PNH-阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测解读

阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测

李智伟第一页，共三十七页。PNH

(paroxysmalnocturnalhemoglobinuria)是一种罕见的获得性克隆造血干细胞疾病。但近年来有增多趋势。我国北方多于南方。半数以上发生在20-40岁青壮年。男性多于女性，与遗传及种族无关。本病起病隐袭缓慢，呈慢性过程，以贫血、出血为首发病症者较多，以血红蛋白尿起病者较少。第二页，共三十七页。第三页，共三十七页。血红蛋白尿

睡眠有关，早晨较重，下午较轻

尿液外观为酱油或红葡萄酒样;伴乏力、胸骨后及腰腹疼痛、发热等

第四页，共三十七页。原因因为补体作用最适宜的pH是6.8～7.O，而睡眠时呼吸中枢敏感性降低，酸性代谢产物积聚

第五页，共三十七页。第六页，共三十七页。研究历史Strubing第一次报道PNH

Ham和Dingle证明了PNH患者的红细胞在血清酸化条件下，易发生溶血，这就是现在普遍使用的Ham实验1983年证实PNH患者GPI合成异常1993年pig-a基因突变第七页，共三十七页。流式细胞术

原理：X染色体上PIG-A〔造血干细胞经获得性体细胞基因〕突变导致糖化肌醇磷脂(GPI)锚合成障碍导致由GPI锚接在细胞膜上的一组膜蛋白丧失，包括CD16、CD55、CD59等第八页，共三十七页。第九页，共三十七页。GPI锚连接蛋白补体调接蛋白衰变加速因子(DAF或CD55)、膜攻击复合物抑制因子(MACIF或MIRL或CD59)、补体C8结合蛋白(HRF或C8bp)、膜辅助蛋白(MCP)。

粘附分子淋巴细胞功能相关抗原-3(LFA-3或CD58)、Blast-1/CD48、CD67、CD66。第十页，共三十七页。GPI锚连接蛋白酶类红细胞乙酰胆碱脂酶(AchE)、中性粒细胞碱性磷酶酸酶(NAP)、5’外核酸酶(CD73)。受体类中性粒细胞III型Fc受体(FcRIIIb或CD16)、单核细胞分化抗原(CD14)、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(u-PAR)。血型抗原CD55携带的Comer抗原、AchE携带的Yt抗原。第十一页，共三十七页。1型细胞CD59完全阳性第十二页，共三十七页。补体激活途径C1C1C2,C4C4b2b(C3转化酶〕C3C3bP〔备解素〕PC3bBbC3bB

(C5转化酶〕C4b2b3b或PC3bBbC8C9C6C7C5C5bC5b678C5b-9(MAC)CD59替代途径经典途径CD55Ag-Ab第十三页，共三十七页。分析1.红系及粒系FSC/SSC设门 报告标本中CD55、CD59阴性比例第十四页，共三十七页。做20~30份正常人血样划定阳性区〔Ⅰ区〕范围同型阴性对照界定Ⅲ区范围，中间的区域即为Ⅱ区。第十五页，共三十七页。第十六页，共三十七页。根据CD59可以将PNH细胞分为3型1型细胞CD59完全阳性正常细胞2型细胞CD59局部阳性补体中度敏感细胞3型细胞CD59完全阴性补体敏感细胞第十七页，共三十七页。第十八页，共三十七页。第十九页，共三十七页。第二十页，共三十七页。CD55和CD59同时局部或完全缺失是PNH的典型表现，单GPI缺失不能确诊。CD59重要性大于CD55单CD55缺乏时并不因此改变红细胞对补体的敏感性而造成溶血CD59的缺失会增加补体的敏感性临床上以CD59缺失作为诊断标准是一个趋势。解决了一切以补体溶血为根底的实验诊断方法在诊断PNH的不确定性意义第二十一页，共三十七页。其它细胞的PNH检测PNH患者的红细胞、粒细胞、单核细胞及淋巴细胞上GPI锚连膜蛋白局部或全部丧失。粒细胞>单核细胞>淋巴细胞>红细胞骨髓PNH克隆出现比外周血早，网织红细胞略早于红细胞第二十二页，共三十七页。其它细胞的PNH检测应用FSC/SSC设门分析时会有许多脱颗粒的中性粒细胞，这时只使用物理特征无法准确设定粒细胞门了，这时必须使用系列标志/SSC设门:CD15，CD33。CD64设门，分析单核CD14,CD55,CD59，PNH病人检测GPI缺乏的血小板不容易分辨不能只根据淋巴细胞上GPI相关蛋白的表达来诊断。

第二十三页，共三十七页。与其他实验比较1.酸溶血试验(Ham试验)患者红细胞与含5%盐酸的正常同型血清混合，pH6.4，37℃孵育2小时，溶血明显。本试验特异性高，敏感性差。2.蛇毒因子溶血试验蛇毒因子能通过补体交替途径，使补体敏感的红细胞发生溶血。本试验特异性强，敏感性优于酸溶血试验。3.热溶血试验和蔗糖溶血试验

因特异性差，常作为筛选方法。第二十四页，共三十七页。具有PNH克隆的血液病

检测粒细胞GPI锚连蛋白表达

病种检测例数缺失例数(%)AA11525(22%)MDS399(23%)并发现MDS有PNH表达者ATG〔人胸腺细胞免疫球蛋白〕治疗有效

(AnInternMed1999，131:401)第二十五页，共三十七页。PNH和AA关系相当密切，可以相互转化且并存AA→PNH较多(15%)，PNH→AA少20%`~30%PNH可伴骨髓再障AA(ATG治疗后)→PNH10~31%AA-PNH综合征16.5%(我国)50%AA外周血或骨髓可检出PNH克隆AA→PNH生存率要高于PNH→AAMDS-RA如捡出PNH克隆者预后好，且ATG(人胸腺细胞免疫球蛋白)治疗有效。PNH对AA和MDS的“自然治疗〞，而“AA救了PNH〞。第二十六页，共三十七页。PNH克隆见于淋巴增殖性疾病检测病种例数

NHL87HD55红细胞CD55/CD59CLL49缺失检出率9.2%ALL22HCL4

(HematolJ2001，2:33)

第二十七页，共三十七页。PNH克隆见于浆细胞病检测红细胞CD55/CD59缺失

病种检测例数缺失例数(%)MM626WM72MGUS61HCD21

合计7710(12.9%)

(IntJHematol2002,75:40)第二十八页，共三十七页。FLAER嗜水气单胞菌溶素变异体(FLAER)。1998年Diep等报道嗜水气单胞菌(HEC)毒素能特异地与细胞膜上GPI锚连蛋白结合，随后立即聚合成多具体，插入细胞膜脂质双层，在膜上形成孔洞致溶破。PNH细胞缺乏GPI蛋白而抵抗毒素保持细胞完好。第二十九页，共三十七页。FLAERFLAER在所有具有GPI锚连蛋白的白细胞上都有特异性表达，所以正常人及非PNH贫血FLAER成100%阳性。是目前诊断PNH最敏感、特异的方法。FLAER对PNH克隆检出的敏感性为0.1%，其它靶向标记检出率的敏感性为1%；第三十页，共三十七页。结果分析1.设门CD45/SSC2.标记CD15，CD14，CD45，FLAER 检测PNH粒、单核及淋巴细胞，报告标本中各系细胞FLAER阴性比例第三十一页，共三十七页。第三十二页，共三十七页。第三十三页，共三十七页。FLAER目前FLAER一般用于有核细胞的检测，不能评价红细胞的PNH克隆。由于红细胞外表没有气单胞菌溶素前体产生所需要的蛋白水解酶类，尽管表达在红细胞外表的血型糖蛋白不是锚连蛋白，但是由于血型糖蛋白与气单胞菌溶素前体结合力较弱，因此限制了FLAER在红细胞中的应用。第三十四页，共三十七页。与CD55、CD59比较，Flaer对PNH患者对中性粒细胞的测定最为清晰、准确临床上高度疑心，而CD55、CD59不能确诊的病例，可以结合F1aer检查，获得明确诊断第三十五页，共三十七页。谢谢！第三十六页，共三十七页。内容总结阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测。做20~30份正常人血样划定阳性区〔Ⅰ区〕范围。CD55和CD59同时局部或完全缺失是PNH的典型表现，单GPI缺失不能确诊。本试验特异性强，敏感性优于酸溶血试验。3.热溶血试验和蔗糖溶血试验因特异性差，常作为筛选方法。PNH细胞缺乏GPI蛋白而抵抗毒素保持细胞完好。谢谢第三十七页，共三十七页。冬季瘙痒症大头医生编辑整理英文名称pruritushiemalis

别名asteatoticeczema；eczemacraquele；prurigohiemalis；冬令瘙痒；冬令瘙痒症；冬令湿疹；干性湿疹；干燥性瘙痒；裂隙性湿疹；皮脂缺乏性湿疹类别皮肤科/神经功能障碍性皮肤病/痒疹ICD号I28.2概述冬季瘙痒症又称皮脂缺乏性湿疹(asteatoticeczema)，裂隙性湿疹(eczemacraquele)，冬令湿疹。主要见于老年人皮肤，特别是小腿、前臂和手部发生以干燥和发裂为突出的湿疹样皮炎。流行病学本病好发于夏季，有过敏体质的人多发，婴幼儿的发病率高于成年人。病因皮肤中皮脂缺乏及水分丢失可能是主要的原因。而造成皮脂缺乏的因素很多，有皮肤自然干燥伴明显皮脂缺乏、年龄(老年者)、疾病、营养不良、皮肤萎缩、硬化、缺汗、内分泌功能减退、环境湿度、角层贮藏水分的完整性破坏等。发病机制某些疾病如癌症、肝胆疾病、HIV感染、营养不良、药物或接触某些化学物质导致表皮水分减少、皮肤干燥等均可发生皮肤瘙痒，经常搔抓进而出现炎症而发病。临床表现皮肤干燥，或有少许柔软细薄鳞屑，皮肤皱纹清楚，因血流缓慢，局部温度比正常低。掌部皮肤较粗糙，特别在指垫处，纹路宽深，重者出现裂隙。因反复搔抓后可发生炎性程度不同的湿疹，以丘斑疹为主，水疱、糜烂或渗出较少。反复发生，病程慢性，可经久不愈。患者皮肤可见开裂，开裂可以分为3个阶段，称为皴裂、?裂和皲裂，皴裂可见于冬季老年人的腿部，特别是小腿伸侧，天然带方形鳞屑，像鱼鳞一样，边缘可略为翘起，中心黏着，剥之易脱落，但又重新长出；可无主观感觉，或稍有不同程度的痒感。临床表现老年人鳞屑较多，抓之层层脱落。如裂纹稍深，像?背一样，称?裂。皲裂主要发生于手足，较深而痛，重者出血。本病好发于老年人，亦常见于秋风后，小腿的皮肤，特别是小腿伸侧。并发症目前没有相关内容描述。实验室检查目前没有相关内容描述。其他辅助检查目前没有相关内容描述。诊断皮肤干燥，局部温度比正常低。皮肤较粗糙，可见皮肤开裂，见于冬季老年人的腿部，特别是小腿伸侧，天然带方形鳞屑，像鱼鳞一样，边缘可略为翘起，中心黏着，剥之易脱落，但又重新长出；就可考虑本病。鉴别诊断