单克隆抗体制备技术- 李会强课件

单克隆抗体制备技术临床免疫学教研室李会强教授2何谓单克隆抗体？单克隆抗体（monoclonalantibody，McAb）是指由单个杂交瘤细胞增殖而成的细胞克隆产生的，针对某一抗原表位的、完全均一的、单一特异性的抗体。3单克隆抗体的出现对医学发展的影响单克隆抗体具有很高特异性，增加检测方法的特异性；单克隆抗体具有均一性，推动商品化试剂盒出现和发展；单克隆抗体出现推动T细胞亚群研究；单克隆抗体推动生物制药领域的发展；5克隆选择学说1857年，FMBurnet提出克隆选择学说。指出：每个B淋巴细胞表面的抗原受体只识别一种抗原表位，并产生针对该决定簇的抗体。6克隆选择学说7克隆选择学说淋巴细胞不能在体外长期存活8杂交瘤技术杂交瘤细胞继承两个亲本细胞特性10杂交瘤技术1984荣获诺贝尔生理医学奖杂交瘤技术是制备抗体的技术革命12两个基本问题选择亲本细胞与细胞融合应用选择培基与杂交瘤细胞筛选14亲本细胞之一：免疫脾细胞采用BALB/c小鼠15亲本细胞之二：骨髓瘤细胞选择有HGPRT或TK缺陷的细胞株；能与B细胞杂交形成稳定的杂交瘤细胞，并分泌免疫球蛋白；骨髓瘤细胞本身不分泌免疫球蛋白；具有较高融合效率；16亲本细胞之二：骨髓瘤细胞SP2/0细胞NS1细胞容易培养传代，一般培养基即可，无特殊要求。17亲本细胞之二：骨髓瘤细胞Sp2/0为悬浮型细胞18细胞融合20细胞融合21选择培养基基本成分次黄嘌呤（H）氨基蝶吟（A）胸腺嘧啶（T）HAT选择培养基23选择培养基作用原理24选择培养基作用原理26实验流程27实验流程28实验流程制备免疫脾细胞培养骨髓瘤细胞细胞融合克隆筛选克隆化细胞鉴定大量制备30制备脾细胞选择合适的免疫方案是获得高质量的抗体的前提；一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫；免疫方案应根据抗原的特性不同而定；

31制备脾细胞32培养筛选骨髓瘤细胞SP2/0细胞为肿瘤细胞，易发生突变丧失酶的缺陷；为确保SP2/0细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8-AG(8氮鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变；33培养筛选骨髓瘤细胞+8-AzaguanineMyelomaCellsHGPRT-MyelomaCells34培养筛选骨髓瘤细胞使用对数生长期细胞，融合前进行换液，确保细胞处于最佳状态。培基：RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％。一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞。35细胞融合FUSIONPEGMYELOMACELLSSPLEENCELLSHYBRIDOMACELLSELISAPLATEFeederCellsGrowthMediumHATMediumPlatingofCellsinHATselectiveMediumScanningofViableHybridomas36细胞融合杂交瘤技术中最为关键一步；融合前亲本细胞需经预处理；融合37℃水浴中进行；注意两种亲本细胞的比例；选择高质量细胞融合剂；缓慢终止融合作用；37关于“PEG”分子量1500-3000道尔顿；诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合；不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同；应用浓度为50%；38挑选阳性克隆细胞生长至一定数量后便可进行；方法应敏感、简单、重复性好；方法：

RIA、ELISA、FIA；39挑选阳性克隆ELISA是常用技术之一40克隆化将阳性克隆与其它克隆分开的过程。克隆化应及早进行，以防止阳性克隆丢失。方法有：显微操作法有限稀释法软琼脂法

41应用有限稀释法进行克隆化不需任何特殊设备克隆出现效率高实验室常用方法42细胞鉴定特异性Ig类与亚类中和活性染色体核型识别抗原表位亲和力43大量制备抗体体外细胞培养腹腔内培养44大量制备抗体腹腔内培养45实验流程体外细胞培养46实验流程注意：阳性细胞克隆的冻存与复苏单克隆抗体的优缺点问题四:48单克隆与多克隆比较DerivedfromdifferentBLymphocytescelllinesPOLYCLONAL.MONOCLONAL.DerivedfromasingleBcellcloneBatchtoBatchvariationaffectingAbreactivity&titremAbofferReproducible,Predictable&PotentiallyinexhaustiblesupplyofAbwithexquisitespecificityEnablethedevelopmentof