DB37-T 3824.4-2019 青贮饲料质量检测与评价技术规范　第4部分：青贮饲料霉菌毒素检测技术规程-（高清版）

ICS65.120B46

DB37山 东 省 地 方 标 准DB37/T3824.4—2019Technicalspecificationforsilagequalitytestingandevaluation—Part4:Technicalregulationofmycotoxindetectioninsilage2019Technicalspecificationforsilagequalitytestingandevaluation—Part4:Technicalregulationofmycotoxindetectioninsilage2019122420200124山东省市场监督管理局发布前言DB37/T3824—2019《青贮饲料质量检测与评价技术规范》分为4个部分：——第1部分：全株玉米制作青贮饲料机械揉搓质量评价技术规范；——第2部分：青贮玉米中可吸收淀粉含量的测定；——第3部分：多功能饲草粉碎机作业质量技术规范；——第4部分：青贮饲料霉菌毒素检测技术规程。本部分为DB37/T3824—2019的第4部分。GB/T1.1—2009青贮饲料质量检测与评价技术规范第4部分：青贮饲料霉菌毒素检测技术规程范围本标准适用于青贮饲料中的霉菌毒素的检测。GB/T18980乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法GB/T28716饲料中玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和柱净化-高压液相色谱法GB/T28718饲料中T2毒素的测定免疫亲和柱净化-高压液相色谱法下列术语和定义适用于本文件。3.1enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA3.2高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC3.5×104kPa试剂本标准所用试剂，凡未指明规格者，均为分析纯，水为蒸馏水或同等纯度的水。（TMB）4.1.8吐温-204.1.930（30%H2O2）。T-2ELISAH9.6.59g（a2CO2.93gaHC1000mL0.05%吐温-20pH7.4（PBS-T）（KH2PO4）0.2g（Na2HPO4•12H2O）2.9g（NaCl）8.0g（KCl）0.2g-200.5mL1000mLpH5.0——乙液：0.2mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4），即称取磷酸氢二钠71.7g，加水至1000mL；——取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即可。4.2.450μLTMB（10mgTMB1mL——乙液：0.2mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4），即称取磷酸氢二钠71.7g，加水至1000mL；——取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即可。4.2.450μLTMB（10mgTMB1mL＋10mL305霉菌毒素标准溶液用甲醇配成1mg/mL霉菌毒素贮备液，-20℃冰箱贮存。于检测当天，精确吸取贮备液，用20%甲醇的PBS（配制方法PBS-T，不加吐温-20即可）稀释成制备标准曲线的所需浓度。6仪器所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡，用自来水、蒸馏水冲洗。（4096。0.2mL10mL7测定步骤7.1提取2020g，置200mL8mL100mLh25mL90℃水浴上通风挥50mL250mL20（4：1）1.5min15min0.5g0.40.1g7.13mL3mL9520PBSELISAELISA100μL，433min100μL，37℃30min。1mol/L50μL450nm9计算试样霉菌毒素浓度按式（1）计算：（ng/g33min100μL，37℃30min。1mol/L50μL450nm9计算试样霉菌毒素浓度按式（1）计算：（ng/gCV1D1V2m (1)式中：C（ng）V1，mL；V2Dm――样品质量，g。10精密度每个试样称取两份进行平行测定,以其算术平均值为分析结果。其分析结果的相对相差应不大于20%。11高效液相色谱测定技术（HPLC）11.1试剂本标准所用试剂，凡未指明规格者，均为分析纯，水为蒸馏水或同等纯度的水。仪器（。C18150mm4.6mm5um365nm435nm11.3.3（25：75）流速：1.0mL/min20μL。取霉菌毒素标准品，用乙腈稀释成0.5ug/mL的标准储备液。根据使用需要，准确吸取10μL、20μL、50μL、100μL、200μL的霉菌毒素标准储备液，置5mL的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，配成相当于1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的标准工作液。取霉菌毒素标准品，用乙腈稀释成0.5ug/mL的标准储备液。根据使用需要，准确吸取10μL、20μL、50μL、100μL、200μL的霉菌毒素标准储备液，置5mL的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，配成相当于1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的标准工作液。称取过20目筛粉碎的混匀试样5g，置于50mL离心管中，加2mL水和30mL甲醇。将预提液用高速均质器在9500r/min，高速匀质5min，超声提取30min。将匀质提取液在6000r/min下离心15min，收集上清液并移入250mL分液漏斗中。30mL2min50mL100mLmLmL分50mL506000r/min5min，注入将免疫亲和柱连接于50mL玻璃注射器，准确移取50.0mL净化测试溶液，注入玻璃注射器；将空气压力泵与注射器连接，调节压力使测试溶液以约2mL/min～3mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2mL～3mL空气通过柱体。冲洗更换10mL10mLmL/min洗脱mLmL/min～2mL/min2～42min30将收集的上清液用10%乙腈定容后上液相色谱仪测定。将收集的上清液用10%乙腈定容后上液相色谱仪测定。测定1ng/mL、ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL20uL精密量取供试品溶液20uL，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于霉菌毒素的量。12计算试样霉菌毒素浓度按式（2）计算：（ng/gCV1/r/