分子生物学 公开课一等奖省优质课大赛获奖课件

第二章

生物信息传递生物信息传递DNA间传递DNA复制DNA到RNA传递转录与剪接RNA到蛋白质间传递

蛋白翻译与转运

细胞信号传递

第一节DNA复制

生命延续奥秘--DNA复制拓扑结构问题1953年，Watson&Crick提出DNA双螺旋结构同年，提出复制可能方式：两条母链均可作为模板来合成新DNA链半保留复制DNA双螺旋结构难题—拓扑结构问题：复制时两条链怎样打开？

复制方式假说弥散式复制半保留复制全保留复制

半保留复制试验证实—Meselson-Stahl试验在含有15NH4Cl培养基中培养大肠杆菌将细菌转移到正常培养基（含14NH4Cl）分别于细菌分裂一次和两次后取样，密度梯度离心

复制方式确定拓扑异构酶—解旋酶处理了拓扑问题催化断裂-再连接反应酶。在DNA分子一条或两条链上形成切口，经过切口解开螺旋。复制DNA复制发生在细胞周期S期起始延伸终止复制起始—双向复制真核和原核基因组中形成两个复制叉（复制眼），分别以一条链为模板，双向复制每条链复制中，DNA合成方向相同：5’到3’两条链复制行进方向相反大肠杆菌复制起点复制起点oriC，长约254bp2个重复基序1）9核苷酸5拷贝DnaA蛋白结合位点结合30个DnaA2）13核苷酸3拷贝富含AT几个解旋相关蛋白

DnaA,HU,DnaCDnaB解旋酶酵母复制起点自主复制序列ARS，不足200bp含四个具相同序列亚结构域：A1+B1起始识别序列约40bp，为起始识别复合物（ORC)结合部位B2+B3与大肠杆菌复制起点相同结合ARS结合因子（ABF1)复制延伸在复制起点形成复制叉母代双链中一条连续复制，称前导链；一条不连续，称滞后链（半不连续）DNA聚合酶引物参加DNA复制DNA聚合酶细菌5个，其中DNA聚合酶III是复制酶真核生物9个，其中DNA聚合酶δ是复制酶后滞链非连续合成合成方向同前导链：5’到3’最初形成一些短片段，称冈崎片段

引物与引发酶RNA引物引发酶合成8-12bp引物引发酶不是转录酶大肠杆菌复制需要各种蛋白协作拓扑异构酶、解旋酶(DnaB)：解旋复制酶：复制引发酶；提供引物单链结合蛋白（SSB)：稳定打开双链

连接酶：连接冈崎片段其它蛋白大肠杆菌DNA复制终止存在终止序列：Tus蛋白识别位点Tus蛋白不一样结合方向控制了复制叉是否能够经过DNA复制特点半保留复制---DNA两条单链分别作为模板复制与之互补单链;DNA复制含有方向性,只能从5’→3’;DNA两条单链复制是非对称性,3’链为连续复制,5’链为间断复制;DNA复制必需先在复制起始点合成一段引物.第二节转录与剪接细菌转录调控转录起始1）组成型控制：依赖于开启子结构2）调整型控制：操纵子学说，依赖于调解蛋白水平转录合成1）延伸阶段2）终止阶段无转录后加工细菌RNA聚合酶结构：关键酶+σ亚基1）关键酶：α2ββ’2）σ亚基：开启子特异性结合细菌开启子结构决定转录基础水平细菌开启子共有序列是可变1）-10框：T80A95T45A60A50T96

影响开启子复合物从封闭向开放转换2）-35框：T82T84G78A65C54A45

影响σ亚基识别，从而影响RNA聚合酶结合转录起始点附近及转录单位前50个核苷酸序列影响转录起始后延伸不一样基因可能有不一样最有效开启子开启子序列突变可能改变转录起始基础水平不一样σ亚基识别不一样开启子σ70：标准σ亚基，指导大多数基因转录特定条件下其它σ亚基被激活非标准σ亚基和其识别序列操纵子及其相关概念操纵子(operon)，指一组在基因组中彼此相邻基因，两基因头尾间可能仅隔一两个核苷酸。操纵子全部基因都作为一个单位表示。结构基因(structuralgene)，编码非调控因子基因。调控基因(regulatorgene)，编码调控蛋白（阻抑物）基因。阻抑物(repressor)，能阻止基因表示蛋白质，可与操纵基因结合来阻止转录。操纵基因(operator)，位于开启子下游可与阻抑物结合DNA元件，当与阻抑物结合后调整开启子抑制转录，常为回文序列。诱导物(inducer)，经过与阻抑物结合激活基因转录小分子物质。乳糖操纵子操纵子：lacI;lacZ+Y+A结构基因:lacZ+Y+A调控基因:lacI阻抑物:lacI编码蛋白操纵基因:O开启子：P调控物：异乳糖乳糖操纵子调控辅阻抑物与色氨酸操纵子辅阻抑物(co-repressor)，结合到阻抑物上来抑制转录小分子。转录延伸阶段：转录泡形成转录中RNA聚合酶将两条DNA链暂时分开，形成转录泡，接着使用其中一条联作为模板，指导合成互补RNA。转录泡长度是12-14bp，其中RNA-DNA杂合链长度是8-9bp。转录终止--两种终止子（1）内源性(固有性)终止子(intrinsicterminator)，在体外没有任何其它因子参加时，仍能终止转录一些位点。特征：1）反向回文序列转录后形成发夹结构，在发夹基部有GC富含区；2）转录单元最末端连续6个U残基。ρ-依赖性终止子(Rhodependentterminator)，需要ρ因子辅助。特征：1）形成发夹不如内源性终止子牢靠，但能够使RNA聚合酶暂停；2）ρ因子有解旋酶活性，当RNA聚合酶暂停时，它跟上并打开RNA-DNA碱基配对，释放出转录物，终止转录。转录终止--两种终止子（2）延伸和终止调控抗终止，抗终止蛋白结合到操纵子起始处附近抗终止位点上，再与RNA聚合酶结合，使RNA聚合酶经过终止信号继续转录。衰减作用，出现在与氨基酸生物合成相关酶操纵子，如色氨酸操纵子中。

抗终止色氨酸操纵子衰减作用色氨酸操纵子衰减作用转录起始点与trpE基因间可形成两个发夹：其中小为终止信号，而大更靠近起始点也更稳定；两发夹环位置重合，一次只能形成一个；RNA聚合酶与RNA转录物5’端核糖体间相对位置决定形成哪一个发夹环：若核糖体暂停，形成大发夹，继续转录，并随即翻译成蛋白；核糖体随RNA聚合酶移动，会占据形成大发夹环茎部位置，只能形成小发夹，终止转录。色氨酸量可调整大小发夹环形成；终止信号上游有一个可编码14个氨基酸（内含两个色氨酸）短ORF，色氨酸不足时蛋白质合成停顿，核糖体暂停，则聚合酶继续转录，反之则终止。真核细胞转录起始调控转录起始1）激活物2）阻抑物转录合成1）开启子去除、脱离与加帽反应2）延伸因子3）合成终止与多聚腺苷酸化转录后加工：内含子剪接激活物(activator)激活转录起始蛋白质可能结合于开启子区域，影响单个基因转录，也可能结合于增强子区域，影响多个基因转录可与前起始复合物相互作用，作用部位称为激活域(activationdomain)。激活域常见结构包含：1）酸性结构域，富含Asp和Glu2）富含Gln结构域3）富含Pro结构域阻抑物对于真核生物转录起始，激活物是主体，阻抑物相对较少大多结合于上游开启子或缄默子依据所处环境不一样，一些蛋白可能现有激活作用又有阻抑作用，如NC2对于有TATA框开启子起抑制作用，而对无TATA框开启子有激活作用阻抑物可能与前起始复合物相互作用真核转录真核与原核RNA聚合酶含有结构上相同性真核转录三个结构特征：1）5’端加帽2）3’端加尾3）内含子剪接合成与加工同时延伸因子存在开启子去除、脱离与加帽反应开启子去除，前起始复合物向开始合成复合体过渡开启子脱离，聚合酶离开开启子，形成转录物加帽发生于转录物达30bp前。加帽反应加一个G到5’端—鸟苷酸转移酶G甲基化---鸟嘌呤甲基转移酶帽子结构在不一样生物中甲基化程度不一样。延伸因子真核转录物更长，需要延伸因子来帮助聚合酶以保持转录复合物稳定合成终止与加尾反应Poly(A)聚合酶是加尾酶3’端内部切断，再加尾加尾信号AATAAA,位于加尾处上游10-30bp切割处为CA，其后有富含GU区辅助因子：CPSF与CstF加尾与终止同时内含子剪接内含子类型GU-AG内含子保守剪接位点序列内含子剪接路径：套索结构剪接装置中心是细胞核小RNA(snRNA)选择性剪接内含子类型GU-AG内含子保守剪接位点序列剪接位点：外显子—内含子交界处序列5’端含GU：5’-AG↓GUAAGU-3’(供体位点)3’端含AG：5’-PyPyPyPyPyPyNCAG↓-3’(受体位点,Py：C或U)内含子剪接路径—套索结构分支位点，内含子内部含A位点，序列在酵母中完全保守为：5’-UACUAAC-3’，在动物中为5’-PyNPyPyPuAPy-3’5’剪接位点被剪开，内含子5’端连接到分支位点A2’位置，形成套索3’剪接位点被剪开，内含子以套索形式释放，左右外显子相连剪接装置中心是细胞核小RNA(snRNA)剪接装置/剪接体，参加剪接非mRNA装置，包含核小核糖核蛋白snRNP(snRNA+蛋白)和其它相关蛋白。中心组分：五种snRNA(U1、2、4、5、6)待命复合体：起始剪接。U1+SF1等前剪接复合物：与分支位点结合。待命+U2剪接体：3’剪接点套索。前剪接+U4/5/6选择性剪接使转录组和蛋白质组比基因组更复杂第三节

蛋白质合成蛋白质合成三种RNA1)mRNA：密码子，指导蛋白质合成2)tRNA：反密码子，识别并转运氨基酸3)rRNA：核糖体主要成份三个过程1)翻译起始2)肽链延伸3)翻译终止mRNA与密码子mRNA上每3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上1个氨基酸，称为密码子(codon)。

密码子特征连续性：一个接一个吞并性：多个密码子对应某一个氨基酸同义密码子通用性：多物种通用、多细胞通用、多基因通用特殊密码子起始密码子(AUG)，也编码甲硫氨酸(Met)终止密码子(UAA,UAG,UGA)

tRNA与反密码子tRNA三叶草结构受体臂连接氨基酸(氨酰化)反密码子臂与mRNA配对密码子—反密码子相互作用特异性密码子与反密码子配对摆动性密码子第三个核苷酸与反密码子第一个核苷酸配对不严格1)G-U配对2)反密码子中第1位次黄嘌呤(I)可与A、C、U配对rRNA与核糖体核糖体是把氨基酸组装成蛋白质工厂rRNA是核糖体主要成份之一核糖体能够解离成大小两个亚基核糖体有三个tRNA结合位点A位点：新到来氨酰tRNA结合位点P位点：肽酰tRNA结合位点E位点：去氨酰tRNA释放位点所以tRNA在核糖体中移动次序是A到P到E（与mRNA方向相同）。翻译因子参加了蛋白质合成起始因子：细菌IF；真核eIF延伸因子：细菌EF;真核eEF释放因子：细菌RF；真核eRF核糖体再循环因子：细菌RRF翻译起始细菌和真核生物翻译方式上主要差异阶段细菌：翻译起始复合体直接建立在起始密码子上mRNA序列上有核糖体结合位点真核：间接定位起始位点需要帽子结构和polyA尾介导

细菌SD序列细菌mRNA中核糖体结合位点，与核糖体16SrRNA结合位于起始密码子上游3-10核苷酸之间细菌翻译起始真核生物翻译起始前起始复合体组装前起始复合体：40S亚基+起始tRNA+起始因子帽结合复合体（起始因子）使前起始复合体结合于mRNA5’端polyA结合蛋白（PAB)与帽结合复合体一起时前起始复合体结合于mRNA5’端真核生物翻译起始翻译延伸氨酰tRNA结合到A位（氨酰tRNA*EF-Tu*GTP复合体)与P位氨基酸形成肽键易位（EF-G*GTP)脱酰化tRNA，EF-G，GDP释放翻译终止终止反应本身需要从最终一个肽酰-tRNA上释放肽链终止后反应需要释放tRNA和mRNA，并解聚核糖体

第三节

蛋白质加工与命运蛋白质加工折叠，需要分子伴侣水解，蛋白酶前肽剪切信号肽切除多蛋白水解加工化学修饰低等生物内含肽剪切蛋白质折叠：正确三级结构蛋白质变性(去折叠、不正确折叠)与复性(正确折叠)一些小分子蛋白当去除变性剂时含有自动折叠能力大分子蛋白质经常不能自发折叠当变性剂去除后，这些蛋白含有形成不溶性聚合体趋势。这是因为在普通折叠路径第一步，多肽试图防止其疏水集团与水接触，这时多肽会形成相互纠缠网络。大蛋白倾向于陷入无效折叠支路中，即形成不正确折叠可能更大