DB37-T 4101-2020 苹果轮纹病菌快速检测方法

ICS65.020.20B16

DB37山 东 省 地 方 标 准DB37/T4101—2020苹果轮纹病菌快速检测方法Rapiddetectionofbotryosphaeriadothidea20202020083120201001山东省市场监督管理局发布前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省烟台市农业科学研究院。本标准主要起草人：王英姿、刘保友、汪少丽、王培松、石洁。苹果轮纹病菌快速检测方法范围本标准规定了用环介导等温扩增（LAMP）快速检测苹果轮纹病菌的测定方法。本标准适用于苹果叶片、枝条和果实中苹果轮纹病菌的快速检测。方法检出限：10-7ng/μL苹果轮纹病菌DNA。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测原理ITSBstITS基DNASYBRGreenIDNADNA000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不DNASYBRDNA缩略语下列缩略语适用于本文件。LAMP：环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）ITS：内转录间隔区（Internaltranscribedspacer）2×LampMasterMix：等温扩增PCR混合液Bst酶：BstDNA聚合酶（BstDNApolymerase）除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水为GB/T6682中规定的一级水。42 CR（2amPRMaterMi1)40molLTi-C20mmol/(NH)SO、20mmol/LKC1（pH8.8）16mmol/LMgSO42.0mmol/LdNTPs、0.2Trion42 BstDNA8U/μLSYBRGreenI1000ITSbp，引物序列见附录ADNADNA-EZReagentsAll-DNA-Fast-Out2)5mol/L0.1mL、1.5mL70mm6.2mm9.5mm6.165±380℃±16.20.5μL～10μL10μL～100μL，100μL～1000μL（Valsamali）DNA（Botryosphaeriadothidea）DNADNA0.5cm×0.5cm（），1.5mLDNA100μLDNA1.5mL5min80±1510min～30minLAMPLAMP（上海认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。（上海认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。LAMP2DNA1μL表1LAMP组分工作液浓度加样量反应体系最终浓度外引物1（F3）10μmol/L0.5μL0.2μmol/L外引物2（B3）10μmol/L0.5μL0.2μmol/L内引物1（FIP）10μmol/L2μL0.8μmol/L内引物2（BIP）10μmol/L2μL0.8μmol/L环引物1（LF）10μmol/L1μL0.4μmol/L环引物2（LB）10μmol/L1μL0.4μmol/LLampPCRMasterMix2×12.5μL1×BstDNA聚合酶8U/μL0.5μL0.16U/μL甜菜碱5mol/L4μL0.8mmol/LDNA模板-1μL-水-补足至25.0μL-65±360min，80110min（7.5防污染措施环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T27403中附录D规定。8结果判定22附录A（资料性附录）苹果轮纹病菌ITS基因特异性序列ITS（accessionno.MN559436.1）1ATTGCGCCCTTTGGTATTCCGAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAAGC61TCTGCTTGGTATTGGGCACCGTCCTTTGCGGGCGCGCCTCAAAGACCTCGGCGGTGGCGT121CTTGCCTCAAGCGTAGTAGAACATACATCTCGCTTCGGAGCGCAGGGCGTCGCCCGCCGG181ACGAACCTTCTGAACTTTTCTCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAAC注：下划线所示部分为引物扩增匹配区段。1（F3，5’-3’）：TGCCTGTTCGAGCGTCAT2（B3，5’-3’）：TCCGAGGTCAACCTTGAGAAF1cF2B1cB2内引物2（BIP，5’-3’）：GCGTCTTGCCTCAAGCGTAGTGTTCAGAAGGTTCGTCCGG环引物1（LF，5’-3’）：G