生物技术 酶工程课件

第五章酶工程酶工程概况一、酶工程定义二、发展概况三、酶工程的技术范围四、酶工程的应用领域一、酶工程定义酶是由细胞所产生具有催化能力的蛋白质。它具有以下四个特点：专一性强、催化效率高反应条件温和反应产物易纯化反应产物污染小、能耗低和反应易控制一、酶工程定义酶工程的定义：

利用酶催化的作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需要的产品，它是酶学理论与化工技术相结合而形成的一种新技术，也是利用酶或者微生物细胞、动植物细胞、细胞器的特定功能，借助于工程学手段来为我们提供产品的一门科学。优点：快速；高效；产品回收和提纯工艺简便。二、酶工程发展概况四个过程1.自然酶的开发和应用2.固定化酶和固定化细胞3.多酶发应器4.仿生技术自然酶的开发和应用从动物、植物或微生物细胞和组织中提取酶并加以利用的阶段。1894年，日本的高峰让吉首先从米曲霉中制得了淀粉酶，用作消化剂1908年，德国的罗姆(Rohm)制得胰酶，用于皮革的软化1908年，法国的波伊登(Boidin)制得细菌淀粉酶，用于于纺织品的退浆1911年，美国的华勒斯坦(Wallerstein)制得木瓜蛋白酶，用于除去啤酒中蛋白质浑浊自然酶的开发和应用大规模生产阶段1949年，用液体深层培养法进行细菌a-淀粉酶的发酵生产50年代以后，酶制剂的生产转向微生物液体深层发酵的方法1960年，法国的雅各(Jacob)和莫诺德(Monod)提出了操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制多酶反应器酶反应器：

以酶作为催化剂进行反应所需的设备多酶反应器：多种酶固定化后，制成多酶反应器，模拟微生物细胞的多酶系统，进行多种酶的顺序反应，来合成各种产物此技术还处于实验室研究阶段仿生技术定义：模仿生物系统的原理以建造技术系统，或者使人造技术系统具有生物系统特征或类似特征的技术。如:模拟酶根据酶的作用原理，用人工的方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白质结构的化合物。三、酶工程的技术范围各类自然酶的开发和生产酶的分离、纯化及鉴定技术固定化技术多酶反应器的研制和应用酶的修饰与改造酶底物用途氨基酰化酶L-氨基酸L-氨基酸的生产A-淀粉酶淀粉纺织品防缩，牙科消毒葡聚糖酶葡聚糖牙科保健葡萄糖氧化酶葡聚糖牙科保健木瓜蛋白酶蛋白质牙科保健果胶酶果胶木材防腐，纺织纤维的浸湿青霉素酰胺酶青霉素抗菌素的合成蛋白酶蛋白质牙科保健，鞣制皮革，底片上银的回收其它应用主要内容第一节酶的发酵生产第二节酶的分离纯化第三节酶分子改造第四节生物催化剂的固定化第五节酶反应器第六节生物传感器第一节酶的发酵生产一、酶的来源二、优良产酶菌种的筛选三、基因工程菌(细胞)的构建四、微生物酶的发酵生产一、酶的来源一切生物体都可作为酶的来源酶的早期来源：动物脏器和植物种子主要来源：微生物4.菌种的复筛

初筛之后，还要进行复筛。复筛的目的是在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。复筛。酶活的测定方法的建立尤其重要。优良的产酶菌种应具备以下特点：(1)不是致病菌；(2)菌株不易变易和退化；(3)不易感染噬菌体；(4)微生物产酶量高；(5)酶的性质符合应用的需要，而且最好是胞外酶；(6)产生的酶便于分离和提取，得率高；(7)微生物培养营养要求低。菌种筛选的一般程序:含菌样品的采集，菌种分离，产酶性能测定及复筛等。5.最佳产酶条件的初步确定(1)培养方式的确定；(2)最佳培养条件组合；(3)微生物产酶的特性(胞内酶、胞外酶)；(4)微生物酶收集的时间顺序；三、基因工程菌(细胞)的构建运用基因工程的手段将原有菌株中的目的基因转移到另外一些对生产环境更适应性的微生物细胞之内，使其高效表达四、微生物酶的发酵生产培养基的选择发酵生产方式发酵条件控制提高酶的产量培养基的选择酶的合成受底物的诱导和分解代谢物的阻遏的双重调节作用，为提高酶产量，应向培养基中添加适量的诱导物，并尽量减少阻遏物的浓度。营养物质：碳源、氮源、无机盐、生长因子培养基的PH发酵生产方式固体发酵液体深层发酵发酵条件控制温度：产酶温度低于生长温度通气合搅拌pH的控制提高酶的产量添加诱导物：酶的作用底物、酶的反应产物、酶的底物类似物降低阻遏物浓度：添加难于利用的碳源；分批加碳源；控制末端产物的浓度表面活性剂添加产酶促进剂二、细胞破碎由于除了胞外酶之外，大多数酶存在细胞内部，为得到细胞内部的酶，首先要收集细胞、破碎细胞，让酶从细胞内释放出来，然后进行酶的提取和分离纯化。方法有：1、机械破碎法2、物理破碎法3、酶促破碎法4、化学破碎法三、酶的提取酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶液或溶剂处理含酶原料，使酶溶解到溶剂中来，实际上是酶的抽取过程。方法有：1、酸溶液提取2、碱溶液提取3、盐溶液提取4、有机溶剂提取各种方法详见表5-2。为提高酶的提取效率并防止酶的变性失活，在提取过程中要注意控制温度、PH值等提取条件。四、沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某些物质，使酶的溶解度降低，从溶液中沉淀析出而与其他溶质分离的技术过程。方法有：1、盐析沉淀法2、等电点沉淀法3、有机溶剂沉淀法4、复合沉淀法方法及原理详见表5-3五、离心分离离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使大小不同、密度不同的物质分离的技术过程。方法有：1、低速离心(<8000r/min)，离心酶的结晶等较大颗粒的分离2、高速离心(1-2.5)*104r/min，主要用于细胞碎片和细胞器的分离3、超速离心(2.5-4)*104r/min，主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子及细胞器等六、过滤与膜分离过滤是借助于过滤介质将大小不同、形状不同的物质分离的技术过程。方法有：1、粗滤>2μm2、微滤0.2-2μm3、超滤20Å-2μm4、反渗透<20Å(埃米，光波长度和分子直径的常用计量单位)看表5-4七、层析分离层析分离是利用混合液中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数）的不同，使各组分以不同比例分配在两相中（固定相和流动相）。方法有：1、吸附层析2、分配层析3、离子交换层析4、凝胶层析5、亲和层析6、层析聚焦具体方法看表5-5八、电泳分离方法有：1、纸电泳2、薄层电泳3、薄膜电泳4、凝胶电泳5、自由电泳6、等电聚焦电泳九、萃取分离萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取中的两相一般为互不相溶的两个液相或其他液体。方法有：1、有机溶剂萃取2、双水相萃取3、超临界萃取十、结晶结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。方法有：1、盐析结晶法2、有机溶剂结晶法3、透析平衡结晶法4、等电点结晶法，原理与沉淀分离的原理类似十一、干燥干燥是将固体、半固体或浓缩液中的水分或其他溶剂除去一部分，以获得含水分较少的固体物质的过程。酶经干燥以后，可以提高酶的稳定性、利于产品保存、运输和使用。方法有：1、真空干燥2、冷冻干燥3、喷雾干燥4、气流干燥5、吸附干燥十二、酶的纯度与酶活力酶的纯度可用酶的比活力来衡量，酶的比活力是以每毫克蛋白所具有的酶活力单位来表示。一般情况下，酶的比活力随酶纯度的提高而提高。五、酶制剂的保存酶的保存条件的选择必须有利于维护酶天然结构的稳定性，应注意： （1）温度一般在0~4℃。 （2）缓冲液 （3）氧防护 （4）蛋白质的浓度与纯度第三节酶分子改造酶分子是具有完整的化学结构和空间结构的生物大分子。酶的结构决定了酶的性质和功能。当酶分子的结构发生改变时，将引起酶的性质和功能的改变。酶分子完整的空间结构给予了酶分子的生物催化功能，使其具有催化高效性、作用专一性和反应条件温和等特点。但也其相应的弱点。限制酶大规模应用的原因：

1.细胞外稳定性差； 2.偏离最佳PH值时，酶活性低； 3.具有抗原性。改变酶特性有两种主要的方法：

1.通过分子修饰的方法来改变以分离出来的天然酶的活性。 2.通过基因工程方法改变编码酶分子的基因从而达到改造酶的目的。一、酶分子修饰酶分子修饰

指通过主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造改变酶的一些性质：

提高酶活力、改进酶的稳定性、改变最适PH值或温度、提高反应效率、改变抗原性等。一、酶分子修饰酶分子常见的修饰方法有：1.金属离子置换修饰；2.大分子结合修饰；（1）通过修饰提高酶的活力（2）通过修饰增强酶的稳定性（3）消除酶蛋白的抗原性3.侧链基团修饰氨基修饰、羧基修饰、酚基修饰等二、生物酶工程主要包括三方面的内容： 1.利用基因工程技术大量生产酶； 2.修饰酶基因，生产遗传修饰的酶； 3.设计出新酶基因，合成自然界从未有过的酶。第四节生物催化剂的固定化一、概念二、酶的固定化方法三、细胞固定化方法四、固定化酶(细胞)的性质五、固定化酶(细胞)的指标一、概念固定化技术：通过化学或物理方法将酶束缚在一定的区域内，将酶固定再进行催化的技术。固定化酶：固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。固定化酶的特点

优点：不溶于水，易于与产物分离；可反复使用；可连续化生产；稳定性好。缺点：

固定化过程中往往会引起酶的失活二、酶的固定化方法吸附固定化包埋固定化共价固定化交联固定化微囊固定化热处理吸附固定化物理吸附固定化法优点： 固定化时酶分子的构象很少 或基本不发生变化。缺点： 结合力弱，易解吸附。载体： 纤维素、琼脂糖、活性炭、 沸石及硅胶等包埋固定化定义：将酶或含酶菌体(细胞)包埋在各种多孔载体，使酶固体化的方法。常用的多孔载体琼脂糖、琼脂、海藻酸钠就、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、胶囊、脂质体、中空纤维包埋方法：凝胶包埋和微囊法包埋法适用于底物和产物都是小分子物质酶的固定化共价固定化定义：选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定方法根据化学键的不同可分为两类离子键结合法共价键结合法离子结合法酶分子

含有离子交换基团的固相载体第一个离子结合法固定化酶： DEAE—Cellulose 固定化过氧化氢酶第一个工业化的固定化酶： DEAE-SephadexA-50 固定化氨基酰化酶共价键结合法常用的载体：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲基丙烯醇共聚物酶分子中可以形成共价键的基团：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基前提条件：载体需活化共价键结合法交联固定化定义：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法常用的双功能试剂：戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯戊二醛的两个醛基都能与游离的氨基反应，形成席夫碱(Schiff)双功能试剂：

常用的是戊二醛 O

O H—C—CH2—CH2—

CH2—

C—H第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间交联的固定化酶图7－11酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶热处理法将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体适用于对热稳定性较好的酶的固定化三、细胞固定化方法包埋法：凝胶包埋法纤维包埋法微胶囊法吸附法四、固定化酶(细胞)的性质酶活力变化活力降低底物专一性发生改变酶稳定性提高对热的稳定性提高保存稳定性好对蛋白酶的抵抗性增强对变性剂的耐受性提高四、固定化酶(细胞)的性质最适pH变化

影响因素：载体的带电性质和酶催化反应产物的性质最适温度变化如：固定化胰蛋白酶(重氮法)比游离酶高5~10°C五、固定化酶的指标相对酶活力

固定化酶/游离酶>75%酶的活力回收率固定化酶的半衰期六、固定化酶应用存在的问题1、对好氧反应的影响2、细胞（酶）与载体的稳定问题3、基础条件问题第五节酶反应器一、酶反应器的基本类型二、酶反应器的设计原则三、酶反应器的性能评价四、酶反应器的操作一、酶反应器的基本类型搅拌罐型反应器固定床型反应器流化床型反应器膜式反应器A：填充床式反应器B：流化床反应器中空纤维反应器平板膜反应器二、酶反应器设计原则应了解：底物的酶促反应动力学反应器的类型和流体的流动状态及传热特性需要的生产量和生产工艺流程三、酶反应器的性能评价空时是一种能获取更高数据传输率的信号编码技术。空时编码是空间传输信号和时间传输信号的结合，实质上就是空间和时间二维的处理相结合的方法转化率生产强度四、酶反应器的操作防止微生物污染控制流体流动方式控制恒定生产能力第六节生物传感器

生物传感器：用生物活性物质做敏感器件，配以适当的换能器所构成的分析工具。

能量转换器：能将生化信号定量的转换为电信号，如电极、场效应晶体管、光导纤维

优点：选择性高、分析速度快、操作简单、连续测定一、生物传感器的原理敏感器件+化学物质产生消耗电极敏感物质电信号待测物