实时定量PCR课件

实时荧光定量PCR技术简介芯片实验室BIO-RAD实时荧光定量PCR仪之OUTLINE实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR在科研上的应用实时荧光定量PCR实验设计实例实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR三个关键词：实时，荧光，定量如何实时检测？？？借助荧光物质示踪扩增产物量的变化定量PCR如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析引入两个概念：荧光阈值、Ct值实时荧光定量PCR原理定量原理荧光阈值在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)ThresholdlineC(t)value实时荧光定量PCR原理定量原理实时荧光定量PCR原理定量原理Ct值的概念Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数ThresholdlineC(t)valueLog浓度与循环数呈线性关系初始模板量越多,扩增产物达到某一值（域值）时所需要的循环数越少确定初始模板的浓度实时荧光定量PCR原理定量原理定量原理实时荧光定量PCR原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=N(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为N.方程式(1)两边同时取对数得:logN=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:

logX0=-

log(1+Ex)*Ct+logN(3)Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量DetermineC(t)valueforunknownInterpolatequantityofunknownusingthestandardcurveunknown104103Unknowncontains3108copies实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR原理为什么要用Ct值定量实时荧光定量PCR方法利用Ct的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。实时荧光定量PCR原理相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性

Ct值的重现性实时荧光定量PCR原理常规PCR技术：PCR后借助电泳对扩增反应的终产物进行定量及定性分析DNAEngineS1S2M常规PCR实时荧光定量PCR原理常规PCR常规PCR结合电泳分析方法的缺点只能对终产物进行分析,无法对起始模板准确定量必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析,费时费事无法对扩增反应实时检测EB有毒与传统PCR的比较AbsolutequantificationispossibleSensitiveDetectslowercopiesoftargetDetectssmallfolddifferencesSampleswithabroadrangeofconcentrationsareanalyzedwithoutnormalizingconcentrationCosteffectiveandtimeefficientFlexibleassaydesignSYBRGreenISYBRGreen1BIO-RAD实时荧光定量PCR仪之SYBRGreenI工作原理BIO-RAD实时荧光定量PCR仪之SYBRGreen1

结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen1

染料只有和双链DNA结合后才发荧光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAASYBRGreenI工作原理BIO-RAD实时荧光定量PCR仪之SYBRGreenI特点使用方便 ---不必设计复杂的荧光探针

没有序列特异性---可以用于不同的模板

便宜

灵敏与非特异性产物结合BIO-RAD实时荧光定量PCR仪之

Plotthenegativeoftherateofchangeoffluorescencevs.temperature(-dI/dT)-dIdTTmBIO-RAD实时荧光定量PCR仪之

SYBRGreenI融解曲线分析BIO-RAD实时荧光定量PCR仪之

SYBRGreenI融解曲线分析Identicalreactioncomponents,exceptinitialtemplateconcentrationvaries10,000copiesNon-specificproductAmpliconAmplicon10copiesForreliablenucleicacidquantification,eachprimersetrequiresindividualoptimizationParametersusedtooptimizereactionspecificityandefficiencyPrimerdesignAmplicondesignConcentrationofreagentsCyclingconditionsDenaturationandannealingtemperaturesBIO-RAD实时荧光定量PCR仪之

Real-timePCR体系优化Molecular

BeaconsMolecularBeaconsMJR系列实时荧光定量PCR仪之发夹型杂交探针MolecularBeacons原理：荧光谐振能量传递（FRET）

茎由互补配对的序列组成环与目标序列完全配对茎MJR系列实时荧光定量PCR仪之荧光素淬灭剂环变性:产生非特异性的荧光MolecularBeaconsMJR系列实时荧光定量PCR仪之Target-loopinteractionmorestablethanstem-stemTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQRTargetDuringtheannealingstep:ProbebindstargetReporterandquencherseparatedTarget-specificfluorescenceMJR系列实时荧光定量PCR仪之MolecularBeacons

延伸:没有荧光MolecularBeaconsSNPOpticon实时荧光定量PCR仪之MolecularBeacons应用范围定量起始模板浓度基因型分析鉴定产物单核苷酸多态性（SNP）检测MJR系列实时荧光定量PCR仪之MolecularBeaconsSNPTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQ荧光素目标序列茎淬灭剂MJR系列实时荧光定量PCR仪之MolecularBeacons优点对目标序列有很高的特异性用于SNP检测的最灵敏的试剂之一荧光背景低MJR系列实时荧光定量PCR仪之MolecularBeacons缺点设计困难无终点分析功能只能用于一个特定的目标价格较高MJR系列实时荧光定量PCR仪之TaqMan探针荧光素淬灭剂MJR系列实时荧光定量PCR仪之TaqMan水解型杂交探针TaqMan目标特异性探针5’为荧光素，3’为淬灭剂5’荧光素3’淬灭剂与目标序列互补MJR系列实时荧光定量PCR仪之RQReporterQuencherRQIntactprobe-reporterquenchedbyFRETFRRQDuringPCR,probehybridizestotargetsequenceRQProbeispartiallydisplacedduringextensionRQProbecleavedby5’-3’nucleaseactivityofpolymeraseRQFreereporterexhibitsunquenchedfluorescenceMJR系列实时荧光定量PCR仪之TaqMan工作原理TaqMan实验结果MJR系列实时荧光定量PCR仪之TaqMan应用范围定量起始模板浓度基因型分析产物鉴定SNP分析MJR系列实时荧光定量PCR仪之TaqMan优点对目标序列有很高的特异性---特别适合于SNP检测与MolecularBeacons相比设计相

对简单MJR系列实时荧光定量PCR仪之TaqMan缺点价格较高只适合于一个特定的目标不能进行融解曲线分析背景高

MJR系列实时荧光定量PCR仪之兼容化学试剂总结结合于双链DNA的小沟中发夹型杂交探针水解型杂交探针（5‘-3’外切）延伸复性任何步骤定量和检测目标基因融解曲线分析SNP分析定量和检测目标基因SNP分析定量和检测目标基因信号检测工作原理有否淬灭剂化学试剂否有有主要应用范围MJR系列实时荧光定量PCR仪之MJR系列实时荧光定量PCR仪之双通道与内标准确的相对定量方法---内标法---解决模板提取过程中造成的差别---解决样品材料不均一造成的差别---解决加样过程中的差别MJR系列实时荧光定量PCR仪之内标法内标法必须：在一个PCR管中进行两种PCR反应：一个是有差别的（目标RNA或DNA）一个是无差别的（内标RNA或DNA）MJR系列实时荧光定量PCR仪之内标法内标的种类看家基因添加DNA或RNA实时荧光定量PCR技术之多色双通道技术多色双通道技术：多色：可使用多种荧光染料双通道：可同时测定两种荧光染料发出的荧光一个PCR管内进行两种PCR扩增要解决的问题：1、引物及探针问题---引物及探针的相互干扰2、模板量差别---共用资源的相互竞争实时荧光定量PCR技术之多色双通道技术FRRQFRRQFRRQRQ实时荧光定量PCR技术之多色双通道技术1、引物及探针问题FRRQFRRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQ2、共用资源的相互竞争实时荧光定量PCR技术之多色双通道技术FRRQFRRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQRQ解决办法：单双通道同时进行，相互验证实时荧光定量PCR技术之多色双通道技术单单双实时荧光定量PCR技术之多色双通道技术解决办法之二：primerlimiting实时荧光定量PCR原理OUTLINE实时荧光定量PCR的原理：什么是实时荧光定量PCR荧光化学双通道与内标基因分型（SNP）检测FRFQCVQTCSNPG/AFQCVQTForwardprimerReverseprimerAllele-specificprobeAllele-specificprobe用TaqMan探针进行基因型分析实时荧光定量PCR技术之SNP检测-基因型分析QF5’CGQ5’3’GCFQV5’3’GTQ5’3’HybridizationofTaqManProbeDigestionofprobe-fluorescenceNOdigestionofprobe-NOfluorescenceTVQCFQMatchforAllele1ReducedEfficiencyofProbeHybridizationMismatchforAllele1Polymerase实时荧光定量PCR技术之多色双通道技术应用-基因型分析从病人血液样品中提取DNA基因型分类：A/A(Allele1)G/G(Allele2)G/A(Heterozygote)CFQTVQ实时荧光定量PCR技术之多色双通道技术应用-基因型分析Allele1controlVICFAM实时荧光定量PCR技术之多色双通道技术应用-基因型分析Allele2controlVICFAM实时荧光定量PCR技术之多色双通道技术应用-基因型分析HeterozygotecontrolFAMVIC实时荧光定量PCR技术之多色双通道技术应用-基因型分析实时荧光定量PCR技术之多色双通道技术应用-基因型分析实时荧光定量PCR技术之多色双通道技术应用-基因型分析MJR系列实时荧光定量PCR仪之OUTLINE实时荧光定量PCR原理荧光定量PCR仪简介实时荧光定量PCR在科研上的应用实时荧光定量PCR实验设计实例MJR系列实时荧光定量PCR仪之OUTLINE实时荧光定量PCR原理荧光定量PCR仪简介实时荧光定量PCR在科研上的应用实时荧光定量PCR实验设计实例实时荧光定量PCR技术之应用定量：DNA定量RNA定量定性：SNP分析基因型分析RNA变异分析融解曲线分析临床定量研究的应用：病原微生物引起的疾病的检测病原微生物含量与病情的轻重程度、传染性及治疗效果之间的关系新的治疗与预后指标的研究病原微生物含量与用药之间的关系新的病原体分子诊断标准超早期感染治疗用药物及疗法的研究与开发在传染病流行病学方面的应用：医院血站防疫站实时荧光定量PCR技术之应用8.

传染病的发病监控、预测与预防9.mRNA的表达水平与是否肿瘤及其进展的关系10.肿瘤相关基因表、肿瘤标志物和肿瘤耐药基因的检测11.mRNA的表达水平与染病及病情之间的关系：预测、诊断、评价、指导治疗实时荧光定量PCR技术之应用实时荧光定量PCR技术之应用临床定性检测(SNP)的应用：1.等位基因与遗传病之间的关系2.诊断及预测致病风险3.SNP与体质遗传病之间的关系4.药物基因组学及新药的发现5.合理用药研究其他：比较染病组织与正常组织中各种mRNA含量差异病毒性疾病中病毒的耐药性变异株的测定HBV基因突变，尤其是前核基因突变，直接影响HBV感染病情转归及抗毒治疗效果，同时也反映了来自体内或外界选择压力的作用。因此，突变株在体内产生的确切原因，突变株与野生株混合存在的发展趋向，突变株是否为耐药株，突变株与野生株相对含量的变化与致病性的关系，突变株与免疫耐受的关系等均是有必要进一步澄清的问题。新临床诊断及检验试剂的开发研究ELISA方法的漏检率HLA分型：取代传统电泳方法实时荧光定量PCR技术之应用实时荧光定量PCR技术之应用6.遗传病诊断：如地中海贫血等位基因检测多基因遗传病的突变检测基因表达异常所致遗传病检测胚胎植入前遗传诊断（preimplantationgeneticdiagnosis，PGD）是用人类辅助生殖技术获得受精卵，体外培养发育到6～10细胞的卵裂球时，通过显微操作技术从中活检1～2个单细胞，利用医学分子遗传学诊断技术对单个卵裂球细胞标本进行遗传诊断，然后将它们移植回母体子宫内继续发育至妊娠，从而避免遗传病患儿出生。遗传病基因携带夫妇如不想用产前诊断、人工流产来避免高危受累患儿的出生，PGD目前是他们的唯一选择。与以前采用的巢式PCR相比，FQPCR减少了等位基因缺失（alleledrop-out，ADO）现象的发生。

MJR系列实时荧光定量PCR仪之应用其他方面的部分应用：公安系统相关：个人身份鉴定物证的各种鉴定人种的鉴定考古方面动植物检疫MJR系列实时荧光定量PCR仪之应用研究方面部分应用基因表达分析：responsestoaparticularstimulustissuedifferentiationstagesofdevelopmentcellproliferationdiseasestateprogression物种分类环境污染与毒理监测：生物标志物的定量检测基因芯片结果的复证分子生态学研究GenotypingMJR系列实时荧光定量PCR仪之应用MJR系列实时荧光定量PCR仪之应用转基因研究方面的部分应用：转基因的基因拷贝数与受体生物性状之间的关系；转基因的基因表达量与受体生物性状之间的关系；

转基因胚胎中转基因拷贝数的测定；

转基因对受体生物其他基因表达的影响（包括不同的发育时期的影响）；MJR系列实时荧光定量PCR仪之应用转基因生物安全方面的部分研究：转基因在环境中的扩散监测；转基因生物世代传递中的拷贝数、表达量变化监测食品、烟草、化妆品等中转基因成份含量的测定（GMO)转基因成分含量与毒理代谢之间的关系MJR系列实时荧光定量PCR仪之OUTLINE实时荧光定量PCR原理荧光定量PCR仪简介实时荧光定量PCR在科研上的应用实时荧光定量PCR实验设计实例应用实例之OutlineTwo-color-real-timeqPCRassayforCancermarkerexpressionusingTaqMan®probesOne-colorreal-timeqPCRassay

(SGI)forGMOsoydetectionOne-colorreal-timeqPCRassay(SGI)fortissueprofiling

ExperimentsettinganddataanalysisTraditionalNorthernblotUsefulformRNAsizedeterminationRNaseprotectionassayMappinginitiation,terminationandalternativesplicesitesHighthroughputMicroarrays应用实例之基因表达的研究方法AbsolutequantificationSensitiveDetectslowercopiesoftargetthanothermethodsDetectssmallfolddifferencesSampleswithabroadrangeofconcentrationsareanalyzedwithoutnormalizingconcentrationCosteffectiveandtimeefficientEaseofuse应用实例之RT-qPCR的优点应用实例之Cancermarkerexpression

TaqManchemistryMultiplexingExpressiondifferencesofERBB2inneoplasticbreasttissuesamples应用实例之CancermarkerexpressionERBB2oncogeneTransmembranetyrosinekinase

overexpressedin~25%ofbreastcancercasesIncreasedtranscriptlevelsassociatedwithapoorprognosisandlowerresponsetostandardtreatmentsGAPDHhousekeepinggenefornormalization材料和方法

材料从正常乳腺组织中提取的TotalRNA从乳腺癌组织中提取的TotalRNA含ERBB2andGAPDH的质粒用于生成标准曲线单双通道同时进行，独立分析ControlsnoRNARNA+noreversetranscriptase实验材料材料和方法

RT-qPCRMultiplexRT-qPCRreactioncomponentsComponentStockconcentrationvolumeFinalconcentrationRNATargetPrimer/probemixGAPHDPrimer/probemixQuantiTectProbeRT-PCRmixReversetranscriptaseddH2O1ng/ul20X20X2X2.0ul0.5ul0.5ul10.0ul0.2ul6.8ul0.5X0.5X1XTotalvolume20ul材料和方法

RT-PCRRT-qPCRprogram

1,50ºC,30min2,95ºC,15min3,94ºC,15sec4,60ºC,1min5,plateread6,gotostep3,39moretimes7,10ºC,foreverEnd应用实例之CancermarkerexpressionColor2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2CH1-FAMdetection-ERBB2实验结果