细胞培养技术3课件

细胞培养技术一、细胞培养的基本原理细胞培养：模拟体内的生理环境，在适当的条件下，使活体组织细胞在体外环境存活、生长增殖，借以观察细胞的生长、繁殖、衰老等生命现象。

贴壁型细胞：

必须贴附于支持物表面才能生长。大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞。悬浮型细胞：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面，见于某些癌细胞和血液淋巴细胞。1.培养细胞的分类：

成纤维细胞型胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状、火焰状、漩涡状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌细胞等等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。血管平滑肌细胞

上皮型细胞细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜，生长时呈膜状移动，起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。游走细胞型在支持物上呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。

多型细胞型有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长，或以机械方法使保持悬浮状态下生长来自血，脾或骨髓在悬浮中生长良好，细胞圆形，单个或小细胞团生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，于收获，可获得稳定状态观察不方便悬浮型细胞特点：悬浮型细胞2.培养细胞的生长和增殖过程

单个细胞的生长过程：细胞周期培养细胞生命期所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。传代期：

初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。衰退期：

此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化。转化的标志之一是细胞可能获得永生性或恶性性。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。潜伏期：

细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。初代培养细胞潜伏期长，约24～96小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6～24小时；细胞接种密度大时潜伏期短。指数增生期：

是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段。培养物中细胞数量呈指数增长,细胞群体均一，是理想的实验用细胞。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3～5天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制。细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。停滞期：

细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平台期。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需传代做分离培养，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。压力蒸汽消毒锅：湿热消毒，用途广。滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如合成培养基、血清、酶液等均采用孔径小于0.22m的滤膜过滤。

超净工作台：为细胞操作提供无菌环境。紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒。

无污染(无菌)环境基质(支持物)玻璃基质塑料基质气体环境、温度、湿度CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-CO2:5%温度：37ºCpH值控制平衡盐溶液：PBS，Hank’s，D-hank’s(无钙镁；离子)等。培养基：天然培养基(如血清)；合成培养基(如市售DMEM、RPMI-1640培养基)。合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基(如血清)。水：新鲜配置的三蒸水或去离子水。液相环境二、细胞培养的基本方法体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。1.无菌操作技术

培养前准备

在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。

为了做好培养前准备工作，宜制定出分门别类的操作卡片，包括操作程序卡片；如“分装血清”、“原代培养”、“传代培养”、等等。各卡片上记有需用器材和物品名称、要求及数量等，这对初学者尤为重要。这样做的好处是实验者可按卡片收集所用物品，清点无误后，把用品放置于操作场地，然后进行消毒，可避免操作开始后，因物品不全在往返拿取时增加污染机会。培养室的消毒

无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。

洗手和着装

原则上和外科手术相同。并于开始操作前要用75％酒精消毒手和前臂。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。培养过程中的无菌操作

在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。为便于拿送用品，工作台面上的用品要有合理的布局；原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以免打翻东西。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。培养过程中的无菌操作

工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在末做处理之前，勿过早暴露在空气中。培养液在末用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。吸取培养基、PBS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。2.基本培养操作技术

原代培养

用直接从机体获得的细胞进行的培养称为原代培养。这种培养过程主要是采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经酶消化处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。原代培养是建立各种细胞系的第一步。动物细胞原代培养过程图

传代细胞培养

离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养，细胞将逐渐衰老死亡。传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到另一培养瓶的培养。贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞则用直接传代法或离心法传代。※贴壁细胞传代培养方法与步骤（1）选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯旁，倒去瓶中的旧培养液，加入2～3ml的PBS液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片。（2）加入1.5mL0.25％胰蛋白酶消化液(玻璃培养瓶)，37℃消化2～3min，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液(若消化过度，可不倒去酶液)。（3）用PBS液洗涤1次(可省略)，加入3mL培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。（4）细胞计数后，以1：2或1：3进行分装(或以适当密度接种于培养板进行药物实验)，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37℃CO2培养箱培养。（5）观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。细胞计数血细胞计数板：手工计数细胞a.将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。b.将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，注意盖片下不要有气泡c.镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算：

细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。细胞的冻存与复苏所谓冷冻保存，就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度，并在此温度下对其长期保存的过程。而复苏就是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。低温保护剂的应用在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。3.细胞培养的污染、检测与控制

微生物污染空气、器材、操作、试剂、组织标本微生物污染的检测细菌和真菌的污染和检测肉眼直接观察法培养检查法显微镜观察法支原体的污染和检测造成支原体高污染率的原因：1.支原体大小0.1－0.8um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45um）；

2.支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化；

3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式；

4.细胞流通间缺乏物品管理，造成实验室间的相互污染；

5.研究或操作人员忽略污染问题；6.已受污染的细胞；

7.已受污染的培养基、血清。支原体之检测：

相差显微镜观察法、电镜法Hayflick培养基直接培养法DNA荧光染色法

PCR方法微生物污染的控制抗生素除菌法加温处理细胞培养常见问题解答培养液pH值变化太快CO2张力不对培养瓶盖拧得太紧松开瓶盖1/4圈NaHCO3缓冲系统缓冲力不足加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度

细菌、酵母或真菌污染丢弃培养物或用抗生素除菌培养液出现沉淀，同时pH发生变化细菌或真菌污染丢弃培养物抗生素除菌培养细胞不贴壁胰蛋白酶消化过度缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度支原体污染分离培养物，检测支原体。清洁