规范》要求设计。原液检定主要标准表2—1原液检定标准项目 标准DNA（1瓶宿主蛋白残留量/每纯度细菌内毒素残余抗生素活性分子量紫外光谱成品检定主要标准

≤10ng≤蛋白质总量的0.10%≥1.0X108IU≥95.0%300IU不应有抗生素活性检出19.2kD±1.9kD最大吸收波长为278±3nm项目外观PH项目外观PH标准应为澄明液，无可见异物6.57.5或符合批准的要求渗透压摩尔浓度生物学活性（1支/残余抗生素活性工艺用水主要标准

符合批准的要求应为标示量的80%〜150%＜10EU不应有抗生素活性检出生产中纯化水和注射用水至少满足以下标准：项目 标准性状 应为澄明液，无可见异物，无项目 标准性状 应为澄明液，无可见异物，无PH值 应为5.0〜7.0氨 不得超过0.00002%硝酸盐 不得超过0.000006%亚硝酸盐 不得超过0.000002%电导率 符合纯化水温度与电导率限度对照总有机碳 不得超过0.50mg/L不挥发物 遗留残渣不得超过1mg重金属 不得过0.00001%细菌内毒素 0.25EU微生物限度 100ml供试品中需氧菌总数不得过10cfu。其中原水质量符合国家标准 GB5749-2006《生活饮用水卫生标准》，工艺用质量符合《中国药典（2015年版）》。原辅料简介重组干扰素α-2bIFNα-2b行菌种库的建立与保藏。生产的时候先取出保藏菌种活化复苏，将其培养传代得到二代种子液参与后续生产发酵即可。培养基选用LB培养液作为实验室条件培养使用，所用的 LB培养液基配方如下：纯水，10g/L的蛋白胨,5g/L的酵母提取物,10g/L的NaCl，调节PH至7.0。种子液发酵与大规模发酵培养采用分批流加的方式添加物料，工业上常使用富含大量胰蛋白胨和酵母提取物的 SB培养基用于发酵。配制方法为:含5.0g/L的葡萄糖，35.0g/L的蛋白胨,20.0g/L的酵母提取物，1g/L的消泡剂，5g/L的NaCl，在后续发酵中还需要添加 400g/L的葡萄糖补料液提供发酵所需的糖类来源。调节 至7.0用纯化水配制好后灭菌。SB培养液中的酵母可以提供微量元素与生长因子，NaCl可用调节渗透压与提供无机盐离子，蛋白胨与氨基酸提供主要的氮源。大肠杆菌裂解液配方大肠杆菌裂解与包涵体初提方法参考相关研究 [4。洗涤剂包括：磷酸缓冲盐溶液（10mmol/L的磷酸氢钠，2mmol/L的磷酸二氢钾，13mmol/L的NaCl，2.7mmol/L的KCl，2%的脱氧胆酸钠，调节 PH至7.4，定容至1L）；洗涤液A（1.0mmol/L的聚乙二醇辛基苯基醚，1.2g的Tris-HCl6.0g的尿素调节PH至8.0定容至100ml；洗涤液B（2.0mmol/L的聚乙二醇辛基苯基醚，1.2g的Tris-HCl，12.0g的尿素，调节PH至8.0，定容至100ml）。变性剂表2—4变性剂配制配方名称盐酸胍β-巯基乙醇配制浓度6mol/L5mmol/LTris-HCl50mmol/L2.2.5阴离子层析柱PH8.0层析柱介质采用DEAE-琼脂糖凝胶FF各缓冲液配制配方如下：表2—5阴离子层析缓冲液配方缓冲液名称配方名称用量PH要求平衡缓冲液盐酸胍磷酸缓冲盐溶液6mol/L50mmol/L7.0复性缓冲液盐酸胍氧化型谷胱甘肽0.6mol/L0.3mmol/L7.0还原型谷胱甘肽3mmol/L磷酸缓冲盐溶液50mmol/L洗脱缓冲液NaCl磷酸缓冲盐溶液0.5mol/L50mmol/L5.8蛋氨酸10mmol/L精氨酸10mmol/L阳离子层析柱CM-FF；平衡缓冲液：50mmol/L5.8；1mol/LNaCl，调节PH5.8凝胶层析柱层析介质采用丙烯葡聚糖凝胶 S-100，上样后用磷酸缓冲液(PH7.0）洗脱,收洗脱液体即重组干扰素α-2b原液。注射剂辅料作用络合剂作用络合剂蛋白保护剂缓冲体系成分0.04%组氨酸PH7.0的磷酸盐缓冲液基本工艺流程图种子复苏种子复苏扩大培养发酵罐发酵裂菌洗涤包涵体变性发酵车间精滤凝胶层析过滤阴离子交换层析阳离子交换层析原液冷藏分离纯化车间配液灌封灭菌质检包装干燥洗瓶灌装车间图2-1干扰素注射液工艺流程图生产流程要点种子复苏与扩大培养在超净台台内用灭菌后的接种针挑取生长正常的菌株至 300ml的LB培养液中去，37℃环境下在震荡摇床中以 200r/min转速培养6h得到一代种子。将培养好的一代种子培养基混匀。按 3%的接种量转移到种子液发酵罐中， 37℃培养24h得到代种子液。发酵罐发酵根据相关研究[5]，采用分批流加补料的方式来进行发酵。因为用恒速流加葡萄糖具有防止发酵后期大肠杆菌营养物质供应不足的问题，产物利用率高，产物表达量高，在工业生产中广泛应用。将二级种子培养液以 7%的接种量移入到发酵罐中，发酵过程中通入的洁净空气量为 30L/min；PH控制为7.0左右；发酵生长的温度保持在37℃,培养9h，升温至42℃进行诱导,在初始葡萄糖消耗后,以5.3g/(L·h)恒定速率流加400g/L的葡萄糖补料液，发酵一天后放罐进行下一步操作。破菌与包涵体洗涤经过发酵大规模增殖的重组大肠杆菌要经过细胞破碎后重组人干扰素α -2b能以包涵体形式游离于发酵液中存在。首先将发酵液在5000rpm的条件下离心10min离心后保留沉淀。以的比例在沉淀中加入磷酸盐缓冲液搅拌混匀，洗涤后继续在 5000rpm条件下离心10min重复步骤两次保证沉淀洗涤充分。加入磷酸盐缓冲液充分摇匀后用高速剪切12000rpm10minA1：50（w/v）的比例各洗涤两次，每次洗完要12000rpm10min粗提包涵体沉淀。包涵体变性将沉淀与变性液按1:10（w/v4h包涵体复性DEAE-阴离子交换层析柱使用平衡缓冲液来平衡， 然后上样，用洗涤液冲洗柱直到平衡状态后逐步减少平衡缓冲液的量并逐步增加洗涤液的量，使层析柱形成线性梯度让层析介质中的蛋白质复性。复性后的蛋白质用洗涤缓冲液来进行洗脱。收集洗脱峰并低温保存，并分别加入10mmol/L的蛋氨酸和精氨酸作为保护剂 [6]防止聚体的形成。蛋白质分离纯化复性后先采用 CM-阳离子交换层析柱上样。全部上样完后，以流动相平衡层柱。用洗脱液进行梯度洗脱收集洗脱峰。将上一步操作的洗脱峰直接经过丙烯葡聚糖凝胶S-100层析，收集洗脱液。设计工艺计算全场物料衡算工艺指标全车间按发酵车间、破碎车间、分离纯化车间来进行物料衡算根据《中国药典（2015年版）》与《生物工程工厂设计概论》一些基础参考生产数据如下：种子液发酵采用的发酵罐规格为 15L，取填充系数75%，接种量3%大规模采用的发酵罐规格为 200L，取填充系数75%，接种量7%。发酵离心后去上清得到的干重菌体量按照 0.033kg/L计算，破碎得到包涵体重量按占菌体干重8%计算，平均蛋白回收率取 51.2%[7][8][9]。蛋白表达量按照20mg/L1.0X108IU/mg损失率损失率损失率损失率洗罐水公称容积30项目名称百分比（%）项目名称百分比（%）种子液7种子液3发酵罐流加液20种子罐流加液20底料液73底料液77倒罐损失1 过滤损失 0.8破菌损失3 灌封损失 0.7200L种子发酵罐物料计算种子罐采用分批流加补料的方式发酵 24小时其中15h采用恒速流加葡萄糖补料液。使用实验室摇瓶培养的重组大肠杆菌按 3%的接种量接种到15L填料系数的种子发酵罐中去，根据工艺配方与基础工艺指标计算发酵液物料情况：1.发酵液用量：15L×75%=11.25L2.底料液用量：77%×11.25L=8.6625L（按9L配制）3.流加液用量：20%×11.25L=2.25L（按3L配制）4.摇瓶种子液用量:3%×11.25L=0.3375L(按0.5L配制）5.蛋白胨用量：10g/L×0.5L+35g/L×9L=320g6.酵母提取物用量：5g/L×0.5L+20g/L×9L=182.5g7.NaCl用量：10g/L×0.5L+5g/L×9L=50g8.葡萄糖用量：5g/L×9L+400g/L×3L=1245g9.消泡剂用量：0.6g/L×0.5+1g/L×9=9.3g11发酵车间相关物料计算采用分批流加补料发酵一天，其中 15h采用恒速流加葡萄糖补料。根据工艺方与基础工艺指标计算发酵液物料情况：1.发酵液用量：200L×75%=150L2.底料液用量：73%×150L=109.5L（按110L配制）320%×150L=30L（30L）4.发酵种子液用量:7%×150L=10.5L（按11L配制）5.蛋白胨用量：10g/L×11L+35g/L×110L=3960g6.酵母提取物用量：5g/L×11L+20g/L×110L=2255g7.NaCl用量：10g/L×11L+5g/L×110L=660g85g/L110L+400g/L30L=12550g90.6g/L11L+1g/L110L=116.6g破碎车间相关物料计算首先计算发酵完成后发酵液、磷酸盐缓冲液、洗涤液、变性剂的使用量：1.倒灌后剩余发酵液体积：150L×99%=148.5L2.发酵液菌体量：148.5L×0.033kg/L=4.9kg3.磷酸盐缓冲液用量：4.9kg×20kg/L×3=294L(按300L配制）4A4.9kg50kg/L2=490L（500L）5B4.9L50kg/L2=490L（500L）6.包涵体蛋白量：4.9kg×8%=0.392㎏7.变性剂用量：0.392㎏×10kg/L=3.92L（按4L配制）根据实际情况洗涤液 A与洗涤液B按500L用量配制，磷酸缓冲盐溶液按 用量配制，变性剂按 4L用量配制计算需要的各溶质的量：1.KCl用量：74.55g/mol×2.7mmol/L×300L/1000=60.3855g2.脱氧胆酸钠用量:2%×300000ml=60000g3.洗脱缓冲液NaCl用量:58.44g/mol×13mmol/L×300L/1000=22.7916g4.磷酸二氢钾用量：136.09g/mol×2mmol/L×300L/1000=81.654g5.磷酸氢钠用量：84.01g/mol×10mmol/L×300L/1000=252.03g6.聚乙二醇辛基苯基醚用量 :294.4g/mol×1mmol/L×500L/1000+294.4g/mol×2mmol/L×500L/1000=441.6g7.Tris-HCl用量：2×1.2g×500000ml/100+157.6g/mol ×50mmol/L×4L/1000=12031.52g8.尿素总用量6g×500000ml/100+12g×500000ml/100=90000g9.盐酸胍用量：95.53g/mol×6mol/L×4L=2292.72gPAGEPAGE2110.β78.13g/mol50mmol/L4L/1000=15.626g11.损失包涵体量：392g×3%=11.76g分离纯化车间相关物料计算填料树脂高度为柱高的 90%，样品上样前应至少平衡 3个柱体积，上样体积不超过柱体积的30%，所有层析操作洗脱液体积最多为 1柱体积，阴离子层析柱填料再生用6mmol/L盐酸胍溶液清洗3个柱床体积，再用 20%乙醇（用95%乙醇稀释制）洗3个柱床体积。阳离子层析柱与丙烯葡聚糖层析柱填料再生用 0.5的NaOH与2mmol/L的NaCl洗3个柱床体积，再用 20%乙醇（95%乙醇稀释配制）洗3个柱床体积。由附录1确定阴离子交换层析柱柱体积为 14.6L平衡缓冲液总用量43.8L(按44L配制复性缓冲液总用量43.8L(按44L配制洗脱缓冲液用量按15L配制再生液总用量87.6L（按88L配制）。层析所用的磷酸盐缓冲液配制参考《中国药典（2015年版）》，计算阴离子交换层析操作相关物料衡算：1.盐酸胍配制总用量：95.53g/mol6mmol/L44L/1000+95.53g/mol×0.6mol/L×44L=666718.8g2.氧化型谷胱甘肽配制用量 612.63g/mol×0.3mmol/L×44/1000=8.0867g3.还原型谷胱甘肽配制用量 307.323g/mol×3mmol/L×44/1000=40.56664g4.NaCl配制总用量：58.44g/mol×0.5mol/L×15L+58.44g/mol×2mmol/L44L/1000=443.44272g5.保护剂配制总用量：22.3815g+26.13g=48.5115g( 149.21g/mol10mmol/L15L/1000=22.3815g精氨酸用量为174.2g/mol×10mmol/×15L/1000=26.13g)6.NaOH总用量：0.0291mol/L×39.996g/mol×44L+0.0291mol/L×39.996g/mol×44L+0.5mmol/L×39.996g/mol×44L/1000=158690.09440g7.磷酸二氢钾用量：6.8g/L×44L+6.8g/L×44L+8.34g/L×15L=202085.1g8.磷酸氢二钾用量：0.87g/L×15L=13.05g9.20%乙醇用量：3×14.6L=4.38L（按44L配制）由附录1确定阳离子交换层析柱层析柱柱体积为 7.4L平衡缓冲液总用量22.2L（按23L配制），洗脱缓冲液总用量 7.4L（按8L配制），再生液总用量44.4L（46L配制）。层析所用的磷酸盐缓冲液配制参考《中国药典》，计算阴离子交换层析操作相关物料衡算：1.磷酸二氢钾用量：8.34g/L×23L+8.34g/L×8L=1601.28g2.磷酸氢二钾用量：0.87g/L×23L+0.87g/L×8L=167.04g3.NaOH用量：39.996g/mol×0.5mmol/L×23L/1000=0.459954g4.NaCl用量：58.44g/mol×2mmol/L×23L/1000=2.68824g5.20%乙醇用量：7.4L×3=22.2L(按23L配制）13.6L10.8L（按11L），洗脱缓冲液总用量3.6L（4L），再生液总用量21.6L（配制)。层析所用的磷酸盐缓冲液配制参考《中国药典》，计算丙烯葡聚糖层析操作相关物料衡算:1.磷酸二氢钾用量：8.34g/L×11L+6.8×4L=118.94g2.磷酸氢二钾用量：0.87g/L×11L=9.57g3.NaOH用量：39.9960.511L/1000+39.996g/mol0.1mol/L0.0291L(4000ml/100)=4.68114g4.NaCl用量：58.44g/mol×2mmol/L×11L/1000=1.28568g5.20%3.6L3=10.8L（11L）分离纯化阶段经过蛋白质变性、阴离子层析柱复性、阳离子层析柱纯化、丙烯葡聚糖层析柱纯化得到最终蛋白。综上，整个分离纯化车间物料衡算如下：1.6%交联琼脂糖用量：14.6L×90%+7.4L×90%=19.8L（按20L采购）2.丙烯葡聚糖凝胶用量：3.6L×90%=3.24L（按4L采购)3.78L的20%乙醇用95%乙醇进行稀释则消耗 95%乙醇量为（20%×(44+23+11）/95%=16.42L（按17L购买）4..78L 的 20%乙醇用 95%乙醇进行稀释则消耗注射用水量为：78L-16.42L=61.58L（按62L计算）5.目标蛋白表达量为：150L×20mg/L=3000mg=3g物料名称盐酸胍物料名称盐酸胍氧化型谷胱甘肽还原型谷胱甘肽NaCl蛋氨酸95%乙醇用量用量666.7188kg8.0867g40.56664g447.41664g22.3815g17L6%交联琼脂糖20L物料名称NaOH20%精氨酸稀释用水量丙烯葡聚糖凝胶-S100用量203.80532kg189.66g158.69524kg78L26.13g62L4L生产一批注射剂物料衡算原液车间生产的物料最终进入灌装车间进行下一阶段。注射剂规格为 1ml蛋比活性为1.0×108IU，根据《中国药典（2015年版）》其生物学活性应为标示量的80% 150%，每l㎎蛋白质比活性应不低于 1.0X108IU，以发酵一次为一批，计算注射液灌装的物料衡算。1.过滤后进入灌装车间的活性蛋白量： 3×（1-0.8%）=2.976g2.每支含有干扰素蛋白质量：6000000/1.0×108=0.06mg/支每罐纯化后的蛋白产量：20×150=3000mg每罐蛋白可生产注射剂的数量： 3000mg/0.06mg=50000支5.年产1000万支注射剂所需发酵次数：10000000/50000=200 次6.每5万支注射剂所需EDTA的量：50000支×0.4mg/1000=20g7.每5万支注射剂所需组氨酸的量： 50000支×0.3mg/1000=15g8.每5万支注射剂所需磷酸氢二钾的量： 50000支×0.866mg/1000=43.3g9.每5万支注射剂所需磷酸二氢钾量： 50000支×0.538mg/1000=26.9g10.每5万支注射剂所需注射用水量： 5000支×1ml=5000ml名称重组干扰素α名称重组干扰素αEDTA组氨酸磷酸氢二钾磷酸二氢钾注射用水投料量6000.4mg0.3mg0.866mg0.538mg1ml1000α-2b发酵间配备两个200L发酵罐轮换生产,每批次上罐发酵时间为一天，以全年生产200天计算。生产规格为 600万IU的注射剂，年产量可达到 1000万支干扰素原液车间应该配套一间破碎间和一间分离纯化间。由前述的三项生产物料衡算计算结果整理得全厂生产物料衡算表，如下所示：表3—4全车间物料衡算表物料名称单位发酵一罐所需物料年产1000万支干扰素α-2b发酵液总量L161.253.225×104底料液总量L1192.38×104流加液总量L336.6×103药瓶种子液总量L0.5100蛋白胨总量kg4.28856酵母提取物总量kg2.4375487.5NaCl总量kg1.15742231.48333葡萄糖总量kg13.7952759消泡剂用量kg0.125925.18磷酸盐缓冲液用量L2945.88×104洗涤液A用量L4909.8×104洗涤液B用量L4909.8×104包涵体蛋白量kg0.39278.4变性剂用量L3.92784KCl用量g60.38551.20777×104脱氧胆酸钠kg601.2×104磷酸二氢钾kg203.886974.07774×104磷酸氢二钾kg0.2329646.592磷酸氢钠kg0.2520350.406聚乙二醇辛基苯基醚kg0.441688.320Tris-HClkg12.031522.406304×103尿素kg901.8×104盐酸胍kg669.011521.33802304×105β-琉基乙醇g15.6263.1252×103氧化型谷胱甘肽g8.0867161.61734×103还原型谷胱甘肽g40.566648.113328×103保护剂g48.51159.7023×103蛋氨酸g22.38154.4763×103精氨酸g26.135.226×103NaOH总用量kg158.690554353.173811087×10495%乙醇L163.2×103EDTA总用量g204×103组氨酸g153×1036%交联琼脂糖L2020丙烯葡聚糖凝胶S-100L44注射用水L51×103生产注射剂支5×1041×107注：层析填料根据4.2的表4-6内容规定约每200次操作更换一次。全车间热量衡算发酵工艺流程图181837℃摇瓶培养液37℃种子液 37℃发酵增殖（7%）接种量5L/min37℃发酵增殖30L/min无菌空气18无菌空气42℃诱导表达放罐发酵罐工艺流程种子罐工艺流程图3-1发酵车间工艺流程图Q1根据工艺,种子罐中的总液量G

种子罐

为11.25L。总重量：（306.5625g+174.9375g+46.6875g+943.3125g+8.865g+11.25L ×1000g/L）/1000=12.73037㎏种子罐发酵液冷液平均温度为 18℃，而种子罐发酵液平均温度为 37℃比热C＝4.18kJ/kg·℃。故耗热量：wQ＝1

种子罐

C(37-18)＝12.73037㎏×4.18kJ/kg·℃×(37℃-18℃)＝w1011.0459854kJQ2根据工艺,发酵液总重量：G =（3937.5g+2242.5g+652.5g+12547.5+115.8g+150L ×1000g/L）发酵罐/1000=169.4958㎏发酵液平均温度为3742Cw·℃。故耗热量：Q＝G2

发酵罐

Cw(42℃－37℃)+G

Cw(3718℃)＝169.49584.18kJ/kg℃×(4237℃)+169.49584.18kJ/kg·℃×(3718℃)＝17003.818656kJQ3根据工艺纯化水制备采用反渗透工艺遂不计算纯化水耗热，已知发酵一次注射用水总耗量为1989kg，设进水平均温度为 18℃，注射用水出水平均温度 99℃，耗热量为：Q3

Cw（99℃－18℃）＝1989kg×4.18kJ/kg·℃×81℃＝673435.62kJQ4已知灭菌蒸汽平均温度为 120℃，种子罐与发酵罐总灭菌用水为 220kg，发酵使用表压为0.2MPa的饱和蒸汽进行灭菌操作，则单次蒸气灭菌耗热量为：Q=（G4

C(100℃-18℃)+G灭菌w

λ+G灭菌

C(120℃-100℃)）/95%灭菌g=（220kg4.18kJ/kg·℃×82℃+220kg2258kJ/+220kg4.23kJ/kg20℃）/95%=621872.84kJ其中水的汽化热λ=2258kJ/kgC=4.23kJ/kg·℃，ηg效率，取η＝95%（《生物工程工厂设计概论》）。Q总Q＝Q+Q+Q+Q总 1 2 3 4＝1011.0459854kJ+17003.818656kJ+673435.62kJ+621872.84kJ＝1313323.3246414kJ热量单耗据设计，每年发酵次数为200次，共生产干扰素1×107支。每天耗热量：Qd

＝1313323.3246414kJ/d总每年耗热总量：Q＝1313323.3246414kJ/d×200＝2.6266466492828×108kJa全车间无菌压缩空气衡算V12.4.230L/min3-1空气用量：V=(30L/min×60)/1000=1.8m³/h1V2种子罐用量，物料压送与管路损失按发酵罐单罐发酵过程中空气耗量的20%计算。故其他无菌空气耗量：V=1.8m³/h×20%=0.36m³/h2发酵间每小时最大空气耗量VmaxVmax=1.8m³/h+0.36m³/h=2.16m³/h无菌空气单耗据设计，每年发酵次数为200次，共生产干扰素1×107支。每支干扰素耗空气量：V＝24h×(1.8m³/h+0.36m³/h)/50000＝0.0010368m³/支s每天全厂耗空气量：V＝24h×(1.8+0.36)＝51.84m³/dd每年全厂耗空气总量：V＝51.84m³/d×200＝10368m³a综上可得，年产1000万支干扰素α-2b全车间无菌空气消耗衡算表：表3-5全车间无菌空气消耗衡算表发酵罐公单罐通气量/（L/min）其他耗量每小时最大用每天耗量年耗/称容积/L20030/（m³/h）0.36量/（m³/h）2.16/（m³/d）51.84（m³/a）10368全车间用耗冷衡算Q11kg/LG =44kg+44kg+15kg+23kg+8kg+11kg+4kg=149kg纯化设制冷前试剂平均温度为18℃，制冷后试剂平均温度为4℃，即分离纯化耗冷量：Q1

Cw(18℃-4℃)=149kg×4.18kJ/kg.℃×14℃=8719.48kJ纯化Q298L，即破碎用水冷却耗冷量为：Q2

C(18℃-4℃)=98kg×4.18kJ/kg·℃×14℃=5734.96kJ破碎wQ总Q ＝Q+Q总 1 2＝8719.48kJ+5734.96kJ＝14454.44kJ全车间单耗冷量2001×107支。每支干扰素耗冷量：Q＝14454.44kJ/50000＝0.2890888kJ/s每天全车间耗冷量：Qd

＝14454.44kJ/d总每年全车间耗冷总量：Q＝14454.44kJ/d×200＝2.890888×106kJ/aa综上可得，年产1000万支干扰素α-2b全车间冷却消耗衡算表：名称 每支产品消名称 每支产品消kJ 每小时平均用kJ/h 每天耗kJ/d 年kJ/a耗冷量0.2890888602.2683314454.442.890888×106工艺用水衡算化水，全车间用水量最终转换成原水用量来表示。W10.033L/1ml/支。单次发酵中纯化环节注射用水量：W =44L+44L+15L+44L+23L+8L+23L+11L+4L+11L+62L=289L纯化用水综上全车间每生产一支干扰素成品的注射用水耗量：W=W +W +W =0.033L/支+0.001L/支+289L/50000=0.03978L/支1S

灌装用水

纯化用水每天耗注射用水量：W=50000×0.03978=1989L/d1d每年耗注射用水量：W=200天×1989L/d=397800L/a1a纯化水量W2纯化率为80%20%故单次所用的纯化水量：W =W

+W

=11.25L+150L+65L+220L=446.25L2

种子罐

发酵罐

洗灌水

灭菌用水W =W +W +W +W =2×6L+2.5L+0.3L+148.5L×20%=44.5L2

洗涤剂

缓冲液

变性液体

破碎用水W =1989L/80%=2486.25L2注射水制备消耗W=W +W +W =446.25L+44.5L+2486.25L=2977L2 2

2

2注射水制备消耗则每支干扰素成品注射用水量:W

=（W +W +W

）/50000=2S 2

2

2注射水制备消耗（446.25+44.5+2506.25）/50000=0.05954L/支每天耗纯化水量：W=W=2977L/d2d 2每年耗纯化水量：W=200天×2977L/d=595400L/a2a原水量W3已知纯化设备生产效率为原水：纯化水=17：10即由制备纯化水所消耗的原水量：W=2977×17/10=5060.9L33.5.3全厂用水单耗每支干扰素成品耗用原水量:W=5060.9/50000=0.101218L/支每天耗原水量：W

3S=W=5060.9L/d3d 3每年耗原水量：W=200天×5060.9=1012180L/a3a每天耗量 年耗/名称 每天耗量 年耗/名称 每支干扰素用水量L/支 每小时平均用/（L/h）/（L/d） （L/a）注射水0.0397882.8751989397800纯化水0.05954124.0422977595400原水0.101218210.875060.91012180各车间主要设备选型发酵间设备种子罐GUJP关参数如下：项目类别规格参数项目类别规格参数项目类别规格参数公称容积15L搅拌功率0.15KW填充系数65～80搅拌转速150～1000rpm设计压力0.15Mpa通气量0.25～0.35Mpa传感器配制 PH电极DO电极温度电极工作压力0.65MPa罐体材料 不锈钢SUS316L/SUS304结构方式落地式结构搅拌形式机械压迫式消泡桨消泡方式机械压迫式消泡桨灭菌方式自动灭菌灭菌4路蒸汽 夹套、罐内、阀门、过滤器发酵罐发酵罐采购自连云港百仑生物反应器科技有限公司的BLBIO-200SJ-UIP型自动发酵罐。设备相关参数如下：表4-2BLBIO-200SJ-UIP发酵罐设备参数表项目类别规格参数项目类别规格参数公称容积200L搅拌功率2.2KW填充系数65～80搅拌转速0～600rpm径高比1:2.5出料方式底部出料传感器配制PH电极DO电极温度电极设计压力0.4MPa罐体材料不锈钢SUS316L结构方式支腿或悬挂搅拌形式三层机械直叶搅拌桨消泡方式机械压迫式消泡桨，四块档料板筒体尺寸φ450×1200×5进排气口尺寸DN20灭菌方式自动灭菌灭菌4路蒸汽夹套、罐内、阀门、过滤器罐盖提升力姆泰克电动提升净重范围500Kg高速剪切均质机GRS2000/4项目类别规格参数项目类别规格参数项目类别规格参数每小时标准流量300L～1000L进出口尺寸DN25/DN15整机重量65～80马达功率2.2kW转子结构2G、4M6F精密定转子 输出转速14000rpm定转子间隙0.2-0.3mm材料SUS316L不锈钢分离纯化间设备HAPQuikst4℃TF-CX-1项目类别规格参数项目类别规格参数项目类别规格参数型号HP100单泵外形尺寸（mm）1150×700×1120流量0.26～10L/min 双泵外形尺寸（mm）1300×700×112022重量260kgUV波长单波长（280nm），双波长0～6Au管路直径10mmPH范围1～14最大操作压力5bar使用温度环境5～30℃密封保护级别IP65接液材质316L，PP，EPDM,玻璃阴离子交换层析柱表4-5Quikst型层析柱设备参数表阴离子交换层析柱项目类别规格参数项目类别规格参数型号TC150-950耐压5bar直径140mm柱长950mm柱管材质SUS316L不锈钢床层体积14.6L阳离子交换层析柱项目类别规格参数项目类别规格参数型号TC100-950耐压5bar直径100mm柱长950mm柱管材质SUS316L不锈钢床层体积7.4L丙烯葡聚糖层析柱项目类别规格参数项目类别规格参数型号TC70-950耐压5bar直径70mm柱长950mm柱管材质SUS316L不锈钢床层体积3.6L表4-6层析冷柜设备参数表项目类别规格参数项目类别规格参数型号TF-CX-1内部尺寸（mm）660×760×1700温度范围1℃～10℃外部尺寸（mm）880×880×1970内容积800L隔板规格（mm）550×350功率500W散热方式风冷散热PAGEPAGE31阴离子交换层析柱填料表4-7层析填料参数表阴离子交换层析柱填料项目类别层析填料规格参数DEAE-琼脂糖凝胶FF项目类别离子交换类型规格参数弱阴离子蛋白质吸附容量95mgHSA/ml介质粒径45～165µm总离子交换容量0.09～0.13mmol/ml介质PH范围2～9基质6%交联琼脂糖保质期4年阳离子交换层析填料项目类别规格参数项目类别规格参数层析填料CM-琼脂糖凝胶FF离子交换类型弱阳离子蛋白质吸附容量60mg溶菌酶/ml介质粒径45～165µm总离子交换容量0.09～0.13mmol/ml介质PH范围6～10基质6%交联琼脂糖工作范围4年丙烯葡聚糖层析填料项目类别规格参数项目类别规格参数层析填料丙烯葡聚糖凝胶S-100性状20%乙醇，底部为胶体球蛋白分离范围1×103～1×105保质期5年作用蛋白等物质的纯化分离保存温度2～8℃灌装间设备灌装间设备均采购自上海纳丰机械设备有限公司的产品。根据物料计算选择 QCL60型立式超声波洗瓶机，NFASMR620型隧道式热风循环灭菌烘箱，NFAG-200安瓿瓶灌封机设备相关参数如下：表4-8QCL60型超声波洗瓶机参数表项目类别适合规格规格参数1-20ml安瓿瓶项目类别洗瓶澄明度合格率规格参数>99%耗水量0.4～0.6m3/h机器重量2000kg耗气量40～50m3/h处理量200～300瓶/min功率17.6kw外形尺寸（mm）2099×2003×1169表4-9NFASMR620隧道式热风循环灭菌烘箱设备参数表项目类别规格参数项目类别规格参数适用规格1-20ml安瓿瓶具体型号ASMR620-35（38）出口瓶温度<40℃功率27.7kw（其中加热功率21.6kw）灭菌最高温度350℃外形尺寸（mm)3550×1760×2343重量2300kg输送带有效宽度620mm洁净度国际3级排风量（m³）3000-4100表4-10NFAG-200安瓿瓶自动灌封设备参数表项目类别最大成型深度规格参数13mm项目类别冲载次数规格参数≤20次/min板块尺寸（mm)315×120包装效率≤20板/min灌装容量1.5～6ml/支包装材料PVC/PE0.3×345mm耗气量110L/min重量3400kg耗水量4.4水系统6L/min外形尺寸（mm)3880×1800×1920生产过程中用到的纯化水与注射用水其制备设备均采购自深圳市科瑞环保设备有限公司的产品。选用该公司的 CARRYCLEANKRM-DROS-10T型纯化水系统与 KRM-MED-4T型注射用水系统，设备相关参数如下数如下：项目类别 规格参数项目类别规格参数纯化水产水量 项目类别 规格参数项目类别规格参数纯化水产水量 10T/h 设备水泵功率工艺流程预处理+双级反渗透+电去离子（一备一用58.25KW）自来水耗水量17T/h设备总功率41KW水出口径:DN40主机设备规格（mm）13000×5000×3500mm设备总重量42000kg整套设备机房面积（mm）15000×7000×4000mm进水口径:DN65进水温度15℃～35℃4-12CARRYCLEANKRM-MED-4T项目类别规格参数项目类别规格参数注射用水产水量4T/h设备水泵功率单台6.2KW（一备一用10.2KW）纯化水耗水量5T/h设备总功率6.8KW水出口径:DN40主机设备规格（mm）6000×5000×3500设备总重量12000kg整套设备机房面积（mm）8000×7000×4000进水口径:DN40出水温度92℃～99℃工艺流程预处理+单级反渗透+工艺流程预处理+单级反渗透+电去离子+热压式蒸馏水机参数如下数如下：表4-13电加热蒸汽发生器设备参数表项目类别规格参数项目类别规格参数额定蒸发量100kg/h蒸汽出口DN20最高压力0.7MPa排污出口DN20最高蒸汽温度171℃进水口DN15规格（mm）4.6离心机1010×550×1500设备总功率72KWCEPA参数如下数如下：最高转速 最大容量 最大离心力8000r/min 最高转速 最大容量 最大离心力8000r/min 6×1000ml 4600r/min 6×2400ml 7060×g表4-15DLM12L超大容量冷冻离心机设备参数表项目类别规格参数项目类别规格参数最高转速8000r/min外形尺寸(mm)960×860×1200净重500kg包装尺寸(mm)1150×970×1360电机功率4.1KW最大离心力14336G制冷功率 制冷功率 2.5KW最大容量6×2400ml总功率6.6KW 温度控制范围 -20℃～+40℃项目类别规格参数项目类别规格参数项目类别规格参数配重范围50-5000g单盘尺寸175×175mm精度±1g重复性±1g规格6个称盘总功率1.5KW加液流量 4分钟（单盘5kg） 使用环境10℃~35℃单盘容量5kg电源AC220V50Hz设备重量520kg外型尺寸 1220×820×2000（mm）4.7

表4-17CEPA连续流离心机设备参数表项目类别规格参数项目类别规格参数型号Z41/G流量20~500（L/h)容量2L最大转速20000rpm最大离心力17000G尺寸950×620×1750（mm）干热灭菌与湿热灭菌分别采购自南京鑫长江制药设备有限公司与华南共创医疗器械有限公司的产品，设备相关参数如下数如下：4-18干热灭菌柜设备参数表项目类别 规格