糖基转移酶与糖苷酶课件

第二节

糖基转移酶及其应用主要内容糖转移酶简介

糖基转移酶在合成中的应用

Glycosyltransferases应用‘activated’sugarphosphates作为糖供体，合成glycosidiclinkage，糖受体通常为nucleophilicgroup,usuallyanalcohol.生成的糖苷可以为O-,N-,S-,orC-glycoside糖转移酶简介功能：催化糖苷键的合成（O-,N-,S-,orC-glycoside

）供体：活化的糖磷酸受体：亲核基团（蛋白、脂、核酸、糖、小分子），通常为-OH分为94家族（distinctsequence-basedfamilies）(CAZyserver,rs-mrs.fr/CAZY)

人类拥有约270多种糖基转移酶序列，属于33个家族。

Alpha-1,4-葡萄糖转移酶；beta-1,4-半乳糖转移酶；2,3-唾液酸转移酶糖基转移酶分类根据氨基酸序列相似性进行分类：根据蛋白结构相似性进行分类：根据糖供体和糖苷键连接方式进行分类：

GT-A，GT-B，其他类型Rossmann-typedomains(fornucleotidebinding)NDP-bindingdomaingenerallycontainsaconservedDXDaminoacidmotifGT-Afold:SpsAfromBacillussubtilusGT-Bfold:beta-glucosyltransferasefrombacteriophageT4LeloirGTsTransglycosylasefromStaphylococcusaureusOligosaccharyltransferaseSTT3fromPyrococcusfuriosiusNon-LeloirGTs催化机理Glycosyltransferasescatalyzethetransferofglycosylgroupstoanucleophilicacceptorwitheitherretentionorinversionofconfigurationattheanomericcentre.Thisallowstheclassificationofglycosyltransferasesaseitherretainingorinverting

enzymes.糖基转移酶辅因子Many,butnotall,glycosyltransferasesutilizedivalentmetalioncofactorssuchasMn2+andMg2+.

…mainlyinglycosyltransferasesthatare

diphosphonucleoside-dependent.metalioniscoordinatedtoanoxygenofeachofthetwophosphategroups,aswellastoside-chaincarboxylatesderivedfromtheprotein..阻断糖供体的合成N-Glycan合成过程中，首先要合成：dolichol-pp-N-acetylglucosamineUDP-GlcANc+dolichol-p------dolichol-pp-GlcNAcN-acetylglucosaminephosphorotransferaseChemicalSynthesisofa-Gal规模小，过程复杂，立体选择性难ReactionCatalyzedbya1,3-Galactosyltransferase碳水化合物的合成体内糖供体合成途径

Glc,GlcNAc&ManSugar-6-pSugar-1-pSugar-NDPkinaseMutasepyrophorylase

Gal,GalNAc&FucSugar-1-pSugar-NDPkinasepyrophorylaseNeu5AcNeu5AcCMP-Neu5AcpyrophorylaseCTP

糖供体相互转化:

GalE:UDP-Gal↔UDP-Glu

GalNAcE:UDP-GalNAc↔UDP-GlcNAcUGD(UDP-Glc

dehydrogenase)：UDP-Glc

↔UDP-GlcAUDP-GlcA

decarboxylase:UDP-GlcA

↔UDP-Xyl微生物中的糖供体天然糖苷化合物中的糖一般为C2,C3,C4and/orC6脱氧糖，而且大部分为6-deoxyhexosesfamily（Rhamnose）原核生物糖转移酶具有糖供体的广泛性6-deoxyhexoses一般通过TDP-sugars进行底物活化（TDP-Rhamnose）优点:

区域、立体选择性大量生产不足:

*糖基转移酶在大量表达方面存在困难糖供体比较昂贵.

副产物抑制消除副产物抑制（碱性磷酸酶）原位产生糖供体

合成廉价的糖供体类似物.针对以上不足解决策略糖基转移酶在工业应用中优势与弱点可作为LgtC底物酶法再生糖供体策略

UDP-sugar(A)andCMP-sugar(B)糖供体的合成糖供体的合成糖基转移酶在寡糖合成中的应用（一）

具有生物活性寡糖的酶法合成Biomedicaluseofa-Galsolublea-Galantagonisttoanti-Gala-Galconjugatesinimmunotherapyagainstbacteria,virus,andcancercells.人工合成的必要性a1,3GalT催化合成a-GalEpitopes及其衍生物HOOOHHOHOOUDPHOOOHHOHOOUDPOHOOHHOOOOHHOR1R2HOOHOOHHOHOOHOOHOHOOOOHHOR1R2UDP-Gal4-epimeraseUDPa1,3GalTR1R2OHOHOHOHNHAcbN3bSPhbOAllylabcdNHAcOHeNH2OHfUDP-Gal100mg/$416UDP-Glc5g/$529.5ECFangJ,ChenX,WangPG,etal.:J.Org.Chem.1999,64,4089-4094.通过原位再生合成a-Gal五糖FangJ,LiJ,ChenX,WangPG,etal:J.Am.Chem.Soc.1998,120,6635-6638.其他生物活性寡糖的合成（应用）InHumanmilkOOHOHOOHOOHOHOOHOHHOOOHOOOHOHOHOOHa1,4GalTlgtC

gene(a)

globotriose

Gb3OHOHOAcHNOHOOHOHOOHOOHOHOOHOHOHOOHOOHb1,3GalNAcTlgtD

gene(b)

globotetrose

Gb4OHOOHOOHOOHOHOOHOHHOOHOAcHNOH(c)

LNT-2b1,3GlcNAcTlgtA

geneOHOOHOOHOOHOHOOHOHOOHOAcHNOH(d)

LNnT:

Lacto-N-neotetraoseb1,4GalTlgtB

geneHOOHOHOOHOHOOHOOHOOHOHOOHOHOHOAcHNOHa2,3transialidase(e)

LSTDOHOAcHNHOOHHOHO2COH(WithouttheBsubunits,theAsubunithasnowayofattachingtoorenteringthecell,andthusnowaytoexertitstoxiceffect.)StxisanAB5subunittoxin.Thepentamerof(small)Bsubunitsbindingtoitsreceptorglycosphingolipid(GSL),globotriaosylceramide(Gb3)inglomerularendothelialcellmembranes,initiatesAsubunit-mediatedcelldeathleadingtoHUS（hemolyticuremicsyndrome）,butinductionofinflammatorypathwaysisalsokey.Gb3isheterogenousinitslipidstructureandmembraneorganization,suchthatdifferentGb3formatsaredifferentiallyrecognizedbyStxfamilymembers,particularlyStx2,whichismorefrequentlyassociatedwithclinicaldisease.血型相关抗原酶法合成FluorescentlylabeledsLexconjsLex在转移性结肠癌高表达二价肿瘤抗原酶法合成（用于检测肿瘤位置）糖基转移酶应用乳腺癌、前列腺癌上高表达Globo-HP-凝集素配体防治黑色素瘤寡糖的合成常常需要多种糖基转移酶为了增加产量还有用其他一些酶分步合成费时费力？一锅多酶法------Superbeads-------SuperbugJ.Am.Chem.Soc.1995,117,5869-5870一锅多酶法合成透明质酸（hyaluronicacid）E1,hyaluronicacidsynthase;E2,UDP-Glcdehydrogenase;E3,UDP-Glcpyrophosphorylase;E4,UDP-GlcNAcpyrophosphorylase;E5,pyruvatekinase;E6,lactatedehydrogenase;E7,inorganicpyrophosphatasesialylLewisX酶法大量合成E1:a1,3-fucosyltransferase；E2:pyruvatekinase；E3:GDP-mannosepyrophosphorylaseE4:GDP-4-keto-5-deoxymannose3,5-epimerase/GDP-4-keto-6-galactosereductase；E5:glucosedehydrogenase；E6:hexokinase；E7:phosphomannomutase；E8:a2,3-sialyltransferase激酶歧化酶SuperbeadGalUGalTGalKPyKFRecombinantE.colistratinsoverexpressingGalK,GalT,GalUorPykF1)Fermentation2)Lysis3)AddtoNi2+resinChenX,FangJ,WangPG,etal.:J.Am.Chem.Soc.2001,123,2081-2082.Beadswith:GalKGalTGalUPykFPeristalticpumpforcirculationReservoirwith:a1,3GalTLacOBn9.6mMATP 0.96mMPEP 19.2mMUDP 0.96mMGlc-1-P0.96mMGal 12mMMgCl2 10mMMnCl2 10mMKCl 100mMHEPES100mMpH7.5LiuZ,ZhangJ,ChenX,WangPG:ChemBioChem2002,3,348-355.ProductionofUDP-GalwithSuperbeads.Superbead用于寡糖合成aGramscalesynthesis,othersare100mgscales从多菌种发酵到

Superbug

KyowaHakko’stechnologyforlarge-scaleproductionofUDP-GalandglobotrioseutilizingmetabolicallyengineeredbacterialcellsPpa:pyrophosphataseGalU:glucose-1-phosphateuridylyltransferaseGalT:galactose-1-phosphateuridylyltransferaseGalK:galactokinaseLgtC:a1,4-galactosyltransferaseCMP-NeuAcregenerationsystembybacterialcouplingUsingthisapproach,sugarnucleotidesincludingUDP-Gal,CMP-Neu5Ac,UDP-GlcNAcandGDP-Fuchavebeensuccessfullyproducedonalargescale.Superbugtechnologiesforthesynthesisofa-GalBacteriaNutrientsStartingMaterialsBio-synthetic

pathway

engineeringa-Gal分析合成途径ATPADPGalK:

galactokinaseGalUT:galactose-1-phosphateuridylytransferaseGalU:

glucose-1-phosphate

uridylyltransferasePykF:

pyruvate

kinasea1,3GalT:

a1,3-galactosyltransferasea1,3GalT

Gala1,3LacLactoseUDP-GalUDPPEPPyruvateGal-1-PGlc-1-PUDP-GlcUTPPykFGalUGalKGalUTGalactosePPi克隆表达验证相关酶Cloneandexpressindividualenzymesinthebiosyntheticpathwayofa-Gal（克隆相关酶）ConstructionanartificialbiosyntheticgeneclusterandtransferintoE.colihostcell.（构建基因簇并转化）Largescaleproductionofa-Galoligosaccharidesusingfermentedandpermeatedcells.（发酵生产）pLDR20-aKTUFgalK+galTa1,3GalTgalUpykFT7terminatorlPRpLDR20-aKTUFAmprEcoR

VSac

IISal

IXba

ICla

I~9kblcI-repressorpMB1rbcrbcrbcrbc构建多基因表达质粒检验多基因表达效果66,20031,00021,50045,000LysateMIBMPure14,50097,400PykFGalKGalTGalUa1,3GalTSuperbug整个生产过程

WholeCellReactionAnalyzedbyTLC,HPLCRt,20-36h

StopbyinsertinginboilingwaterCentrifugationGelfiltrationP21HNMR,13CNMRAnalysis

CultureNM522/pLDR20-aKTUFCentrifugationOverexpressionResuspendedinTris-HClBufferE.

coli

NM522pLDR20-aKTUFa-Gal7.2gGal1.1gATP8.4gLac3.6gGlcTotalvolume:1L0.3gUDP-Glc7.2gChenX,LiuZ,ZhangW,FangJ,AndreanaP,WangPG:ChemBioChem.2002,3,47-53.大规模发酵产量Superbug-1a1,3GalTGala1,3Galb1,4GlcGalb1,4GlcUDP-GalUDPPEPPyruvateGal-1-PGlc-1-PUDP-GlcUTPPykFGalUGalKGalTGalactoseLactoseGlycolyticpathwayGlucoseATPADPGlucosePyruvatePykFPEPGlycolyticpathwayPPiNM522添加三种原料：glucose,galactose,lactosePpK:polyphosphatekinaseSuperbug-2添加三种原料：多聚磷酸,galactose,lactoseChenX,ZhangJ,KowalP,AndreanaP,WangPG:J.Am.Chem.Soc.2001,123,8866-8867.SusA:sucrosesynthaseGalE:UDP-Gal4-epimerase添加两种原料：sucrose,lactoseSuperbug-3每次进步只有一点点，积累多了才会实现自己的目标。二具有生物活性的含糖天然产物及其酶法合成含糖天然产物含糖天然产物诺加霉素阿克拉霉素(安乐霉素)；蒽环类抗癌药，它能嵌入癌细胞的DNA上，抑制核酸的合成，特别是RNA的合成，为周期非特异性药物，在G1晚期和S晚期阻断细胞周期。daunorubicinn.[微]道诺霉素；红比霉素；正定霉素；柔毛霉素（用作抗肿瘤药）含糖天然产物酶法合成TheglycosyltransferaseUrdGT2establishesbothCandOglycosidicbonds天然抗生素竹桃霉素(landomycin)抗菌性与红霉素类似含糖天然产物酶法合成含糖天然产物酶法合成含糖天然产物酶法合成

抗菌黄酮苷化合物

抗肿瘤黄酮苷化合物

降血脂黄酮苷化合物

研究表明，对于某些黄酮药物，糖的存在与否会对药效影响很大。例如：diosmin，gossipyn和rutin对于中枢神经系统有明显的镇静作用，但相应的苷元没有类似作用。桔皮素（tangeratin）是一种非常有效的抗肿瘤细胞增生的药物，体外研究表明包括桔皮素在内的三种黄酮类药物它们的糖苷型比苷元型抗肿瘤活性更高。在对乳腺腺癌细胞抑制研究中，发现柚皮苷、芦丁、芹菜素、山奈酚、白杨素的抑制活性逐渐减弱，含有糖配体的糖苷类物质活性比其他的要高些。Europeanjournalofpharmacology,2006，539(3):168-176AcomparisonofthestructuresamongthesecompoundsindicatesthefollowingelementsareessentialtothepotentialacceptorsofUGT78D1:1)the3-hydroxylgroup,2)thedoublebondintheringC,3)the4′-hydroxylgroup.GuangxiangRen,LianwenZhang,GlycoconjJ(2012)29:425–432酶（UGT78D1）的底物选择性阿糖胞苷，急性白血病，糖基部分在抑制核酸代谢物与酶的结合反应中起重要作用，从而增强了其抗肿瘤效应。烯二炔类抗肿瘤抗生素通过糖基部分与DNA结合，使药物分子嵌入DNA双螺旋的小沟中(特别是TCCT位点)。蒽环类抗生素，环A和氨基糖部分在决定药物与DNA的选择性结合中起关键作用。该类药物与DNA作用形成复合物的稳定性主要决定于药物的糖环与DNA之间的作用。以DNA为靶点的抗肿瘤药物糖配基具有协助药物生物转运和特异性识别并结合DNA的作用。含糖天然产物或药物大量存在糖分子在药物分子执行其功能时有时具有重要作用人工添加糖分子存在一定困难选择合适的药物分子或改造某种功能已知的糖苷药物，设计合成途径小结如下：三：糖蛋白药物正在开发的蛋白质和抗体药物中大约83%是糖蛋白。 2000-2005(%)2005-2010(%)抗体 35 25蛋白 15 12SmallMolecules 8 8糖蛋白市场发展速度RevenueInBillions200020052010预期发展速度预计到2010年，糖蛋白药品市场可达680亿美元。国际生物药品市场占有率分析

蛋白糖基化的作用ProteinfoldingProteintargeting/traffickingLigandrecognition/bindingBiologicalactivityStabilityRegulatesproteinhalf-lifeImmunogenicityglycocomponentofglycoproteins美国Amgen公司的EPOGEN（EPO,红细胞生成素）和Aranesp（最新的红细胞生成素）：EPOGEN，包含有165个氨基酸，其序列与天然的内源性红细胞生成素相同，具有相等的生物活性。Aranesp是第二代红细胞生成蛋白，比EPOGEN多两条N-糖链，包含了更多的唾液酸，其体内半衰期比EPOGEN长3倍多，从而显示出更强的生物活性。目前糖蛋白表达的缺点和不足非人源化的糖蛋白：糖蛋白的快速清除，改变药代动力学性质，补体激活，提高免疫原性和用药安全问题。现有人源化的糖蛋白：生产成本高，细胞容易污染，N-糖基化不足，糖基化程度不同（同一批次和不同批次）。SethuramanN,StadheimTA.Challengesintherapeuticglycoproteinproduction.CurrOpinBiotechnol.2006.17(4):341-6.掺入非天然氨基酸特定化学反应引入糖基修饰细胞表达复杂糖修饰蛋白特定酶切（Endo-H）、酶连（Endo-A/M）引入均一糖链四：糖疫苗病原微生物耐药性逐渐变强，需要更安全有效的防治方法多种微生物表面成分可作为疫苗Inprinciple,varioustypesofcellsurfaceepitopes,characteristic

fortheinvadingorganismorrelatedtoaberrantgrowthofcells,canbeappliedtodevelopvaccines.

糖合成技术的出现为糖疫苗的研究应用提供了可能Theprogressinestablishingthestructureofcarbohydrateimmuno-determinantsinconjunctionwithimprovementsincarbohydratesynthesishasrendereditfeasibletodevelopnewgenerationsofcarbohydrate-basedvaccines.部分已知糖蛋白抗原糖疫苗结构Carrierprotein:KLH(keyholeLimpethemocyanin)DT(diphtheriatoxoids，CRM197))TT(tetanusToxoids)antigen

protein

Glycan(起免疫作用的只是糖链的一部分；oligosaccharides------有机合成或多糖降解获得)CouplingBifunctionalspacermolecules(amino,carboxylorthiolgroups)Glycoconjugatevaccinesagainstbacterialinfections基于细菌荚膜多糖上的片段，如下列病原微生物：研究内容：糖链长度与疫苗功能；糖链数目与免疫功能Polysaccharidetype-3relateddi-,tri-andtetrasaccharride-CRM197conjugates:S.pneumoniaetype3infectionoligosaccharide/proteinratios肺炎球菌奈瑟氏脑膜炎球菌流感嗜血杆菌伤寒沙门氏菌痢疾志贺氏菌B型链球菌肺炎杆菌偶联多条糖链更有效病原微生物糖疫苗抗寄生虫疫苗制备更复杂.Malaria(疟疾),toxoplasmosis（弓形体病）andleishmanias（利什曼虫）.MalariacausedbyPlasmodiumfalciparum（疟原虫）,靶点：对应前两者为glycosylphosphatidylinositolanchors(GPIs)偶联于KLH获得疫苗，对疟疾有很好的防治效果。肿瘤糖疫苗至今FDA只批准了一个预防肝炎病毒的疫苗糖相关肿瘤抗原Muc-1NER-2/neuCEAP53STnGloboH糖苷酶及其应用Glycosidehydrolases(Glycosidases)

Transglycosylases

Lyases

phosphorylases糖链或糖缀合物糖苷键天然水解时，半衰期为470万年；糖苷酶可以提高催化效率10的17次方倍。糖苷键切割相关酶糖苷键底物及效率糖苷酶分类按水解机理：保持型&翻转型按糖苷键位置：内切酶，外切酶（非还原端外切酶，还原端外切酶）包括近13万条糖苷酶序列，分属130个家族

(sequence-basedfamilies,rs-mrs.fr/CAZY)超过30种糖苷酶的晶体结构已经解析Transglycosidases(transglycosylases):在寡糖和多糖之间进行糖基化反应。根据序列进行分类（EC3.2.1.-）某些保持型糖苷酶（唾液酸转移酶），活性中心可以包含一个酪氨酸某些保持型糖苷酶的酶促反应中，有邻基参与过程Myrosinases(芥子苷酶)Lyases(裂解酶)通过消去反应的机制（eg:a-glucanlyases）Phosphorylase&TransglycosidasesA-R+H3PO3-----A-H2PO3+RH“磷解”糖苷键产物：sugar-1-P(retentionorinversion)通常为外切酶（如glycogenphosphorylase)）经过糖苷-酶过渡态，糖的羟基亲和进攻合成新的糖苷键“糖解”糖苷酶（环糊精合酶）TransglycosidasesPhosphorylase水解机理都要经历鎓离子过渡态；而且活性中心包含了两个酸性氨基酸（一般为谷氨酸和天冬氨酸）Invertingglycosidase:AsingledisplacementmechanismRetainingglycosidase:Adoubledisplacementmechanism亲和标记试剂：用于研究特定的活性位点氨基酸残基。2-脱氧-2-氟糖；5-氟糖。机制：通过鎓离子过渡态去稳定化实现。Mechanism-based,time-dependentinhibitorsofretainingglycosidehydrolases.糖苷酶研究工具Time-dependentcovalentinactivatorsofglycosidehydrolasesbicyclicinactivatorsofglycosidehydrolasesNon-covalentglycosidehydrolaseinhibitorsNitrogen-containing‘sugar-shaped’heterocycles.Havinggreateractivitytowardsinvertingglucosidehydrolasesratherthanretainingones(不可水解的底物类似物)（杂环糖类似物）糖苷酶在合成中的应用可逆反应为其应用于合成提供了理论基础热动力学控制（hydrolysisisexothermicprocess）自身转糖基反应反应产物与反应温度有关；缺点：六位碳羟基产生的副反应保持型/翻转型？动力学控制（只适用于应用活化中间体的酶，