分离工程,攀枝花学院

萃取：利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同,从而达到分离的目的，使溶质得到纯化或浓缩的方法。特点:平衡关系简单;萃取条件温和;适用范围广泛.良好的溶剂要求:1.有大的萃取容量，单位体积的萃取溶剂能萃取大量的产物.2.有良好选择性.3.与被萃取的液相互溶度小.4.溶剂的回收再利用容易5.化学稳定性好，不易分解，对设备腐蚀性小6.经济性好,价廉易得7.安全性好，无毒性或毒性低.反萃取就是通过调节水相条件，将目标产物从有机相转入水相的萃取操作过程。分配系数定义:分配系数是指溶质在两相中的总浓度之比，其用于表示溶质的分配平衡关系，乳化定义：乳化是一种液体以微小液滴形式分散于另一种不相混合的液体中的现象乳化形成:乳化现象的产生必需有第三种物质的出现，这种物质就是表面活性剂。在发酵液中存在的大量蛋白质、磷脂及固体颗粒物质，这些物质（主要是蛋白质和磷脂）起到了表面活性剂的作用。破乳方法:1.发酵液过滤或沉淀，除去蛋白质和磷脂2.加热，降低粘度，破坏乳浊液3.稀释法，降低乳化液浓度4.加电解质，中和乳化剂电性，促其聚沉5.转型法，加入相反乳化剂使乳浊液转型萃取操作（1）混合:料液与萃取剂充分混合形成具有很大比表面积的乳浊液.产物自料液转入萃取剂中.（2）分离:分离或萃取相和萃余相（3）溶剂回收:从萃取相中分离出有机溶剂.影响分配系数因素:1.成相聚合物分子量和浓度的影响；2.盐的种类和浓度对分配系数的影响;3.pH值;4.温度分配系数对温度的变化不敏感液膜萃取-定义:液膜分离是由水溶液或有机溶剂构成的液体薄膜将与之不互溶的液体分隔开来，使其中一侧液体中的溶质选择性地透过液膜进入另一侧，从而实现溶质间的分离。液膜萃取-液膜分类:1.乳状液膜2.支撑液膜3.流动液膜液膜萃取-膜相组成:1.膜溶剂2.表面活性剂3.流动载体（萃取剂）液膜萃取-影响液膜萃取的因素：1.pH值2.流速3.共存杂质4.反萃相5.操作温度6.萃取操作时间反胶团萃取-反胶团的若干定义:1.临界胶团浓度,表面活性剂在水溶液中开始聚集形成胶束所需要的最小浓度，称为临界胶团浓度2反胶陞表面活性剂在有机溶剂中形成的胶团称为反胶团反胶团萃取-影响分配的因素:1.有机相助溶剂2.表面活性剂和助表面活性剂3.盐的种类4.临界点超临界流体:在临界点以上的物质处于既非液体也非气体的超临界状态，称为超临界流体。超临界流体萃取操作：1.等温法；2.等压法；3.吸附（吸收）法；超临界流体萃取的优点：1.萃取速度高于液体萃取；2.能耗低于一般的精馏法；3.传热速率快，温度易于控制；4.临界CO2流体常态下是气体，无毒；5.压力和温度都可以成为调节萃取过程的参数；6超临界流体的极性可以改变，可选择范围广.影响萃取的因素：1.表面活性剂2.水相的pH值3.离子强度4.温度5.蛋白质的分子量和浓度反胶团萃取是利用表面活性剂在有机溶剂中形成反向胶团，对蛋白质实现有效萃取的一种分离技术影响液膜萃取的主要因素有：1.pH;2.搅拌速度,影响乳化液的分散和液膜的稳定性;3.共存杂质,会使目标物质的透过能量下降；4.反萃相，反萃相组成和浓度影响萃取速度和选择性。5.操作温度，一般在常温下进行；6.萃取操作时间；吸附：溶质从液相或气相转移到固相的过程。利用固体吸附的原理从液体或气体中除去有害成分或分离回收有用目标产物的过程称为吸附操作。吸附种类：物理吸附、化学吸附、离子交换吸附分离介质：按吸附剂的孔道结构区分---多孔性介质凝胶型介质举例：吸附剂；活性炭，硅胶，氧化铝，硅藻土，大网格聚合物吸附剂；离子交换剂，也称离子交换树脂。离子交换树脂由三部分组成：不溶性的三维空间网状结构构成的树脂骨架；与骨架相连的功能基团；与功能基团所带电荷相反的可移动的离子。分类：1阴离子交换剂：可交换阴离子，活性基团为碱性。如有机胺。2阳离子交换剂：可交换阳离子，活性基团为酸性。如羧基和磺酸基。穿透曲线：吸附过程中吸附柱出口溶质浓度的变化曲线称为穿透曲线。一般将出口浓度达到入口浓度5-10%的时间称为穿透时间。操作达到穿透点后，继续进料对增加吸附量的效果不大，而且出口溶质浓度迅速增大，造成目标产物的损失。这时，应停止进料吸附操作，顺次转入杂质清洗，吸附溶质洗脱和吸附剂再生操作。膨胀床吸附：膨胀床是液固相返混程度较低的液固流化床。同时兼顾了固定床和流化床的优点，又克服了两者的一些缺陷膨胀床：1吸附剂床层比固定化床孔隙率高，允许菌体细胞或细胞碎片自由通过。可直接处理菌体发酵液或细胞匀浆液，回收其中的目标产物，从而可节省离心或过滤等预处理过程，提高目标产物收率，降低分离纯化成本。2吸附剂粒子基本悬浮于固定位置，液体的流动与固定床相似，接近平推流，吸附效率高。3要求吸附剂有一定粒径或密度分布，可形成稳定膨胀床。多糖包埋石英晶体、玻璃微球，磁性粒子等。对介质的要求：1有一定密度，能够呈稳定的流化状态；2介质与料液中固形颗粒间有明显差异；3有良好孔道结构，不易被污染；4应具有活性基团，可以进行修饰提高目标产物的吸附容量；5有较好化学稳定性和机械强度，使用寿命长；6有良好的传质性能，在较高流速下，可以保持较高的吸附量。流化床：优点：压降小，可处理高黏度或含固体微粒的粗料液。操作方式同膨胀床。但不需特殊的吸附剂，设备结构也比膨胀床简单，操作简便。缺点：床内固相和液相的返混剧烈，吸附剂的利用效率远低于固定床和膨胀床。色谱原理与分类原理：层析是根据混合物中，溶质在互不混溶的两相之间分配行为的差别，引起移动速度的不同而进行分离的方法分类：1流动相与固定相：气相色谱法、液相色谱法、超临界流体色谱法；2固定相的形状：液相色谱、纸色谱、薄层色谱、柱色谱；3分配机理：凝胶过滤层析，离子交换层析，疏水性层析，反相层析，亲和层析压力：低压（压力低于0.5MPa）,中压（压力为0.5~4MPa）,高压（压力4~40MPa）蛋白质分离一般为中低压，介质相对较软，分析多用高压层析，介质多为硬质硅胶等。分离度（分辨率）：表达两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程度。分离度随理论板数的增加而增大。凝胶过滤色谱：凝胶过滤层析也称体积排阻色谱，一般利用凝胶粒子（通常称为凝胶过滤介质）为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相层析法。-大分子不能进入凝胶中，只从床层空隙流过，洗脱体积为层析柱的空隙体积V0。-小分子能进入凝胶所有细孔中，其洗脱体积接近柱体积Vt。-其它分子洗脱体积介于V0和Vt之间。-且一种凝胶只能对介于V0和Vt之间的分子进行分离。-料液处理量很小。当料液体积小于两种溶质的洗脱体积差时，两种溶质才能得到完全分离。色谱介质要求：1亲水性高，表面惰性；介质与溶质之间不发生化学和物理相互作用；2稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长；3具有一定的孔径分布范围，即孔径分布范围窄；4机械强度高，允许较高的操作压力（流速）。葡聚糖系列：葡聚糖系列是由葡聚糖（由葡萄糖经a-1,6糖苷键连接而成的线性高分子）经环氧氧丙烷交联而成的珠状凝胶。交联度越高，凝胶孔径越小。琼脂糖系列：以P-D-半乳糖和3,6-脱水-aL-半乳糖为基本单位构成的线性多糖。聚丙烯酰胺系：是由丙烯酰胺与N,N’-亚甲基双丙烯酰胺共聚而成的一类亲水性凝胶。凝胶特性参数-排阻极限：指不能扩散到凝胶网格内部的最小分子的相对分子质量。相对分子质量大于该数值的分子不能进入到凝胶网格中，不能有效分离，洗脱体积为V0。-分级范围：能为凝胶阻滞且相互间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。-溶胀率：干胶颗粒用水进行溶胀处理，每克干凝胶所吸收水分的百分数称为溶胀率。-凝胶粒径：一般为球形，粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小，理论塔板高度越小，分离维越高。一般用筛目或微米表示。软凝胶粒径较大，一般为50~150顷（100~200目），硬凝胶粒径较小，一般为5~50pm。粒径越小，操作压降越高。-床体积：即1g干燥凝胶溶胀后所占有的体积。可用于估算装满一定体积的层析柱所需的干燥凝胶量。-空隙体积：指层析柱中凝胶之间空隙的体积，即V0。空隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定，一般使用相对分子质量为2000KD的水溶性蓝色葡聚糖。影响分离特性的因素-线塑：流速增大会提高理论塔板当量高度，降低分离效果。-料液体积：与分离度有关，一般在不影响分离度的情况下取最大值。-料液浓度：由于与流动相的粘度差，料液浓度高时洗脱曲线容易出现不对称性质。-分子量与分配系数的关系：选择分级范围相对较小的介质，可提高分离度和处理量。-凝胶粒径：粒径越小，理论塔板当量高度越小。高效液相介质粒径小的原因。可提高操作流速，但介质需耐压。离子交换色谱:利用离子交换介质为固定相，根据荷电溶质和离子交换介质之间的静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱层析法。不同溶质在离子交换介质上的分配行为不同，可以在洗脱过程中彼此得到分离。疏水性相互作用色谱:利用表面偶联弱疏水性基团（疏水性配基）的疏水性吸附剂为固定相，是根据蛋白质与疏水性介质之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质生物大分子分离纯化的洗脱层析法。亲和色谱:利用亲和吸附作用分离纯化生物物质的液相色谱法。亲和色谱所用的固定相为键合亲和配基的亲和吸附介质（亲和吸附剂）影响亲和作用的因素1.离子强度2.pH3.抑制氢键形成的物质4.温度5.离液离子6.螯合剂酶的抑制剂:蛋白酶均存在抑制其活性的物质，称为酶的抑制剂。它的分布很广，有天然的生物大分子，如胰蛋白酶抑制剂（结合常数为109L/mol），也有小分子化合物如氨基苄脒（结合常数为4x104L/mol）。抗体:抗体和抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数在107~1012L/mol蛋白A（或称A蛋白）:A蛋白为分子量42kDa的蛋白质，存在于金黄色葡萄球菌的细胞壁中。它与动物免疫球蛋白G（IgG）具有很强的结合作用。凝集素：凝集素是与糖特异性结合的蛋白质的总称。在这种蛋白质上具有糖的结合位点。可作为多糖、糖蛋白等含糖生物分子的配基。辅酶和磷酸酰苷：各类脱氢酶和激酶需要在辅酶存在下表现出其生物催化活性。辅酶和脱氢酶之间有亲和作用。三嗪类色素：这类色素与NAD的结合部位相同，具有抑制酶活性的作用，能与脱氢酶、血清白蛋白、干扰素、核酸酶、溶菌酶等发生结合作用过渡金属离子：Cu2+等过渡金属离子可与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基发生亲和结合作用。Cu2+等过渡金属离子与N、O和S等供电原子产生配位键。肝素：存在于动物肝脏等器官中的酸性多糖类物质，分子量为5到30kDa，它与凝血蛋白质、脂蛋白等有亲和作用。亲和色谱亲和色谱介质应满足条件:1.具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附；2.物理和化学稳定性高，有较高的机械强度3.含有可活化的反应基团4.粒径均一的球形粒子亲和色谱-间隔臂的作用：1当配基分子量较小时，为了排除空间位阻作用，需要在配基和载体之间连接一个“间隔臂”；2间隔臂的长度有一定限制，超过一定长度后，配基与目标分子的亲和力会减弱亲和色谱-影响亲和吸附的因素亲和膜：亲和膜是利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变型。亲和沉淀：亲和沉淀是生物亲和作用与沉淀分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离技术，包括一次作用亲和沉淀和二次作用亲和沉淀。一次作用亲和沉淀原理：1水溶性化合物偶联多个配基，蛋白质表面含有两个以上亲和结合位点；2化合物与蛋白质因亲和作用产生亲和交联；3交联形成的交联网络因分子量较大而沉淀二次作用亲和沉淀原理：1利用在物理场改变时溶解度下降，发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基，制备亲和沉淀介质；2亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀包涵体形成原因：1使用高剂量基因和强启动子；2大肠杆菌细胞质环境条件；3缺少蛋白质正确折叠的辅助因子；4超表达产生的高浓度新生蛋白质由于多肽链不完全折叠，有利于分子疏水序列之间的相互作用，最终导致这些蛋白质的聚集和错误折叠。包涵体对分离纯化的影响：有利方面：1.蛋白质表达量高；2.抗剪切和较高温度，对破碎细胞的方法和条件要求低；3.包涵体密度大，易分离；4包涵体的蛋白质纯度较高；5.后续蛋白质分离纯化较容易。不利方面：1.需变性复性；2.活性蛋白质收率低。蛋白质的复性一个有效、理想的折叠复性方法应具备以下特点：1.活性蛋白质回收率高；2.正确复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；3.折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；4.折叠复性方法易放大；5.复性过程耗时少。就工业应用，要求折叠复性过程要快速、低成本、高效。虽然蛋白质折叠复性方法很多，但就某种蛋白质仍需通过实验确定最佳方法和条件。目前发展的复性方法：稀释复性；透析、透滤复性；分子伴侣指导复性；色谱法复性：凝胶过滤色谱复性、离子交换色谱复性、疏水色谱复性、亲合色谱复性；反胶团复性；双水相复性稀释复性法这是目前最简单的蛋白质复性方法。将少量的变性蛋白质溶液以一定比例滴加到复性缓冲液中，达到降低变性剂浓度的目的，使处于变性伸展状态的蛋白质分子在溶液中自发地折叠成天然的活性结构。为获得好的复性结果，必须进行复性条件优化。因复性原理不清楚，只能通过实验来确定。一般可采用正交法。影响复性的条件主要有：变性蛋白质溶液组成及浓度、复性缓冲液的组成(离子种类、氧化还原试剂、螯合剂X离子强度、pH、氧化还原电位、复性温度、稀释倍数、混合方式速度等。透析复性法由于变性剂均为小分子物质，在透析或超滤时可逐渐透过多孔膜，使变性蛋白质溶液的变性剂浓度逐渐降低，最后除去变性剂，达到使变性蛋白质折叠复性的目的。影响透析和透滤复性的因素与稀释复性复性基本相同。但过程缓慢，耗时间长，效率低。色谱复性法在色谱过程中实现复性，称为色谱复性法。其优点是：1色谱固定相对变性蛋白质吸附能力低，甚至完全消除变性蛋白质在脱离变性剂的环境发生聚集，产生沉淀。提高复性质量和活性收率。2在蛋白质复性的同时可使目的蛋白质与杂蛋白质分离，达到复性与纯化同时进行的目的。3便于回收变性剂，有利于降低废水处理成本。适合蛋白质复性的色谱有：凝胶过滤色谱(GFC)、离子交换色谱(IEC)、疏水色谱(HIC)、亲合色谱(AFC).凝胶过滤复性：凝胶过滤色谱是以溶液中分子的流体力学体积大小进行混合物分离的技术。优点：溶质分子之间及溶质与分离介质之间无相互作用，活性分子不易变性，活性收率高。凝胶过滤复性在凝胶过滤复性时，先用复性缓冲液平衡凝胶柱，变性蛋白质溶液上样后进入柱顶，因有高浓度变性剂存在，变性蛋白质有一个随机构象状态和大的动力学水合半径，不能进入介质内空隙，在柱上不能保留。在用复性缓冲液洗脱时，因变性蛋白质溶液逐步被稀释（色谱峰扩散），变性剂和蛋白质浓度降低，蛋白质分子会自发地向热力学稳定的低能态，即蛋白质的天然状态转化，使蛋白质开始复性随时间推移，当蛋白质分子结构变得更加紧密时，蛋白质在两相中的分配系数会逐渐增加。蛋白质进入介质颗粒内部空隙后，其扩散速度减缓，从而限制了蛋白质的聚集，减少了沉淀产生。蛋白质分子大，先从柱子上洗脱，变性剂分子小，最后流出色谱柱。达到复性目的。超临界流体萃取：利用超临界流体作萃取剂，从液体或固体中萃取出某些成分并进行分离的技术。基本工艺流程：由萃取（CO2溶解组分）和分离（CO2和组分的分离）两步组成。包括高压泵及流体系统、萃取系统和收集系统三个部分超临界CO2流体萃取的优点：1、CO2的临界温度接近于室温，适合于热敏性物质，完整保留生物活性，而且能把高沸点，低挥发度，易热解的物质分离出来。2、CO2的临界压力适中，目前工业水平易达到；3、CO2的临界密度是常用超临界溶剂中最高的（合成氟化物除外），即溶解能力较好；4、CO2无毒、无味、不燃、不腐蚀、价廉，易于精制、易于回收，无污染。电泳：荷电的胶体粒子在电场中的移动；电泳的大致分类:依据电泳原理:移动界面电泳;区带电泳;稳态电泳.凝胶电泳凝胶电泳的支持介质：1聚丙烯酰胺凝胶:由丙烯酰胺和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的作用下，聚合而成；2琼脂糖凝胶：从琼脂中精制分离出的胶状多糖，其分子结构大部分是由1,3连接的P-D吡喃半乳糖和1,4连接的3,6脱水a-D吡喃半乳糖交替形成的；凝胶电泳原理:1在凝胶电泳过程中，不同分子量的荷电溶质在迁移过程中的泳动速度是不同的。2相对分子量较大的溶质受凝胶阻滞作用较大，泳动速度慢；相反，分子量小的溶质泳动速度较快。3经过一定时间的电泳后，根据溶质相对分子质量的不同，凝胶中形成数条含不同溶质的区带，实现溶质间的分离。4凝胶电泳所使用的凝胶种类和浓度根据待分离料液中溶质的相对分子量而异。5凝胶电泳中凝胶浓度和pH值均一。毛细管电泳和电色谱:在电场中，毛细管内的电解质因其荷电性质而发生电泳，同时在水溶液中，石英毛细管内表面的硅羟基解离而带负电荷，诱导管内产生电渗流。特点1.仪器简单、易自动化;2.分析速度快、分离效率高;3.操作方便、消耗少;4.进样量极少，水介质中进行；5.应用范围极广主要的膜分离法：微滤，超滤，反渗透:压差.透析:浓差.电渗析:电位差.渗透气化:压差，温差对膜材料要求:1.起过滤作用的有效膜厚度小，超滤和微滤膜的开孔率高，过滤阻力小；2.膜材料惰性，不吸附溶质，从而使膜不易污染，膜孔不易堵塞；3.适用的pH和温度范围广，耐高温灭菌，耐酸碱清洗剂，稳定性高，使用寿命长；4.容易通过清洗恢复透过性能；5.满足实现分离目的的各种要求.膜组件型式：管式、中空纤维式、平板式和卷式。影响膜分离速度的因素:1.操作形式a.终端过滤b.错流过滤2.流速，流速增大，透过通量亦增大。3.压力4.料液浓度，透过通量随料液浓度增大而减小。膜污染主要原因：凝胶极化；溶质在膜表面的吸附层；膜孔堵塞；膜孔内的溶质吸附。分离度:两个相邻洗脱峰之间的距离与两个峰宽的代数平均值之比。影响萃取操作的因素1.水相物理条件的影响:a.pH值b.温度c.无机盐浓度2,萃取剂的影响3,乳化和破乳4有机溶剂的影响凝胶过滤色谱::利用凝胶粒子为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相层析法。凝胶过滤色谱:一般利用凝胶粒子（通常称为凝胶过滤介质）为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相层析法。色谱:根据混合物中，溶质在互不混溶的两相之间分配行为的差别，引起移动速度的不同而进行分离的方法。色谱介质要求：1,亲水性高，表面惰性；2.稳定性强;3.具有一定的孔径分布范围；4,机械强度高.色谱法分类：1,流动相与固定相a,气相色谱法b.液相色谱法c.超临界流体色谱法2,固定相的形状a.纸色谱b.薄层色谱c柱色谱3,压力a.低压b.中压c.高压凝胶特性参数:1,排阻极限2,分级范围3,溶胀率4,凝胶粒径5,床体积6,空隙体积影响分离特性的因素:1,线速度2,料液体积3,料液浓度4,分子量与分配系数的关系5,凝胶粒径凝胶过滤色谱的优缺点：优点：1,恒定洗脱法洗脱，操作条件温和，产品收率高2,每批操作结束不需进行介质清洗和再生，容易实施循环操作，提高产品纯度3.脱盐手段，比透析法速度快，精度高；比超滤法剪切力小，蛋白活性收率高4分离机理简单，操作参数少。缺点：1仅根据分子量大小差别进行分离，选择性低，处理量小2洗脱后，产品被稀释。色谱聚焦：基于离子交换的原理，根据两性电解质分子间等电点的差别进行分离纯化的洗脱层析法。疏水性相互作用色谱:利用表面偶联弱疏水性基团（疏水性配基）的疏水性吸附剂为固定相，是根据蛋白质与疏水性介质之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质生物大分子分离纯化的洗脱层析法。反相色谱:利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为