甜菜夜蛾酶活力测定方法最新版

甜菜夜蛾酶活力测定方法I仪器酶标仪型号：MolecularDevices公司生产的VERSAmax普通酶标仪和SPECTRAMAXGEMINIXS荧光酶标仪II试剂匀浆液0.1MPH7.6的匀浆缓冲液100mMPMSF（FW:174,19）匀浆液=100mMPMSF与0.1MPH7.6的匀浆缓冲液按1/100比例配制0.1MPH7.8磷酸缓冲液0.2MPH6.0磷酸缓冲液0.1MPH7.6磷酸缓冲液0.01MPH7.4磷酸缓冲液（用于蛋白标定）9.6mM的NADPH（现配现用）6mMGSH（现配现用）100mMx-NA（FW：186.21）乙醇溶液（4℃冰箱保存）反应所需的底物2mMPNA（现配现用）0.01mMMROD（现配现用）0.5mMECOD （现配现用）1.2mMCDNB （现配现用）1.2mMDCNB （现配现用）m试剂的配制方法1.匀浆液的制备100mMPMSF与0.1MPH7.8的匀浆缓冲液按1/100的比例配制①0.1MPH7.6的匀浆缓冲液配制500ml（含1mMEDTA1mMDTT1mMPTU1mMPMSF,20%甘油）：Na2HpO4•12H2O(FW:358.14)15.579gNaH2PO4•2H2O(FW:156.01)1.014gEDTA(FW:372.24)0.186gPTU(FW:152.21)0.076g不溶于水，用前先用乙醇溶解。DTT(FW:154.25)0.077g用前恢复至室温（-20℃冰箱）PMSF(FW:174.19)现用现配②100mMPMSF（FW:174.19）的配制：称17.4mgPMSF加入1ml乙醇，涡旋混匀（PMSF见光易分解，于-20℃保存）。（x\174.19X1000）\（1\1000）=100x=0.017419g一般称取174.1mgPMSF加入10ml乙醇，涡旋混匀后，分10管分装，用锡箔纸包好，放-20℃保存。0.1MPH7.8磷酸缓冲液配制500ml：(不需调PH)Na2Hp04-12H2O (FW:358,14) 16.385gNaH2P04•2H20 (FW:156,01) 0.633g0.2MPH6.0磷酸缓冲液配制500ml：(不需调PH)Na2HpO4•12H2O (FW:358,14) 4.405gNaH2PO4-2H2O (FW:156,01) 13.682g0.1MPH7.6磷酸缓冲液配制500ml：(不需调PH)Na2HpO4-12H2O (FW:358,14) 15.579gNaH2PO4•2H2O (FW:156,01) 1.014g9.6mM的NADPH(FW：833.4)的配制(现配现用)：根据自己的用量配制，用0.1MPH7.8PBS溶解，冰上保存。6mMGSH(FW：307.33)配制(现配现用)：根据自己的用量配制，用0.1MPH7.6PBS定容。100mMx-NA(FW：186.21)乙醇溶液的配制：称0.1862gx-NA于10ml容量瓶中，用0.1MPH7.6PBS定容(4℃保存备用)。(x\186.21X1000)\(10\1000)=100x=0.1862g底物母液的配制：400mMPNA(FW:153.15)母液的配制：称取0.6126gPNA溶于10ml的无水乙醇(x/153.15X1000)\(10/1000)=400x=0.6126g1mMMROD(FW:227.20)母液的配制：称取0.0009gMROD溶于二甲基亚砜(PMSO)。(x/227.20X1000)/(1/1000)=1x=0.00023g20mMECOD母液(FW:190.20)母液的配制：称取0.0038gECOD溶于1ml的无水乙醇(x/190.20X1000)/(1/1000)=20x=0.0038g120mMCDNB(FW:202.6)母液的配制：称取0.0242gCDNB溶于1ml的无水乙醇(x/202.6X1000)/(1/1000)=120x=0.0242g120mMDCNB(FW:192)母液的配制：称取0.023gDCNB溶于1ml的无水乙醇(x/192X1000)/(1/1000)=120x=0.023gW酶活力测定操作步骤准备工作：酶标仪打开，设定温度为30℃；离心机降为4℃状态。.酶液的制备：假设目前有2个品系，每个品系10个样，每个样一个重复，并设空白对照，共21个反应。匀浆缓冲液配制每个样本用1200ul匀浆缓冲液匀浆，20个样本则需1200ulX20=24000ul。取30ml匀浆缓冲液冰浴备用（300ul100mMPMSF+30ml匀浆缓冲液），匀浆缓冲液（含1mMEDTA,1mMDTT,1mMPTU,20%甘油，1mMPMSFPMSF现配现用）酶液1：取5〜7mg的三龄幼虫10头为一个样本，每个样本用1200ul匀浆缓冲液匀浆。取10头三龄幼虫放入匀浆器中，匀浆前加入600ul0.1MPH7.6匀浆夜匀浆，匀浆后再加入600ul匀浆缓冲液冲洗匀浆器并将匀浆液转移到1.5ml离心管中，标上记号，冰上保存以备用。酶液2:取2日龄的甜菜夜蛾5龄幼虫置于冰上解剖，将其第一对胸足前部分和第四对腹足后的部分去除，再沿背中线剖开虫体，取其去掉内含物的中肠，在冰冷的0.1MPH7.6磷酸缓冲液中清洗干净后，置于干净的离心管（预先加好200ul的匀浆夜）中，每6个幼虫的中肠合并为一个样。匀浆时将离心管里的样品转移到匀浆器中后直接匀浆，然后再用1000ul的匀浆缓冲液清洗匀浆器，合并全部溶液共1200ul。将准备好的酶液放入4℃,13,000g离心机离心30分钟后，用玻璃丝过滤将上清液转移到新的1.5ml离心管中，再次4℃,13,000g离心10分钟，用玻璃丝过滤将上清液转移到新的1.5ml离心管中，最后4℃,13,000g离心5分钟，作为最终酶活测定的粗酶液。※第一次离心时将NADPH从冰箱中取出回温20分钟。.多功能氧化酶（MFO）活性测定（动力学法）：9.6mM的NADPH（FW：833.4）的配制（现配现用）：称取NADPH0.0064g溶于0.8ml的0.1MPH7.8PBS置于1.5ml离心管中涡旋溶解，冰上保存。（x*93.3%/833.4X1000）/（0.8/1000）=9.6x=0.00685g（21个反应需10ulX21X3=630ul,可制备800ul备用）y=x*116.615（x为NADPH重量，y为缓冲液体积）配完将NADPH放回冰箱-20℃保存。①以对硝基苯甲醚（PNOD）为底物普通酶标仪：波长：405nm,T：30℃,每25秒记录一次，反应15分钟。将预先配好400mMPNA的母液稀释至2mMPNA：用密封瓶盛装3000ul0.1MPH7.8PBS,用微波炉加热至不沸腾即可，再加入15ul4mMPNA振荡混匀。（PNA不易溶解）（xX400）/3000ul=2x=15ul（21个反应需100ulX21=2100ul,可制备3ml备用）96孔酶标板中加入：100ul2mMPNA+90ul酶液I30℃温育3分钟，振荡混匀，计时器计时加入10ul9.6mMNADPHI开始反应②以甲基试卤灵（MROD）为底物：荧光酶标仪：激发波长：530nm，发射波长：585nm,T:30℃,每45秒记录一次，反应12分钟。将预先配好的1mMMROD母液稀释至0.01MmMROD:用密封瓶盛装3000ul0.1MPH7.8PBS,再加入30ul1mMMROD振荡混匀。（xX1）/3000ul=0.01x=30ul（48个反应需100ulX21=2100ul,可制备3ml备用）黑色酶标板中加入：100ul0.01mMMROD+50ul酶液|30℃温育3分钟，振荡混匀，计时器计时加入10ul9.6mMNADPH|开始反应③以7-乙基香豆素（ECOD）为底物：荧光酶标仪：激发波长：380nm，发射波长：460nm,T:30℃,每45秒记录一次，反应15分钟。将预先配好20mMECOD母液稀释至0.5mMECOD：用密封瓶盛装2000ul0.1MPH7.8PBS,再加入50ul20mMECOD振荡混匀。（xX20）/2000ul=0.5x=50ul（48个反应需80ulX21=1680ul,可制备2ml备用）黑色酶标板中加入：80ul0.5mMECOD+50ul酶液|30℃温育3分钟，振荡混匀，计时器计时加入10ul9.6mMNADPH|开始反应X此时将荧光酶标仪关掉并将还原型GSH从冰箱中取出回温20分钟待用。☆将粗酶液1（三龄幼虫制备的酶液）稀释10倍备用，用于以CDNB为底物时GST酶活力、EST及蛋白浓度测定：将20ul粗酶液加入180ul0.1MPH7.6PBS于1.5ml离心管中，振荡混匀，标清记号，冰上保存备用。将粗酶液2（以5龄幼虫的中肠制备的酶液）稀释10倍和20倍备用，稀释10倍的酶液用于用于以DCNB为底物时GST酶活力的测定，稀释20倍的酶液用于以CDNB为底物时GST酶活力、EST的测定及蛋白浓度测定。稀释10倍：20ul粗酶液加入180ul0.1MPH7.6PBS于1.5ml离心管中，振荡混匀，标清记号，冰上保存备用。稀释20倍：10ul粗酶液加入190ul0.1MPH7.6PBS于1.5ml离心管中，振荡混匀，标清记号，冰上保存备用3.谷胱甘肽S-转移酶活性（GST）测定（动力学法）：普通酶标仪：波长：340nm，T：30℃，每10秒记录一次，反应20分钟6mMGSH（FW：307.33）配制（现配现用）：称0.0092g还原型GSH（FW：307.33），加入5ml0.1MPH7.6PBS于密封瓶中，震荡混匀。（x/307.33X1000）/（5/1000）=6x=0.0092g（21个反应需100ulX21X2=4200ul,可制备5ml备用）①以1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）为底物：将预先配好的120mMCDNB母液稀释至1.2mMCDNB：用密封瓶盛装3000ul0.1MPH7.6PBS,再加入30ul120mMCDNB振荡混匀。（xX120）/3000=1.2x=30ul（21个反应需100ulX21=2100ul,可制备3ml备用）酶液1（三龄幼虫制备的酶液）96孔酶标板中加入：10ul稀释10倍的酶液+100ul1.2mMCDNB+100ul6mMGSHI开始反应酶液2（以5龄幼虫的中肠制备的酶液）96孔酶标板中加入：10ul稀释20倍的酶液+100ul1.2mMCDNB+100ul6mMGSHI开始反应②以1,2-二氯-4-硝基苯（DCNB）为底物：将预先配好的120mMDCNB母液稀释至1.2mMDCNB：用密封瓶盛装3000ul0.1MPH7.6PBS,再加入30ul120mMDCNB振荡混匀。（xX120）/3000=1.2x=30ul（48个反应需100ulX21=2100ul,可制备3ml备用）酶液1（三龄幼虫制备的酶液）96孔酶标板中加入：25ul粗酶液+100ul1.2mMDCNB+100ul6mMGSHI开始反应酶液2（以5龄幼虫的中肠制备的酶液）96孔酶标板中加入：25ul稀释10倍的酶液+100ul1.2mMDCNB+100ul6mMGSHI开始反应X此时将酶标仪温度降至27℃以便羧酸酯酶（EST）活性测定。.竣酸酯酶（EST）活性测定（动力学法）：普通酶标仪：波长：450nm,T：27℃,每30秒记录一次，反应10分钟底物与显色剂混合液的配置（21X205ul=4305ul）：0.2MPH6.0PBS与固蓝RR盐与100mMx-NA乙醇溶液按1：2：0.01比例混合例如：用密封容器盛装10ml0.2MPH6.0PBS，其中中加入20mg固蓝RR盐和0.2ml100mMx-NA乙醇溶液，振荡混匀，用定性滤纸过滤得黄色澄清的底物和显色剂混合液（现用现配）。酶液1（三龄幼虫制备的酶液）96孔酶标板中加入：20ul稀释10倍酶液+205ul底物和显色剂混合液（用八通道移液枪迅速加入）。酶液2（以5龄幼虫的中肠制备的酶液）96孔酶标板中加入：20ul稀释20倍酶液+205ul底物和显色剂混合液（用八通道移液枪迅速加入）。此时将酶标仪温度降至25℃以便蛋白含量测定。.蛋白含量测定（终点法）：普通酶标仪：波长：595nm,T：25℃用0.01MPH7.4PBS将牛血清白蛋白（BSA）配成2