DB37-T 3880-2020 鸭疫里默氏杆菌病诊断技术规程-（高清版）

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DB37山 东 省 地 方 标 准DB37/T3880—2020鸭疫里默氏杆菌病诊断技术规程2020-03-162020-03-162020-04-16山东省市场监督管理局发布前 言本标准按照GB/T1.1－2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。鸭疫里默氏杆菌病诊断技术规程范围GB4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范~8急性型2～31～3慢性型4～73.4判定标准3.13.23.3除非另有规定，实验室诊断所用化学试剂均为分析纯；试验用水符合GB/T6682二级水的规定；实验室生物安全要求按照GB19489执行。CO2A.1）（A.2）取样按NY/T541GB4789.285%～10CO2的3724h～48h4.1.3.31mm～2mm0.2μm～0.5μm，长为μm～5μm，呈丝11μm～24μm分离的细菌如同时符合4.1.3.3和4.1.3.4，可判定为疑似鸭疫里默氏杆菌。PCRPCR4.2.1.1.5：0.5µL～10µL；2µL～20µL；20µL～200µL；100µL～1000）KPBS（B.1）TE（B.2）。SDS（B.3）（B.4）。TAE（B.5）1.0g～5.0g，按10%（g/mL）PBS磨匀浆。-20℃保存备用。取100μL组织匀浆液加入400μLTE中充分混匀，再加终浓度为1%的SDS和100μg/mLK，置56℃水浴消化2h75%40μLDEPCDNA，作为PCR20DNADNA挑取4.1.3.2可疑菌落，加到含20μL灭菌去离子水的PCR离心管中，压紧管盖，煮沸10min，再冰浴10min后离心取上清作为PCR模板样品。或者用商品化的DNA提取试剂盒提取DNA。引物根据GenBank16sRNA475bpGATAGTTGGTGAGGTAA-3’RA-002R:5’-ATCGGTGTTCTGAGTAAT-3’PCR反应体系为25µL，配制见表1。表1PCRPCR反应体系中各成分每个样品反应组分用量/µL10×PCRbuffer2.52.5mmol/LdNTP2.010µmol/L引物F0.510µmol/L引物R0.55U/µLTaqE0.5模板1.0无RNA酶去离子水18.0总体积25.0采用以下反应程序进行扩增：——第一阶段：95℃5min；——第二阶段：95℃30s，56℃30s，72℃40s，共进行30个循环；——第三阶段：72℃10min。PCR扩增也可使用商品化的PCR试剂盒，按说明书要求操作。电泳反应结束后取10.0反应结束后取10.0µLPCR产物与1.0µL10×上样缓冲液混合，加到1%琼脂糖凝胶板的加样孔中，同时设DNA分子量标准参照，以5V/cm电压进行电泳20min～40min，在凝胶成像仪上观察结果。在阳性质控出现一条大小475bp的单一条带，同时阴性质控无此条带的情况下，检测结果成立。C。实时荧光定量PCRPCR4.2.2.1.40.5µL～10µL；2µL～20µL；20µL～200µL；100µL～10004.2.2.1.5RNAPCR）KSDSPCR参见4.2.1.3.1。参见4.2.1.3.2。引物根据GenBank16sRNA190bpGGAATGAGTAGTGTAG-3’RA-004R:5’-GCTTAGTCTCTGAACCATATAG-3’PCR表2荧光PCR反应体系配制——第一阶段：95℃2min；表2荧光PCR反应体系配制——第一阶段：95℃2min；——第二阶段：95℃20s，57℃1min，共进行40个循环，57℃时收集荧光。反应结束后根据分析软件得出的Ct值和扩增曲线来判定结果。Ct＜28.04.2.2.5.3.2结果的判定反应体系中各成分每个样品反应组分用量/µL2×SYBRPremix10.010µmol/L引物P31.010µmol/L引物P41.0模板2.0无RNA酶去离子水6.0总体积20.0Ct≤30CtCt值≥3530＜Ct值＜35CtE符合3.4临床诊断规定的疑似病例经4.2.1和4.2.2中的任一方法检测，结果为阳性者，可判定为鸭疫里默氏杆菌病。附录A（规范性附录）试剂的配制PBS（0.01mol/L，pH7.2）氯化钠8.00g氯化钾0.2mL磷酸二氢钾0.2mL磷酸氢二钠2.89g硫柳汞0.1g去离子水加至1000mL100kPa15min灭菌，置4℃冰箱保存备用。100kPa15min灭菌后备用。A.320%SDSA.41.0%琼脂糖凝胶加热完全融化，待冷至50℃～60℃时，加Goodview溶液5100kPa15min灭菌后备用。A.320%SDSA.41.0%琼脂糖凝胶加热完全融化，待冷至50℃～60℃时，加Goodview溶液5µL，摇匀，倒入电泳板上，凝固后取下梳子，备用。A.550×TAE缓冲液羟基甲基氨基甲烷（Tris）12.11g乙二胺四乙酸二钠3.72g水800mLHCl调PH至8.0水加至1000mL十二烷基硫酸钠20g水80mLHCl调PH至7.2水加至100mL琼脂糖1.0g1×TAE电泳缓冲液加至100mL羟基甲基氨基甲烷（Tris）242.0g冰乙酸57.1mL0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（PH8.0）27.5mL灭菌去离子水加至1000mL2℃～8℃保存。附录B（规范性附录）培养基的配制牛肉0.5蛋白1.0氯化0.5琼脂1.0100kPa20min50℃～605mL4℃麦康粉50琼脂10去离子水加至1000mL，100kPa15min灭菌，置2℃～8℃冰箱保存备用。附录C（资料性附录）