粮油检测粮食中伏马毒素B1B2的测定超高效液相色谱方法（编制说明）

《粮油检测粮食中伏马毒素B1、B2的测定超高效液相色谱方法》行业标准制定编制说明伏马毒素（Fumonisins）是一组由串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)、多育镰刀菌(Fusariumproliferatum)、轮状镰刀菌（Fusariumverticillioides）和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)等产生的真菌毒素。迄今为止，已经鉴定到28种伏马毒素类似物，它们被分为4组，即A，B，C和P组。B组伏马毒素是野生型菌株中产生量最丰富的，其中FB1占了总量中的70%左右，同时FB1也是所有伏马毒素中毒性最强的。可导致马产生白脑软化症（ELEM）、神经性中毒，猪肺水肿，人类食管癌和肝癌等，国际癌症研究机构（IARC）1993年将其归为2B类致癌物。主要污染玉米及玉米制品，在大米、高粱、面条、啤酒中也有存在。目前报道用于伏马毒素检测的方法有酶联免疫法、免疫胶体金试纸法、时间分辨荧光免疫分析法、气相色谱法、高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法、薄层色谱法等。薄层色谱法由于操作复杂，目前应用较少；胶体金和酶联免疫方法用于快速筛查;普通液相色谱方法目前应用较多，但分析速度较慢，耗费溶剂较多，成本增加；液质联用仪检测需要高端的质谱仪。当前急需建立一种更加灵敏、高效、低溶剂量的伏马毒素微量快速定量方法。为了满足当前我国粮食绿色检测、监测定量分析的需要，通过查阅文献，根据范德米特(vanDeemeter)方程理论，结合免疫亲和净化手段，基于快速高效色谱分离技术，建立了一种进样量小、分离度高、快速准确、环保的伏马毒素定量分析方法。本标准项目的研究有助于提高粮食样品检测、监测效率，降低成本，保护环境，保障从业人员健康安全。本标准对后续标准制定，以及粮食污染黄曲霉毒素的相关科研、标准制定起到较好的指导、参考、促进作用。1工作简况1.1任务来源及起草单位根据2012年粮油行业标准制定计划的要求，由国家粮食局科学研究院负责《粮油检测粮食中伏马毒素B1、B2的测定超高效液相色谱法》起草工作，该方法也是国家863项目“粮食产后生物性危害物快速检验监测技术”（项目编号2012AA101609）的研究内容之一。起草单位成立的标准起草组负责进行本标准的各项工作。1.2标准研制主要工作过程（1）根据该标准的特点，2012年5月-2012年7月，查询了国内外资料，对相关检测机构、粮库、粮食加工企业进行了调研，并召开了第一次讨论会，确定了标准制订方案和工作计划。（2）2012年8月-2012年12月，在国家粮食局科学研究院实验室进行标准的研制工作，主要包括方法的建立，方法灵敏度测试，方法的线性范围确定，方法的回收率研究等。（3）2013年1月-3月，编写了《粮油检测粮食中伏马毒素B1、B2的测定超高效液相色谱法》标准草案，并召开了第二次讨论会。（4）2013年4月-9月，在不同厂家的快速液相色谱上进行方法的验证。（5）2013年10月-11月，标准草案的意见征询。（6）2015年3月-2015年7月，行业验证。(7)2015年8月-至今，标准文本修改,形成送审稿。2标准的编制原则和标准的主要内容2.1标准编制原则本标准是根据GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构与编写规则》、GB/T20001.4-2009《标准编写规则第4部分：化学分析方法》的规定进行编制的。2.2确定标准主要内容2.2.1标准的适用范围本标准规定了采用免疫亲和柱净化快速高效液相色谱法测定谷物及其制品中伏马毒素的条件和详细分析步骤。本标准适用于小麦、玉米、稻谷等粮食及其制品中伏马毒素的测定。本标准方法伏马毒素B1、B2的检出限为0.05mg/kg。2.2.2标准研制的总体思路仪器与试剂快速高效液相色谱仪：配备荧光检测器和数据处理系统。色谱柱：C18柱（50mm×3mm，1.7μm,或相当者）。黄曲霉毒素免疫亲和柱；玻璃纤维滤纸；0.22μm有机滤膜；6位泵流操作架；电子分析天平；高速旋转粉碎机；高速均质器；氮吹仪伏马毒素B1、B2标准品，甲醇、乙腈（色谱纯），超纯水。其它试剂和材料见标准送审稿。检测实验过程中采用流动相作为背景溶液，用荧光检测器对伏马毒素B1和B2标准液在190～600nm进行扫描（见图1）。结果表明，伏马毒素B1和B2最佳激发波长为310nm，最佳发射波长为435nm、430nm。考虑到简化检测条件，因此取激发波长为310nm，发射波长为435nm。图1伏马毒素B1、B2激发波长扫描谱图Fig.1FLRExcitationspectrumofFB1andFB2图2伏马毒素B1、B2发射波长扫描谱图Fig.2FLREmissionspectrumofFB1andFB2图3伏马毒素B1和B2的色谱图Fig.3ChromatogramofFB1andFB流动相的优化根据以上条件，参考“GBT25228-2010粮油检验玉米及其制品中伏马毒素含量测定免疫亲和柱净化高效液相色谱法和荧光光度法”的流动相（见色谱条件），流速不同时，峰的保留体积基本相同，表明该流动相对FB1和FB2来说很稳定，结果见表1。表1伏马毒素的保留体积（按FB2保留体积计算）Table1RetentionvolumeofFB1andFB2流速Flowrate0.15ml/min0.20ml/min0.30ml/min标准偏差STD相对标准偏差RSD（%）保留体积Retentionvolume（mL）1.04331.04381.16270.06886.4当流速为0.2mL/min时，保留时间为5.22min，测1个样品消耗的甲醇量为：0.2mL/min（流速）×5.22min（保留时间）×0.77（有机溶剂配比）=0.804mL。目前国家标准(GBT25228-2010)测1个样品至少需16.11×1×0.77=12.405mL,与之相比，本方法的有机溶剂用量是国标方法的1/12，流动相的消耗量少且环保。方法的线性范围与检出限在上述色谱条件下，用FB1和FB2的系列标准溶液按选定的色谱条件测定，以UPLC测得的峰面积为纵坐标（y），相应的质量（ng）为横坐标（x）绘制标准曲线，根据3倍信噪比的峰响应值，得出此方法检出限，根据10倍信噪比，得出线性范围的下限，结果见表2。表2FB1和FB2的线性回归方程及检出限Table2Regressionequationsanddetectionlimitsofmycotoxins伏马毒素Fumonisins线性范围Linearrange(ng)线性方程Linearequation相关系数(R2)检出限LOD(ng)FB10.25～10.0y=1.7058×105x+1.1600×1040.99720.05FB20.25～10.0y=2.9780×105x+1.6571×1030.99990.05目前现行国家标准GB/T25228-2010[21]给出普通免疫层析净化HPLC检测的检出限为1ng，BILJANAFABRAMOVIC等[22]的研究的玉米中伏马毒素的高效液相色谱检测方法，检出限为0.5（FB1）和1.3ng（FB2）,与之比较，本方法的灵敏度至少提高了10倍。王军淋等[23]报道的快速高效液相色谱检测玉米中的伏马毒素，其检测限为0.25（FB1）和0.14ng（FB2），也证明了快速高效液相色谱方法的高灵敏度。此外，灵敏度的提高，意味着可以减少用来进样分析的伏马毒素的量，在净化阶段可使用柱容量更小的免疫亲和柱。传统HPLC方法，由于灵敏度相对较低，需要柱容量较高的免疫亲和柱，要求填充更多的伏马毒素抗体，增加了分析成本，本方法允许使用容量更低的免疫亲和柱，从而也可降低检测成本。方法检测限为0.05mg/kg.方法的精密度与回收率将添加FB1和FB2的小麦、玉米样品按照本方法进行检测。同一批样品(FB1为5µg/g,FB2为2.5µg/g)重复测7天，每天测7次，做方法精密度实验，本方法针对FB1的日内精密度为2.2%，日间精密度为5.5%；FB2的日内精密度为4.3%，日间精密度为7.4%，具有较好的精密度。添加FB1和FB2的稻谷、小麦、玉米样品，每个浓度做5个平行样检测，测方法回收率，结果见表3。从表中可见，表3回收率实验结果Table3Recoveriesofspikedsampleswithdifferentfumonisinsconcentrations样品Sample添加量Spikedw(µg/g)平均值Averagevaluew(µg/g)回收率范围RangrecoveryR/%小麦Wheat（FB1）10.73/1.40/4.1273.0/70.0/82.4小麦Wheat（FB2）0.5/0.38/0.81/1.8776.0/81.0/74.8玉米Corn（FB1）10.75/2.01/4.5275.0/100.5/90.4玉米Corn（FB2）0.5/0.48/0.91/2.1196.0/91.0/84.4综合来看，本方法的灵敏度比其它高效液相色谱方法高，消耗的有机溶剂少，样品提取方法、回收率方面与其它高效液相色谱方法相当，具体情况见表.6实际样品的分析应用建立的方法分析了来自北京地区的40个玉米样品中的FB1和FB2，结果表明，样品中通常有一定的本底含量，部分样品有污染，结果见下表，样品色谱图见图4。从检测结果看，北京地区的伏马毒素污染风险不高。表4玉米样品（FB1+FB2）检测结果Table4FB1+FB2ofcornsamples含量c（g/kg）未检出0<c<10001000≤c<20002000≤c<30003000≤c<40004000≤c占比（%）22.550101052.5图4FB1和FB2污染玉米样品的色谱图Fig.4ChromatogramsofFB1andFB2incontaminatedsampleofcorn方法的验证本方法经北京市粮油食品检验所、河南国家粮食质量监测中心、湖南国家粮食质量监测中心、国家粮食局科学研究院检测中心等4家实验室验证。采用玉米谷物进行方法精密度实验。全部数据采用科克伦和格拉布斯（Grubbs）法检验，剔除离群值，根据情况处理歧离值后，计算谷物及其制品中伏马毒素B1、B2的总体平均值（m），重复性限（r）和再现性限（R），玉米中伏马毒素B1、B2不同水平采取4家样品检测值进行统计，这些结果均符合《食品法典委员会程序手册》（第二十版）中关于联合验证中HorRat在2之内的规定。表5实验室间联合验证统计结果（伏马毒素B1）参数玉米水平1水平2实验室数目410参加统计实验室数目410离群实验室数目00平均值，m（g/kg）346.1637.3重复性标准偏差，Sr（g/kg）10.815.7重复性限，r（g/kg）30.5244.45再现性标准偏差，SR（g/kg）26.524.6再现性限，R（g/kg）75.169.6HorRat值1.160.64表6实验室间联合验证统计结果（伏马毒素B2）参数玉米水平1水平2实验室数目410参加统计实验室数目410离群实验室数目00平均值，m（g/kg）613.21498.7重复性标准偏差，Sr（g/kg）11.989.0重复性限，r（g/kg）33.74251.92再现性标准偏差，SR（g/kg）26.1116.8再现性限，R（g/kg）73.9330.6HorRat值0.701.473采用国际标准和国外先进标准的情况，以及与国际、国外同类标准水平的对比，或者与测试的国外样品、样机的有关数据对比情况本方法的检测灵敏度是普通HPLC方法的10倍；消耗有机溶剂少，具有较高的精密度、回收率；检测时间短，从提取、净化到色谱分离，整个分析流程耗时不足45min。实际样品检测表明，本方法能够满足对样品快速、高通量、低溶剂的检测要求。表7快速高效液相色谱方法与其他液相色谱方法的性能比较Table7ComparisonoftheUPLCmethodandotherHPLCmethodsreportedrecentlyinliteratureNo.基质Matrix提取净化Extraction/clear-up流动相/保留时间Mobilephase/retentiontime灵敏度Sensitivity（ng）回收率RecoveryR/%参考文献Reference1小麦、玉米免疫亲和柱，甲醇/乙腈/水（1/1/2,v/v/v）0.2mL/min，甲醇/0.1mol/L磷酸二氢钠溶液（77/23,v/v）,6.184minLOD值，FB1、FB2均为0.0570.0～100.52玉米及其制品免疫亲和柱，甲醇/乙腈/水（1/1/2,v/v/v）1mL/min，甲醇/0.1mol/L磷酸二氢钠溶液（77/23,v/v）,16.11minLOD值，FB1、FB2均为176.5～89.3[21]3玉米、玉米饲料免疫亲和柱，甲醇/水（4/1，v/v）0.8mL/min，甲醇/0.1mol/L磷酸二氢钠溶液（77/23,v/v）,12.604minLOD值，FB1、FB2均为174.0～85.5[24]4玉米离子交换树脂萃取，乙腈/水（1/1，v/v）1mL/min，水/三氟乙酸（100/0.025，v/v），乙腈/三氟乙酸（100/0.025，v/v），梯度洗脱,17.22minLOD值，FB1、FB2均为12077.3～102.6[25]5玉米离子交换柱，乙腈-水(1/1,v/v)0.3mL/min，pH值为3.3左右的100mmol/L甲酸铵-甲酸溶液，9minLOQ值，FB1、为0.25、FB2均为0.1475.6～90.0[23]6玉米原料的婴儿食品免疫亲和柱，甲醇/水（4/1，v/v）1ml/min乙腈/水/乙酸(61/38/1v/v/v)LOQ值，FB1、为1、FB2均为0.7579～102[26]7玉米和玉米制品免疫亲和柱，甲醇/水（4/1，v/v）1ml/min乙腈/水/乙酸(61/38/1v/v/v),13.34minLOD值，FB1为1、FB2均为0.7579～99.6[27]8玉米强阴离子交换柱，甲醇/水(3:1,v/v)1mL/min，甲醇/0.1mol/L磷酸二氢钠溶液（77/23,v/v）,16minLOD值，FB1为1、FB2均为1.2；LOQ值，FB1为2.3、FB2均为2.7-[28]9稻谷离子交换柱，甲醇/水(3:1,v/v)1mL/min，甲醇/0.1mol/L磷酸二氢钠溶液（77/23,v/v）,17.6minLOD值，FB1为0.4、FB2均为0.440～80[29]10玉米免疫亲和柱，甲醇/乙腈/水（1/1/2,v/v/v）1mL/min，甲醇/0.1mol/L磷酸二氢钠溶液（78/22,v/v）,14minLOD值，FB1为0.5、FB2均为1.388.7，90.5[22]4与有关的现行法律、法规和强制性国家标准、行业标准的关系本标准颁布实施后，针对粮食中伏马毒素FB1、FB2的测定，符合现行的法律法规和强制性（国家、行业、地方）标准要求。5重大分歧意见的处理经过和依据无。6按照标准化法的有关规定，提出强制性标准或推荐性标准的建议建议将本标准列为推荐性行业标准。7废止现行有关标准的建议无8其他应予说明的事项标准采用了快速高效液相色谱仪AcquityUPLC（美国Waters公司），荧光检测器（FLD，美国Waters公司）和岛津公司的快速高效液相色谱仪LC-30A二元高压梯度系统进行了适应性研究，方法在这两种仪器上结果符合要求。9参考文献[1]RheederJP，MarasasWF，VismerHF.ProduetionoffumonisinanalogsbyFusariumspecies.APPlEnvironMicrobiol，2002，68:2101-2105.[2]Jeong-AhS,RobertHP,RonaldDP.CharacterizationoffourclusteredandcoregulatedgenesassociatedwithfumonisinbiosynthesisinFusariumverticillioides[J].FungalGenet.Bio.l,2001,34:155-165.[3]BezuidenhoutSC，GelderblomWCA，Gorst-AllmanCP，etal.Structureelucidationofthefumonisins，mycotoxinsfromFusariommoniliforme.JChemSocChemCommun，1988，743-745.[4]BhatR,RaiRV,KarimAA.Mycotoxinsinfoodandfeed:presentstatusandfutureconcerns.ComprRevFoodSciF,2010,9(1):57-81.[5]EvaluationofCertainMycotoxinsinFood,Fifty-sixthreportoftheJointFAO/WHOExpertCommitteeonFoodAdditives.WorldHealthOrganization:Geneva,2002.1-51.[6]J.M.Soriano,S.Dragacci.Occurrenceoffumonisinsinfoods.FoodResearchInternational37(2004)985–1000.[7]JosepRubert,JoséMiguelSoriano,JordiMañes,CarlaSoler.Occurrenceoffumonisinsinorganicandconventionalcereal-basedproductscommercializedinFrance,GermanyandSpain.FoodandChemicalToxicology56(2013)387–391.[8]C.M.Lino.L.J.G.Silva.A.L.S.Pena.M.I.Silveira.DeterminationoffumonisinsB1andB2inPortuguesemaizeandmaize-basedsamplesbyHPLCwithfluorescencedetection.AnalBioanalChem,2006,(384):1214–1220.DOI10.1007/s00216-005-0295-z.[9]ShuoWang,YingQuan,NanjuLee,eta.lRapidDeterminationofFumonisinB1inFoodSamplesbyEnzyme-LinkedImmunosorbentAssayandColloidalGoldImmunoassay[J].AgricFoodChem,2006,54:2491-2495.[10]AlexandraMolinell,iKarinaGrossalber,RudolfKrska.ArapidlateralflowtestforthedeterminationoftotaltypeBfumonisinsinmaize[J].AnalBioanalChem,2009,395(5):1309-1316.[11]权英，詹月华，张根华，秦红，丁建英，王硕。伏马毒素B1酶标试纸条检测方法。食品研究与开发。2011,32（6）：97-100.[12]张珏，朱岚，陈蕴，周彬，张艺，金坚，黄飚。伏马毒素B1时间分辨荧光免疫分析超微量检测方法的建立。环境与健康杂志，2009年，26（12）：1112-1115.[13]EricWSydenham,WentzelCAGelderblom,PieterGThie,letal.EvidenceforthenaturaloccurrenceoffumonisinB1,amycotoxinproducedbyFusariummoniliformeincorn[J].AgricFoodChem,1990,38(1):285-290.[14]LinoCM,SilvaLJG,APena,eta.lOccurrenceoffumonisinsB1andB2inbroa,typicalPortuguesemaizebread[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology,2007,118(1):79-82.[15]MarilenaMuscarella,SoniaLoMagro,DonatellaNardiello,etal.DevelopmentofanewanalyticalmethodforthedeterminationoffumonisinsB1andB2infoodproductsbasedonhighperformanceliquidchromatographyandfluorimetricdetectionwithpost-columnderivatization[J].JournalofChromatographyA,2008,1203:88-93.[16]TeresaGazzott,iBarbaraLugobon,iElisaZiron,ieta.lDeterminationoffumonisinB1inbovinemilkbyLC-MS/MS[J].FoodControl,2009,20:1171-1174.[17]JosepRubert,CarlaSoler∗,JordiMa˜nes.Evaluationofmatrixsolid-phasedispersion(MSPD)extractionformulti-mycotoxindeterminationindifferentfloursusingLC–MS/MS.Talanta85(2011)206–215.[18]SchaafsmaAW,NicolRW,RottinghausG,eta.lAnalysisofFusariumtoxinsinmaizeandwheatusingthinlayerChromatography[J].Mycopathologia,1998,142:107-113.[19]Salisbury,J.J.Journalofchromatographicscience,2008,46:883～886.[20]Mather,J.;Rainville,P.D.;Spooner,N.;Evans,C.A.;Smith,N.W.;Plumb,R.S.Bioanalysis,2011,3:411～420.[21]中华人民共和国国家标准，GB/T25228-2010粮油检验玉米及其制品中伏马毒素含量测定免疫亲和柱净化高效液相色谱法和荧光光度法。[22]BILJANAF.ABRAMOVIC,SANDRAM.JAKSICandZORANS.MASIC.LiquidchromatographicdeterminationoffumonisinsB1andB2incornsamplesafterreusableimmunoaffinitycolumnclean-up.J.Serb.Chem.Soc.,2005,70(6)899–910.[23]王军淋,胡玲玲,蔡增轩,任一平。超高压液相色谱法同时检测玉米中的伏马毒素B1、B2、B3。食品安全质量检测学报。2013年，4（1）：215-223.[24]中华人民共和国出入境检验检疫行业标准，SN/T1572-2005进出口粮谷、饲料中伏马毒素检验方法液相色谱法。[25]JianshengWang,YingZhou,QiaomeiWang.Analysisof