分子病理学实验基础

分子病理学实验基础随着分子生物学技术的发展，病理学科在认识疾病，探讨疾病的发生、发展的基础研究方面，从原来的表型分析水平深入到基因分析水平；在疾病的诊断方面，从传统病理形态诊断(组织病理诊断)进展到基因诊断。分子生物学技术的应用，对研究疾病的病理变化和病变机制在传统病理学基础上有了比较大的进步，能较特异、灵敏而快速地对一些传染病、代谢或内分泌疾病、遗传性疾病等作出诊断，对于肿瘤的诊断、鉴别诊断、评价疗效和估计预后提供了基因分子水平的指标。第一节DNA的基本知识核酸由脱氧核糠核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)组成。在真核生物细胞中，DNA主要存在于细胞核内，线粒体、叶绿体也含有DNA，RNA主要分布在细胞浆内。核酸的单体单位是核苷酸(有3个特有的成分组成即碱基、戊糖和磷酸)。参与DNA组成的碱基有腺嘌吟(A)、鸟嘌吟(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。所有DNA中的A=T，G=C，因此A+G=T+C。DNA碱基组成只有种的特异性，而没有组织和器官的特异性。DNA由2条反向平行的磷酸核糖骨架并互相绕成双螺旋结构；通过互补的碱基形成氢键，互相紧密地结合在一起形成碱基对。核酸形成DNA复制是按碱基配对的方式，以一条链为模板形成另一条互补的新链。这种复制的稳定性和准确性，是DNA具有遗传信息贮存和传递的分子基础。一、DNA的理化性质DNA的紫外吸收DNA在240-290nm的紫外波段具有强烈的吸收值。最大吸收值在260nm附近；蛋白质在280nm处。分光光度计测量：样品必须是均一的，摇匀后再测量结果会准确些。它是利用分光光度法对物质进行定量定性分析。核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD的吸光值分别相当于50ug/ml的dsDNA，37ug/ml的ssDNA，40ug/ml的RNA，。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。（二） DNA的沉降特性溶液中的核酸分子在引力场中可以下沉。不同构象的核酸（线形，开环，超螺旋结构）、蛋白质及其他杂质在超离心机的强大引力场中，沉降的速率有很大差异，所以可以用超离心法纯化核酸，或将不同构象的核酸进行分离，也可以测定核酸的沉降常数与分子量。应用不同介质组成密度梯度进行超离心分离核酸时，效果较好。RNA分离常用蔗糖梯度。分离DNA时用得最多的是氯化铯梯度。氯化铯在水中有很大的溶解度。可以制成浓度很高（8mol/L）的溶液。应用啡啶漠红一氯化铯密度梯度平衡超离心，很容易将不同构象的DNA、RNA及蛋白质分开。这个方法是目前实验室中纯化质粒DNA时最常用的方法。如果应用垂直转头，当转速为65000r/min（BeckmanL-70超离心机），只要6h即可以完成分离工作。但是如果采用角转头，转速为45000r/min时，则需36h。离心完毕后，离心管中各种成分的分布可以在紫外光照射下显示得一清二楚。蛋白质漂浮在最上面，RNA沉淀在底部。超螺旋DNA沉降较快，开环及线形DNA沉降较慢。用注射针头从离心管侧面在超螺旋DNA区带部位刺入，收集这一区带的DNA。用异戊醇抽提收集到的DNA以除去染料，然后透析除CsCl，再用苯酚抽提1〜2次，即可用乙醇将DNA沉淀出来。这样得到的DNA有很高的纯度，可供DNA重组、测定序列及绘制限制酶图谱等。在少数情况下，需要特别纯的DNA时，可以将此DNA样品再进行一次氯化铯密度梯度超离心分离。（三）DNA的变性与复性1、 变性DNA的双链结构称为自然状态，如果这种状态受到破坏，使DNA分子变成为单链结构，以一种紊乱的、随机的线团构型状态存在，这种状态成为DNA变性状态。从自然状态到变性状态的过程称变性。引起DNA变性的因素：温度升高引起热变性，加酸碱引起的变性等。DNA变性时，一系列理化性质随之发生改变，260nm处吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高，同时其二级结构发生改变，甚至失去生物学活性。2、 复性在一定的条件下，变性的DNA可以再变为自然状态的DNA，这一过程为复性或退火。复性作用是在生物学研究中最常用的特性。DNA-DNA之间或DNA-RNA之间的分子杂交，就是复性的应用。单链之间的复性，是一个随机的过程，复性后的DNA分子中的2条链，并不是该DNA分子变性的那2条链。溶解性DNA易溶于水，不溶于乙醇。常用的DNA样品往往是溶解在TE缓冲液.Tris+EDTA缓冲液，TE缓冲液是弱碱性，对DNA的碱基有保护性，稳定性较好，不易破坏其完整性或产生开环及断裂,包括提取好的DNA也要放在TE缓冲液是保存.二、DNA的复制DNA的复制是一个复杂的过程，有许多酶、蛋白质因子在复制中起重要作用。1、 DNA复制的特点 DNA复制的起始意味着细胞将要进行下一次的分裂。2、 DNA复制的形式半保留复制：在DNA双螺旋结构中，两条多核苷酸的链的碱基互补，在DNA的合成过程中，每一条链均可作为模板合成与原来DNA完全的DNA分子。每一代的DNA分子的一条链来自亲代，另一条链是新合成的互补链，这种复制的方式称为半保留复制。全保留复制：2个子代DNA子代分子中一个分子完全是亲代的分子，另一个分子完全是新合成的分子，这种复制方式称为全保留复制。散布式复制： 亲代链被分解成很多片段，散布在新的DNA分子中，这种复制方式称为散布式复制。第二节聚合酶链式反应聚合酶链反应(PolymreaseChainReaction，简称PCR)技术，是根据生物体内DNA复制的某些特点而设计的在体外对特定DNA序列进行快速、特异和大量扩增的一项新技术。随着热稳定性TaqDNA聚合酶的研究应用和自动化热循环仪的设计成功，PCR技术的操作程序大大简化，很快被广泛地应用于基因研究的各个顷域，对分子生物学及其相关学科的基础研究和临床诊断等方面起了重大的作用。一、PCR的基本原理PCR有2个重要特性：一是能合成DNA的特定序列；二是特定序列的大量扩增。DNA聚合酶能以单链DNA为模板，合成一个与其互补的新链DNA。将双链DNA加热至接近100°C时，DNA变性，形成单链DNA，此单链DNA可用于合成互补链的模板。PCR反应中，2条人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度下，DNA聚合酶即将dNTP中的脱氧单核苷酸加到引物3’-OH末端，并以此为起始点，沿模板以5’ 3’方向延仲，合成一条新的互补链。引物的位置将决定合成的DNA序列。PCR反应中，双链DNA的高温变性、引物与模板的低温退火和适温下引物延伸3个步骤反复（一定次数）循环。每一循环中所合成的新链，又都可以作为下一个循环中的模板。PCR的特定DNA序列产量随着循环次数呈指数增加，达到迅速大量扩增的目的。二、反应体系PCR反应体系中的基本成分应包括模板DNA、引物、4种脱氧核苷三磷酸、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。（一） 模板DNAPCR的起始材料可以是单链或双链DNA。如果起始材料是mRNA，则先要通过逆转录获得cDNA，然后cDNA模板进行PCR扩增。常用的PCR样品DNA/mRNA是从细胞中提取的。PCR样品不需要纯化，细胞加热变性所释放的DNA可直接用于扩增。若用DNA粗品做样品，应避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂及能结合DNA的蛋白质。用纯化的DNA做样品，增加了模板的浓度，除去了抑制PCR反应的杂质，可提高PCR扩增的成功率。提取DNA的基本过程：1、 用蛋白酶K及SDS，在EDTA存在的的条件下，裂解细胞，消化蛋白质，使核蛋白解聚及胞内的DNA酶失活。2、 用酚/氯仿多次提取，去除蛋白质。在DNA中若混有少量的RNA，可以用RNA酶去除。3、 最后用乙醇沉淀即可得到纯的DNA。PCR所需DNA的量极微，不到1微克的基因组DNA序列就足以进行PCR分析。PCR其至可以从1个DNA分子扩增特定的DNA序列。DNA分子是非常稳定的，使用PCR技术可以从血清、新鲜组织及石蜡包埋组织等中测出多种病原体、原癌基因和抑癌基因°PCR检测技术为医学的发展起到了不可估量的作用。（二） 引物引物是指2段与模板DNA序列侧翼片段互补的寡核苷酸。当2段引物与变性双链DNA的2条单链DNA模板退火后，两引物的5’端即决定了扩增产物的2个5’末端位置。扩增是从引物的3’延伸的，扩增片段的长度等于引物A加两引物间的序列加引物B。因此，引物决定了PCR扩增的长度、位置和结果。选挥高效而特异性强的引物是PCR成败的关键因素。引物的长度大多住20一30个碱基。引物设计：1、 寡核苷酸引物用自动DNA合成仪合成。设计引物的先决条件是与引物结合的靶DNA序列片段必须是清楚的，而与2个结合的2个片段之间的靶DNA序列未必清楚。2、 应尽可能选择碱基随机分布的序列。尽可能避免具有多聚嘌吟、多聚嘧啶或其他异常序列。3、 引物内部应避免具有明显的二级结构，尤其是发夹结构。4、 人工合成的寡核苷酸引物要用层析法或聚丙烯酰胺电泳（PAGE）法进行纯化。纯化的引物应在25%乙腊溶液中4°C保存。5、 在PCR反应体系中，引物适宜浓度为0.1-1umol/L。（三） PCR反应体系不同实验的反应条件各不相同，反应体系中有关成分包应做相应的调整。一般反应体系包括以下内容：1、 PCR反应体积一般为50ul或100ul。2、 DNA样品；反应体系还包括KCl、50mmol/L，Tris-HCl、10mmol/L（pH8.4），MgCl2、1.5mmol/L，明胶100ug/m1，每种引物0.25mmol/L。3、 各种脱氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP为0.2mmol/L，TaqDNA聚合酶以及4XdNTPs（dATP、dDTP、dGTP和dTTP）。4、 ATP贮存液的pH应为7.0，4种dNTP的浓度应相同。（四） TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶最初在美国黄石国家公园的一个温泉中发现的一种嗜热菌水生栖热菌的丫丁菌株中分离出来。产生TaqDNA聚合酶的水生栖热茵能在70-75C下生长，具有热稳定性.。大量实验表明，TaqDNA聚合在高温下不会发生不可逆性变化TaqDNA聚合酶在950C的半衰期为40min。TaqDNA聚合酶在PCR中的常用浓度为1-2.5U/100ul反应液。若酶量过多，会导致非特异性PCR产物增加；相反，酶量过少又会引起PCR产量的不足。TaqDNA聚合酶的特点：1、 简化PCR操作。TaqDNA聚合酶能抵抗PCR每次循环开始时双链DNA变性所需的高温处理，不需要在每次循环中添加新鲜酶。2、 提高退火温度，增加PCR特异性。3、 延长到达平台的循环次数，提高PCR产量。4、 能扩增较长的靶DNA序列，而不易形成二级结构。（五） 缓冲液及其它成分1、一般用10-50mmol/Ltri-HCl缓冲液，200C时PH8.3。Tris是一种双极离子缓冲液。2、适宜的Mg2+浓度：它会影响引物的退火、模板和PCR产物双链的变性温度、PCR产物的特异性、引物的二聚体的形成以及酶的活性和错掺率。各种dNTP浓度为0.25mmol/L时，Mg2+浓度为1.5mmol/L较为适宜。螯合剂EDTA和高浓度的带负电荷离子基团（如dNTP的磷酸根）对Mg2+浓度也会产生影响，因为它们可与Mg2+结合而降低Mg2+浓度。一般用作模板的DNA应溶与10mmol/Ltris-HCl、0.1mmol/LEDTA中。三、循环参数PCR扩增是由变性、退火和延伸3个步骤反复循环而实现的。循环参数是指循环中每一步骤的温度和时间，以及循环次数。（一） 变性温度和时间模板DNA和PCR产物的变性不完全，是PCR反应失败常见的原因之一。典型的变性条件是95°C，30s。对G、C含量多的靶DNA序列，宜用较高的变性温度。DNA的变性仅需要几秒钟。过度变性也是不必要的，变性温度过高、时间过长，会加快酶的失活。原则上变性步骤应高温、短时.既要保证变性充分，又要保证聚合酶在整个反应中的活性。（二） 引物迟火引物退火的温度和时间取决于引物的长度，碱基组成及在反应体系中的浓度。一般退火温度低于引物的融解温度（Tm）5C。G、C含量约为50%，20个碱基的典型寡核苷酸引物，最佳的退火温度为55C。在温度较高的条件下退火，可减少引物与模板的错配，提高PCR的特异性。在典型的PCR反应体系中，引物的浓度为0.2umol/L，在这一引物过量的条件下，退火可在瞬间完成。（三） 引物延伸引物延伸是DNA合成酶将脱氧核苷酸逐一地加入到引物的3,-0H末端、依据模板序列合成一条互补新链的过程。引物延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度。延伸步骤的时间则取决于靶序列长度、浓度和延伸温度。靶序列越长、浓度越低、延伸温度越低，则所需的延伸时间则越长；反之，靶序列越短、浓度越高、延伸温度越高，所需的延伸时间则越短。一般而言，每1000个碱基的序列，延伸1min便足够了。（四）平台效应期平台效应期是指PCR循环的后期，合成产物达到0.3-1pmol水平，由于产物的堆积，使原来以指数的增加的速率变成平坦曲线。影响因素1、 dNTP或引物等的消耗。2、 反应物（dNTP或酶）的稳定度。3、 最终产物（焦磷酸盐，双链DNA）的阻化作用。4、 非特异产物或引物的二聚体参与竞争作用。5、 在浓度大于10-8M时，特异产物的重退火（延伸率减低，TaqDNA酶消耗，产物链分叉，引物移位）。6、 变性或高产物浓度下产物分离不完全。7、 如循环次数不合理，低浓度错配的非特异产物开始大量扩增，也可以出现反应的平台期。（五）循环次数PCR的循环次数一般为25-40个周期。在PCR各项参数适宜的情况下，PCR的适宜循环次数主要取决于靶DNA的起始浓度。在设定循环参数时.还应考虑到所用的热循环仪从一温度转变到另一种温度所需的过渡时间，因此要测定管内的实际温度，要考虑到因热传导造成的管内温度滞后情况。四、模板的制备PCR扩增技术对模板的质量和数量要求不高，常规的DNA和RNA制备方法能满足PCR扩增的要求。（一）血液取15%50u1EDTA加入Ep管内，再加200u1血液轻轻混匀，12000rpm离心5s，弃上清，将沉淀悬浮于50ul溶液（10mmol/Ltris-HCl、pH7.6,5mmol/LMgCl2,10mmol/LNaCl）中，离心，弃上清，重复3次。沉淀内加入100ul的双蒸水，轻轻混匀，1000C下作用5min，12000rpm离心5min，取适量进行PCR扩增。（二） 陈旧的精斑剪碎污染物后放入Ep管内，用碱性TE浸泡30min，加入SDS和蛋白薛K使其终浓度达1%或100ug/ml，50°C消化过夜。酚、氯仿抽提，乙醇沉淀DNA。（三） 新鲜组织取1-2g组织块，剪碎，放人研钵或玻璃匀浆器，加入1-2mlPBS液，充分匀浆处理后，取0.2-0.15m1放人Ep管内再加入1%SDS、蛋白酶K（100ug/ml），消化2h；或加入1%TLS消化5min。酚、氯仿抽提，乙醇沉淀DNA。（四） 石蜡包理组织1、石蜡切片将石蜡包埋组织切5um左右厚的薄片10-15张，放人Ep管内，加入500ul的二甲苯，不时摇匀脱蜡15min,8ooorpm离心10min,重复脱蜡。然后用75%乙醇脱二甲苯2次，弃上清，沉淀处理同新鲜组织。2、微量石蜡包埋组织1） 将石蜡包埋组织切5um左右厚的薄片10-15张，放入Ep管内，加入500ulSTE,置于70-80°C水浴10min，期间不时地用滤纸吸取石蜡，反复多次，以后处理同上。2） 将石蜡包埋组织，切5um左右厚薄片10-15张，放人Ep管内，直接进行PCR扩增。3） 采用冻融一裂解法提取结核菌DNA。石蜡包埋组织切片常规脱蜡后，在经干燥沉淀后的DNA中，加入100ul的蛋白酶K，37C过夜，70~-80C速冻2-5min后，立即煮沸5min，冰浴5min后8000rpm离心数秒，取上清液适量进行PCR扩增。（五）mRNA的提取整个mRNA的提取过程均在冰浴上进行。细胞按每106（取米粒大小的新鲜组织，剪碎经玻璃匀浆器匀浆后）加100ul变性液，震荡混匀，依次加入醋酸钠、1m1饱和酚和0.2ml氯仿/异戊醇（49：1）混匀，用力震荡min，置冰浴15min，12000rpm离心15min，取水相层（mRNA）加入3倍体积的无水乙醇，-20C下作用山，离心。干燥沉淀，加水溶解RNA。五、 PCR操作程序1、 取500ulEP管，分别设实验、对照管（阳性，阴性和空白）根据不同实验条件加入各反应成分一定体积。2、 混匀上述成分后，加入模板DNA，1000rpm离心数秒，置94C作用10min，使模板DNA变性，同时灭活样品中杂酶的活性。3、 同上短时离心数秒、待冷至55C，加入2ulTaqDNA聚合酶（0.5U）摇匀。4、 加入液体石蜡20-30ul，短时离心使之分层良好。5、 设循环（94C、1min;55C、1min；72C、2min）次数30次。6、 72C延伸5min。取出扩增产物检测或置4C保存。六、 逆转录-PCR（RT-PCR）RT-PCR是以rnRNA为模板，在逆转录酶的乍用下，合成与模板DNA互补DNA（cDNA），并再以此为模板进行常规PCR的一种的方法。在检测某些基因表达和RNA病毒方面，具有实用性。1） cDNA的合成。取一定量的模板mRNA，在EP管内依次加入KCl、Tris-HCI（PH8.4）、MgCl2、dNTP、RNase抑制剂及逆转录酶，37C或42C水浴30-40min。取出Ep管，95C灭活5min，以除去逆转录酶对TaqDNA聚合酶活性的抑制。2） 取一定量的cDNA模板进行常规PCR扩增并检测。七、 PCR操作技术的有关问题及注意点（一）假阳性在PCR扩增系统中污染了模板序列，造成假阳性，会直接影响结果的判断。污染机会与PCR循环周期的次数成正相关，标本中的病原微生物、病毒的污染机会和范围是极大的。许多实验强调设阳性对照和阴性对照。应注意事项：1）样品的收集及处理过程应多换1次手套；打开EP管之前，将离心管离心，打开Ep管时要小心外溅。减少样品操作环节扣次数，样品应在其他成分加人后再加人管内，样品一旦加入管内，立即加盖。2）做阳性对照时，避免交叉污染，尤在病原体的检测方面，每次操作务必认真做阴性对照和空白对照，排除污染因素。3） 所用EP管、枪头均为一次性使用。4） 每切一份组织都要用二甲苯和无水乙醇充分擦洁切片刀。5） 所用试剂的配制、分装和保存都应在无PCR产物的环境中进行。试剂应分装保存，避免使用时造成污染。6） 实验结果应与临床联系，时有怀疑的结果要重复实验。（二）假阴性造成假阴性的因素主要与PCR整个试剂是否失效有关；DNA/mRNA提取的量及质也是关键。1） 标本存放的时间，尤其是蜡块不仅受时间的影响，而且还受固定剂类型等方面的影响，DNA分子经福尔马林固定后脆性增加，提取过程中的机械损伤更易发生断裂，因此提取的每一步都必须轻柔。2） Rnase（一种核糖核酸酶Rnase）可降解RNA。因Nase到处都有，尤其在手上，故操作者要多换一次手套，以防止RNA在制备和反转录过程中降解；提取模板时，要在冰浴上进行。3） 检查酶的活性（所用酌类应保存在-20°C中，用后应立即冻存）。4） 试剂盒中的所有成分必须贮存于-20C，尽量避免反复冻融试剂盒中的所有成分。5） PCR每一反应成分是否漏加；加完各成分后要再离心数秒，以使微量的反应成分完全参与PCR循环。6） 检查设置的每个参数是否正确。八、PCR的质量控制（一）PCR的室内控制核心问题就是要避免交叉污染，跟其他检测技术一样，PCR室内控制也是从实验室及实验室操作人员本身着手，所要强调的是，PCR对实验室及实验操作人员的要求更高，稍不注意，就因为交叉而使PCR的测定结果出现假阳性。1、实验室管理主要包括2个方面：一是PCR实验室要有严格的操作规程；二是实验室的特殊设置。一个完整的PCR实验由标本准备、PCR扩增及扩增后产物的分析检测三个步骤组成。前二个步骤常有大量的特异NDA存在，是对以后PCR污染的主要来源。所以以上三个步骤应分开在不同的区域进行，而且所用的实验器具如加样器、吸头、离心管等不能混合使用。实验室的日常清洁是避免污染的最基本措施。室内控制外源核酸污染的几个方法（1） 紫外线照射。（2） “巢式引物”的应用在这种技术中，从第一轮PcR产物中，取出一部分使用位于第一对引物扩增的DNA内的引物再次扩增（称谓“巢式”PCR），因此处于高浓度的第二次扩增后的终产物对以后的使用第一对引物的初次PCR无影响。在一定情况下，这种方法对减少与PCR后扩增的污染问题极为有用，可有效地控制来自先前扩增的DNA出现的污染，但不能控制在原始标本收集、核酸提取及扩增等由于操作不当而出现的污染。阴、阳性对照（1） 阴性对照的目的在于监测PCR整个过程中可能出现的污染.因此应对PCR的每一个阶段都设置适当的阴性对照。（2） 阳性对照也是监测PCR检验质量的组成部分，可有2种类型：一是原标本（如血清、痰、分泌物等阳性对照；另一是已纯化的接近特定的PCR测定敏感性的DNA（亦可为质粒DNA）标本。原标本阳性对照，与特异纯化或质粒DNA一样，除可以监测PCR扩增产物的有效性外，还可监测待测标本核酸提取过程中核酸的丢失情况，如纯化的DNA经PCR测定阳性，而原标本阳性对照阴性则表明核酸的提取有问题，标本的测定结果不可靠。PCR结果的判读PCR假阳性结果最可能源于以前扩增的DNA的“遗留物”或标本间的交叉污染。但还有下面2种可能可导致假阳性结果：1、类似大小的但非目的产物的扩增；2、在对实验结果的错误判读。前一种可能性在PCR中颇为常见，尤其是以大的复杂基因作为模扳时。对实验结果的判读不准确或者缺乏统一的标准，不但易于得到假阳性结果，也可出现假阴性结果。在PcR实验中，如果靶DNA顺序出现变异，则很可能出现弱阳性或假阴性结果，原则上讲PCR结果的最后判读应是清楚明确的。（二）PCR的室间质量控制室间质量控制是临床检验质量控制的一个基本部分，由独立的组织机构进行。该机构定期地向参加室间质评的各个实验室寄送已知的经编号的标本，实验室应用其日常方法检测这些标本后，将结果汇报给上述组织机构，于是该机构在进行适当的统计学处理、分析后，再将实验室的成绩反馈参加实验室，如果实验室成绩不佳，则向其提供切实可行的建议和帮助。假阴性和假阳性结果难以避免，为保证PCR用于临床诊断的可靠性，就必须引入室间质评系统，以测PCR的敏感性和特异性可能存在的问额。九、PCR技术的临床评价PCR能在体外大量扩增DNA特异性片段，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、省时和对原材料质量要求低等特点。PCR技术主要用于病毒的检测(如乙型肝炎病毒等)，后来又用于细菌、原虫、霉菌、立克次氏体和支原体等，尤是对那些难以培养的病原体、及受感染细胞很少的潜伏病毒感染，PCR技术的应用显得更为突出。PCR的敏感性和特异性都优于传统的生物和免疫测定法。目前，国内已有乙型肝炎、丙型肝炎、巨细胞病毒、结核杆菌、淋球菌、乳头瘤病毒、沙眼衣原体和单纯疮疹病毒等PCR诊断试剂盒生产、出售。PCR的局限性；费用比较昂贵，不适用于较大的初步筛选，该技术仅能检出病原体DNA，不能反应感染的程度，如结核及乙型肝炎等。不能鉴定组织中病原体的存在状态，对标本中游离型、整合型的病毒DNA的判断，一般PCR也难以做到。PCR实质上并不是一种定量技术，因此，PCR扩增条带的强弱，并不一定与病原体的原始浓度呈正比。敏感性高而检测出的假阳性结果对临床的正确诊断带来了一定的困难。第三节DNA凝胶电泳技术电泳是PCR扩增产物的分离、纯化和鉴定最常用的方法，简单、操作迅速，能分辨其他(如密度梯度离心)方法不能分开的DNA片段混合物。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用漠化乙锭(EB)染色，在紫外灯下便可以直接确定DNA片段在凝胶板中的位置。琼脂糖凝胶电泳还常用于DNA的southern吸印或限制性内切酶简单的噬菌体或质粒克隆降解产物的位置图谱及吸印分析。一、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳都是以水平板进行的。优点：①可使用低浓度琼脂糖；②可以制备不同大小的凝胶：③易于灌胶制板、加样和操作；④仪器耐用，造价不高。缓冲液琼脂糖凝放电泳常用的缓冲浪为50mmo1/LTris-HAc(TAE)、Tris-硼酸(TBE)、Tris-磷酸(TPE)。先配制成10-20倍母液。目前最常用的缓冲液是Tris-HCl，它的缓冲能力较低，长时间电泳会使其能力耗尽（阳极变为碱性，阴极变为酸件）。解决的办法除经常换液外，也可在2个贮液槽之间进行缓冲液的循环。Tris-硼酸和Tris-磷酸都能获得良好的DNA片段分离效果，并且由于具有较高的缓冲能力不需缓冲液循环。（二）琼脂糖凝胶制备过程在制备过程中可以使用不同等级的琼脂糖。一般常使用II型的低内渗琼脂糖，II琼脂糖中常会混杂有一部分杂质，因此从这种凝胶洗脱出来的DNA片段必需经过高度提纯后才能用作这些酶的模板或底物。制备过程：1、 配制1.5%琼脂糖凝胶20ml.2、 将水平制胶板两端挡板插好，用滴管吸取少量琼脂糖分别滴于2块挡板底部及两侧，胶板厚度一般约为0.4cm。3、 待溶液冷却至50°C左右，加入10mg/mlEB（终浓度为0.5ug/m1）趁热例胶至模板内，并立即插人梳子以形成加样孔。4、 当凝胶完全凝固后，小心水平拔出插板和梳子，然后将胶板放入电泳槽中，加入足量的电泳缓冲液，使胶浸在液中约1mm处。（三）电泳1、 样品与载样缓冲液混合后，取出一定量加入胶孔内。2、 加样端接负极，另一端接正极，接通电源，电泳约30-60min，停止电泳。取出胶板在紫外灯下观察荧光带，必要时照相。（四）琼脂糖凝胶中DNA的染色与脱色EB可掺入到DNA分子内，在紫外线照射下，可产生按强的荧光，因此，可以使用EB检测单链或双链DNA。通常将EB渗入到琼脂糖凝胶中或琼脂糖凝胶电泳后，再用EE染色。在紫外线灯下直接观察。一般不脱色，如果DNA产物含量少时，可将凝胶浸入1mmol/LMgsoSO4溶液中室温脱色1h，以减低背景荧光，使观察清楚。二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）垂直平板电泳，也称聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），是根据物质所带电荷及其分子大小、形状的差异，在电场作用下产生不同泳动速度而得到的分离技术。主要用于分离制备小于1kb长度的低分子量基因片段。PAGE有静电效应和分子筛效应，分辨率很高。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂N，N，N’，N’〜四甲基乙二胺的同时作用下发生聚合作用，形成网状结构的凝胶，强度好，弹性好，透明，化学性质稳定，不受PH及温度的影响。往往采用垂直平板型电泳。（一）试剂的贮存固体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺贮存于棕色瓶内，4°C保存，不超过2个月。四甲基乙二胺要密封保存。过硫酸铵溶液最好当天配制，4C贮藏不超过1周。（二） 凝胶板的制作垂直型平板凝胶的制作方法较多，简单的是用2块4mm厚的平正玻璃板制成。玻璃板大小可根据需要而定。凝胶的长度为l0cm，常用30cmX50cm。将2块玻璃夹在一起，前短后长，玻璃之间用塑料条隔开，厚2-4mm。（三） 试剂的配制1、 30%丙烯酰胺丙烯酰胺29g，甲叉双丙烯酰胺1g，加蒸馏水至100ml。2、 Tris-HCl缓冲液。3、 3%过硫酸铵过硫酸铵3g，加蒸馏水至100ml。（四）聚丙烯酰胺凝胶的配制（五）操作步骤1、 在100ml凝狡中加人30ulTEMD混合立灌入两玻璃之间的空隙内。2、 立即插入适当的梳子，勿使齿下有气泡。3、 使丙烯酰胺在室温下聚合约60min，如凝胶有明显的回缩，可添加丙烯酰胺。4、 小心水平去出梳子，立即用水冲洗孔格。5、 把凝胶放人电泳槽内。6、 将1XTBE电泳缓冲液加入贮存槽中。7、 取一滴管缓冲液冲洗孔格。8、 加样同琼脂糖凝胶法，电冰。9、 电泳结束时，玻璃板从电泳槽中取出，平放在桌子上，干稳地先掀开一张玻璃的一角，使凝胶附在下面的玻璃上。10、 把凝胶放在染料溶液中染45min。11、 将凝胶置于紫外光透射灯下，去掉玻璃板后观察，必要时拍照。第四节原位杂交一、基本原理定义：原位杂交是以标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定的DNA或RNA序列，其基本原理是含有互补顺序的标记DNA或RNA片段，在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。分类:根据所用的探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA杂交3类。方法：根据杂交的标记物是否能直接被检测，可将原位杂交分为直接法和间接法2种。直接法原位杂交，探针与组织细胞内靶核酸形成的杂交体不经免疫组织化学即可显色。间接法原位杂交一般都用半抗原标记探针，探针与组织细胞内靶核酸所形成的杂交体则通过免疫组织化学对半抗原的定位间接地显示。二、 DNA/cDNA探针的制备用于基因诊断的各种DNA/cDNA的探针，通常是重组在质粒上。此种重组质粒，再经转化、扩增、提取和纯化，可得到大量的重组质粒，进一步经限制性内切酶将特异的基因片段切下来回收，得到特异基因片段。重组质粒DNA/cDNA的转化将质粒DNA转化到大肠杆菌中去，以得到含质粒的菌株，用此菌扩增此质粒DNA。（一） 传统CaCl2处理大肠细菌转化法1、 原理将外源DNA序列导入原核或真核细胞的过程称为转化。常用的方法有CaCl2法。以氯化钙处理对数生长期的细菌，使细胞壁的通透性增加，短时间的热休克使质粒DNA能更多、更容易地被细菌摄入，以得到大量的含质粒的细菌。由于质粒DNA上有抗菌素基因，可以在有其抗性的抗生素的琼脂上生长，而未转化的细菌则不能生长，转化的细菌形成单一细菌克隆的菌落。2、 试剂LB培养基；20ml/ml链酶素；25mg/ml氨苄青霉素；0.1mol/LCaCl2；NTE溶液。3、 操作步骤（1） 相溶菌的制备（2） 质粒DNA的转化（二） 质粒NDA的提取1、 快速分离小量质粒DNA-碱变性法2、 质粒DNA的大量提取（三） 质粒DNA的纯化（四） 地高辛标记DNA/cDNA三、 基本方法原位杂交方法很多，基本操作步骤包括标本制备、杂交前处理、杂交反应、杂交后处理和杂交体检测等步骤。（一）标本制备原位杂交标本的制备，要求既保存组织良好的形态结构，又避免组织中靶核酸的降解。DNA比较稳定，mRNA很容易降解。原则上取材要新鲜，标本一般要固定30min。固定剂有沉淀固定剂及交联固定剂二类。常用的固定剂有乙醇、甲醇和丙酮等。交联固定剂有多聚甲醛、甲醛和戊二醛等。经固定的组织细胞透明性较好，利于探针进入组织细胞内。多数情况下，4%多聚甲醛可获得较满意的原位杂交结果。固定方法可采用灌注法或浸渍法，也可将标本先制备冰冻切片，然后再固定。经固定的组织用PBS漂洗后，即可按常规进行石蜡包埋。常用的原位杂交标本有石蜡切片、冰冻切片和细胞培养标本。为了防止组织和细胞在杂交过程中的脱落，载玻片要涂以铭钒明胶，多聚赖氨酸或进行硅烷处理。制备石蜡切片，展片时要用含0.04%DEPC处理的双蒸馏水。制成的石蜡切片置于52°C烤箱过夜，随即可用来做原位杂交。经烤干的切片也可在室温下保存。冰冻切片可从新鲜组或固定的组织用恒冷箱切片制备。制成的冰冻切片置37C干燥4h或过夜后即可进行原位杂交。新鲜组织制备的冰冻切片，最好先用固定剂固定（如用4%多聚甲醛固定10min），然后再干燥，-70C保存或在70%乙醇中（4C）保存。培养细胞标本制备采用细胞离心法。光将生长在培养瓶壁上的细胞用胰蛋白酶处理，制成含1X105细胞/ml浓度的悬液。用离心法将细胞悬液制成细胞离心标本，使细胞贴附于经处理的载玻片上。如果细胞直接生长在载波片或盖玻片上，可直接固定。（二）杂交前处理杂交前处理的目的在于提高组织细胞的通透性，增加靶核酸的可及性，以及防止RNA或DNA探针与细胞、组织或载玻片之间的非特异性结合，从而增强信号，减低背景。方法和步骤因所采用的固定剂、组织标本以及探引的不同而异。用温和的非交联固定剂固定的细胞培养标本和冰冻切片，不需经特殊的杂交前处理，一般都能获得较好的反应结果。交联固定剂固定的标本，尤其是福尔马林固定的石蜡切片标本，需要杂交前处理才能获得较好的结果。1、 脱蜡石蜡切片必须先脱蜡。标本先入二甲苯37C作用30min，再转入新鲜的二甲苯，室温脱蜡10min，然后经浓度逐渐下降的梯度乙醇入水。2、 去污剂处理去污剂处理的目的是增加组织的通透过，利于杂交探针进入组织细胞。3、 蛋白酶处理蛋白酶消化能使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加靶核酸的探针可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K，链霉蛋白酶和胃蛋白酶。过度的蛋白酶消化会引起细胞形态结构的破坏及核酸的减少，也会导致标本从玻片脱落。4、 酸苷处理和酸处理为了防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10min。经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。这样不仅增加靶核酸的探针可及性，也可避免碱性蛋白与核酸探针之间的非特异性的结合，达到降低背景的目的。5、 杂交缓冲液孵育杂交前先用不含探针的杂交缓冲被在杂交温度下孵育2h，以阻断载玻片上和组织标本中能与探针产生非特异性结合的位点，以达到减低背景的目的。6、 内源性生物素和酶的抑制非放射性原位杂交，如用生物素、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶作为标记物，组织中的内源性的生物素、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶则应事先阻断。用内源性生物较为丰富的组织（如肝、肾等）做免疫组织化学时，标本可先依次用不标记的卵白素-生物素作为显色系统的原位杂交。为了阻断内源性碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶，可分别将标本浸于20%乙酸（4°C）中15s，或0.019g/L过碘酸淋浴和用含1%H2o的蒸馏水或甲酵溶液室温孵育30min。（三）杂交反应1、 双链。NA探针和靶DNA的变性进行杂交反应时，探针和靶核酸序列部必须是单链的。如用双链DNA探针检测DNA，则探针靶核酸都必须先解链。操作时，可先将含有双链探针的杂交液加在组织标本上，再将载玻片加热至95C，5-15min。这样，探针与靶DNA之间的杂交反应随即进行。单链的DNA不需要变性，可将探针加在组织标本上，用上述方法使靶DNA变性。使用双链DNA探针检测RNA时，将10倍浓度的探针加热至95C，5-15min，随即将探针置于冰水中5min，再用变性后的探针按要求的浓度加入杂交液中做杂交反应。探针一旦变性后，要马上进行杂交反应。2、 杂交液杂交液内除含一定浓度的标记探针外，还含有较高浓度的盐、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及载体DNA或RNA等。杂交液中含有高浓度的Na+可增加杂交率，减低探针与组织标本之间的静电结合。甲酰胺使杂交温度降低，避免因杂交温度过离而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落。硫酸葡聚糖能与水结合，减少杂交液的有效容积，提高探针的有效浓度，以达到提高杂交率的目的。牛血清白蛋白及载体DNA或RNA等，都是为了阻断探针与组织结构成分之间的非特异结合，以减少背景。3、 探针浓度探针浓度的高低将影响杂交反应的速度，探针浓度低，杂交反应缓慢，探针浓度高，杂交反应快。探针浓度过高，背景也会增加。最适宜的探针浓度应能获得最强的信号，同时背景又低。探针在不同的组织以及用不同方法制备的标本上、弥散和穿透的情况也不相同，因而所需要的最适宜浓度也可能有差别。4、 杂交温度杂交温度应低于杂交体的融解温度Tm（20-30°C），如所形成的杂交体的Tm为70°C,那么杂交温度应在40-50C左右。在这一温度条件下进行杂交反应、杂交率最高。5、 杂交时间杂交反应的时间可能随着探针的浓度的增加而缩短，但在一个相当大的浓度范围内，杂交反应在4-6h完成。一般可将杂交浓液和标本孵育过夜，杂交反应时间不超过24h，反应时间过长，形成的杂交体会解链，杂交信号反而会减弱。6、 严格度杂交体双链间碱基对的相配程度，可影响杂交体的稳定性。在温度较低的情况下，探针不仅可与碱基对完全互补的特异性靶核酸序列相结合，同时也可以与含有不相配碱基对的类似序列结合。决定探针是否能与含不相配碱基对的核酸序列结合而形成杂交体的条件即称为严格度。在高严格度条件下，只有减基对完全互补的杂交体才稳定；在低严格度条件下，碱基对并不完全互补的杂交体也可形成。影响严格度的因素：影响严格度的因素甲酰胺的浓度、温度和离子强度。在低甲酰胺浓度、低温度以及高离子浓度的条件下，严格度低；反之，严格度高。严格度可以在杂交反应及杂交后洗涤过程中调节。（四）杂交后处理杂交后处理的目的，是除去未参与杂交体形成的过剩探针，除去探针与组织标本之间的非特异性结合，包括那些与靶核酸相似的序列与探针之间形成的含非互补碱基对的杂交体，从而减低背景。杂交后处理应包括高盐浓度的漂洗，以减少探针与组织标本间的静电结合。当用RNA探针时，杂交后可用RNA酶处理，RNA酶仅使单链的RNA降解，而对RNA：RNA杂交体则无影响。在进行杂交后RNA酶处理时，应注意所用的试剂中不要含有对RNA酶有抑制作用的物质。（五）杂交体的检测与结果分析原位杂交主要通过显色的方法显示结果。放射性同性素标记探针的原位杂交，用放射自显影术进行检测。非放射性原位杂交，由于标记物种类较多，所用的检测方法则要根据标记物的性质而定。如常用的生物素标记探针，可用生物素一卵白紊系统检测，也可用生物素-抗生物素抗体系统检测。地高辛标记原位杂交，则可用特异性抗地高辛抗体用免疫组化学技术检测。1、 定性分析(1)组织或细胞对照用已知的探针互补核酸序列的组织同时进行原位杂交。(2)探针对照未标记的探针进行杂交后，应该出现阴性结果。方法对照去探针、去抗体等对照。以证明原位杂交实验操作的准确性以及实验结果的特异性，需要设置包括组织对照、探针对照、杂交反应对照和检测系统对照在内的一系列阳性对照和阴性对照。•定量分析放射自显影的标本可以用数银颗粒的方法，生物素标记探针杂交产物可以用图像分析仪等仪器进行定量。第五节原位PCR原位PCR(inSituPCR，IS-PCR)，是PCR和原位杂交2种技术相结合，是一种将靶DNA在原位扩增后进行原位杂交的技术。操作程序基本兼有2种技术的所有过程。首先在适当处理的细胞和组织切片上滴加PCR反应液，然后把载玻片故入热循环仪进行扩增，最后通过标记的探针进行原位杂交检测扩增产物。PCR技术有许多优点，但PCR是在液相中进行的。PCR扩增前，要把细胞破坏，从中提取模板。因此很难把PCR的结果与组织细胞的形态结构特征联系起来，也很难判断含特异靶序列的细胞类型。原位杂交是分子杂交与组织化学技术的成功结合。它能在原位检测组织细胞内特定的DNA或RNA序列。虽然原位杂交技术可以检测组织细胞内的特异靶序列的细胞类型和组织细胞的形态结构与病理变化，有时原位杂交的结果受到其敏感性的限制，不能检出组织细胞内单拷贝序列和低于10-20拷贝的RNA序列。一、 原位PCR的基本原理原位PCR的待测样品需经化学固定，以保持组织细胞的形态结构。PCR扩增所需的必要成分，如引物、DNA聚合酶、4种三磷酸核苷酸等进入组织细胞内或核内，以固定的DNA或RNA为模板，在原位进行扩增。PCR反应在由细胞膜组成的"囊袋”中进行。原位PCR综合了PCR和原位杂交的特点，既能检测细胞内单拷贝或低拷贝的DNA或RNA序列，同时还可以对含靶序列的组织细胞进行形态学分析。二、 常用的原位PCR法直接法原位PCR特点是扩增产物直接携带标记分子。该法反应体系中使用标记的三磷酸核苷酸或引物。放射性同位京35S、生物素和地高辛是3种最常用的标记物。当标本进行PCR时，标记分子就接人到扩增产物中。可用放射自显影术、免疫组织化学或亲合组织化学等方法扩增产物直接法原位PCR的优点是操作简便、流程短、省时；缺点是特异性较差、易出现假阳性，扩增效率较低。（二） 间接法原位PCR是目前最常用的靶核苷酸序列原位扩增技术。当PCR原位扩增后，再用原位杂交技术检测特异扩增产物。该法扩增效率高，特异性较好。因为原位杂交所用的探针可以特异地检出扩增产物中的靶序列。（三） 原位-反转录PCR是结合反转录反应和PCR扩增检测细胞内低拷贝mRNA的方法。反应分2步进行：第一步以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下合成cDNA；第二步则以cDNA为模板，用PCR对靶序列进行扩增。进行原位反转求PCR过程是在固定的组织细胞标本上进行的，标本先用DNA酶处理，破坏组织内的DNA，以确保PCR扩增的模板是从mRNA反转入合成的cDNA，而不是细胞内原有的DNA。三、原位PCR的基本步骤包括标本制备、预处理、原位PCR、后处理和原位检测等。（一）标本制备1、 标本种类原位PCR可以在细胞悬液、细胞涂片、细胞离心标本、细胞分裂中期染色体标本、冰冻切片以及石蜡切片中进行。悬浮的完整细胞做效果最好，细胞涂片和细胞离心标本次之，切片标本较差。完整细胞中的核酸序列损害较少，完整的细胞膜和核膜可作为防止扩增产物扩散的自然屏障，而在切片标本上，很多细胞都没有完整的细胞膜和核膜，扩增产物不易在原位保留。大部分病理标本都是以福尔马林固定、石蜡包埋的PCR。原位PCR一般一般切片厚一些，效果较好。做PCR前要充分暴露细胞中的靶DNA，注意PCR中合适的引物、多聚酶、Mg+和dNTP浓度，更重要的是扩增的DNA保持在原来细胞该内而不弥散，这是IS-PCR成功的关键。为了防止细胞、组织标本在原位PCR操作过程中脱落，玻片涂多聚赖氨酸或进行烷硅处理。2、 固定固定的目的不仅保存组织细胞的形态结构便于定位，还能保存用做PCR模板的起始物DNA或RNA。常用的固定剂有缓冲福尔马林（10%,4°C固定4-6h）、4%多聚甲醛和丙酮。（二） 预处理制备好的组织标本，在进行原位PCR之前，一般都要用蛋白酶预处理，增加通透性，反应试剂易进入组织细胞内，并暴露靶序列用以扩增。蛋白酶消化不足，组织细胞的通透性差，蛋白质与核酸间的交联广泛，影响PCR反应，导致假阴性；消化过度则会破坏组织的形态结构，使PCR产物易于通过破裂的膜结构向外弥散，影响结果。蛋白酶消化强度要根据组织固定的程度来调整。组织细胞固定得越充分，蛋白酶消化也要强。消化后，要加热将酶灭活.或通过充分洗涤将酶完全除去。也可用去污剂代替蛋白酶进行标本出处理，以增加通透性。（三） 原位扩增引物PCR所用引物一般为长18-28个核苷酸，扩增的片段100一1000bP。原位PCR宜用较短的引物。在原位PCR组织标本的制备过程中，DNA和RNA常有一定程度的降解，尤其是存档组织的石蜡切片，DNA和RNA的降解就更明显。从蜡块中提取的DNA很少超过400bP，RNA则不超过200个bp。长序列的扩增易引起非特异的扩增。一般情况下，用1对引物就可以，有时需用2对引物来提高PCR反应的特异性。反应体系原位的反应体系与常规的液相PCR基本相同，不同的是原位PCR的靶序列DNA或RNA在固定的细胞内，由于空间位置的缘故，标本中的靶序列并不与引物结合而获得扩增。靶序列的完整性也常在标本制备过程中受到损害。为了获待较好的扩增效果，有人主张反应体系中引物、TaqDNA聚合酶和Mg2+的浓度比常规PCR中的要高一些。用细胞悬液做原位PCR，扩增反应像普通PCR一样在Ep管内进行。反应纳束后再离心将细胞沉淀在玻片上，对扩增产物过行原位杂交。用细胞涂片、细胞离心标本或切片标本做原位PCR，扩增反应在被片上进行，要将反应混合物滴加在玻片上，覆以盖玻片。反应体系中要加牛血清白蛋白，以防DNA聚合酶与破片结合而减低扩增效率。热循环玻片上原位PCR的