食品检验选修12硕士6课件

第五章食品中兽药残留的检验第一节概述一、食品中兽药残留的来源兽药（veterinarydrugs）是指用于预防、治疗和诊断动物疾病或者有目的的调节动物生理机能并规定作用、用途、用法、用量的物质。主要包括：血清制品、疫苗、诊断制品、中药材、中成药、化学药品、抗生素、生化药品、放射性药品及外用杀虫剂、消毒剂等。兽药残留是指食品动物用药后，动物性食品中含有某种兽药的原型或其代谢产物以及与兽药有关的杂质残留。主要残留的兽药是抗生素类、激素药类和驱虫药类。合理使用兽药可以预防、治疗和诊断动物疾病，调节动物生理机能，促进动物生长和繁殖，改善动物食品或其乳制品的品质。如果滥用兽药，会造成动物性食品种兽药残留，对人体造成危害。兽药残留的主要原因：3.动物性食品保鲜

动物性食品在运输和保存过程中，为了保鲜，加入某种抗生素以抑制微生物生长繁殖，造成药物残留二、兽药残留的危害（一）毒性作用1.急性中毒如摄入含瘦肉精（盐酸克伦特罗）残留的猪肉或其肝、肺等内脏后，会产生心悸、恶心、头晕、肌肉震颤等急性中毒反应。2.慢性中毒长期食用含有残留兽药的动物性食品，兽药可在体内不断蓄积，到一定程度后，就会对人产生毒性作用。如磺胺类药物可引起肾损害。3.“三致”作用如苯丙咪唑类抗蠕虫药能引起细胞染色体突变和致畸胎作用，妊娠妇女摄入过量苯丙咪唑类药物残留的动物性食品，可能发生胎儿畸型。（二）耐药性动物反复接触某种抗生素，体内耐药菌株大量繁殖，这些耐药菌株通过动物性食品传给人，可能给疾病治疗带来困难。（三）过敏反应青霉素、四环素、磺胺类药物等能使部分人群发生过敏反应。当摄入含这些抗生素残留的动物食品时，会使这部分人致敏，产生抗体。当这些个体再接触这些抗生素时，这些抗生素就会与抗体结合形成抗原抗体结合物，可能再次发生过敏反应。（四）激素（样）作用具有激素样活性的化合物作为同化剂用于畜牧。深部肌肉注射同化剂属非法用药。若埋植或注射同化激素后不久就将动物宰杀，会有大量同化激素残留，被人食入后可产生一系列激素样作用。如潜在致癌性，发育毒性（儿童性早熟）等。

三、兽药残留限量标准和检验方法我国农业部2002年颁布了最新的兽药在《动物性食品中最高残留限量》，可用于动物食品，不需要制定最高残留限量的药物有88种；需制定最高残留限量的有94种；可以使用，但不得检出残留的药物有9种；禁止使用，且不得检出残留的药物有31种。目前，我国已建立了40种动物源性食品中兽药残留标准检验方法，包括国家标准和农业部标准。主要有气相色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫法（ELISA）和仪器联用技术法。大多数兽药极性和沸点偏高，使GC法的使用受到限制。HPLC法应用的较多，但对某些兽药残留，检出限达不到要求，如水产品中链霉素的残留限量要求小于0.1μg/kg

（欧盟标准）。联用技术优势结合，准确度、灵敏度、选择性都高，是国际上公认和确认的方法。包括GC-MS、LC-MS、LC-MS/MS、TLC-MS等。第二节食品中抗生素类兽药残留检验一、四环素类抗生素的检验1.四环素类抗生素的结构和理化性质四环素类抗生素是家禽、家畜常用的防病治病药物，包括四环素（TC）、土霉素（OTC）、金霉素（CTC）。基本结构是十二氢化并四苯：TC、OTC、CTC的区别在于结构式中R5和R7位上连接不同的离子或基团。四环素类抗生素的理化性质：使用该类抗生素如果在动物宰杀时休药期不够，容易在动物体内造成残留。制作工作曲线：取一定量切碎肉样分别加不同浓度的TC、OTC和CTC混合标准溶液，按样品处理方法处理后进样测定。标样浓度为横坐标，峰高为纵坐标，绘制工作曲线。样品测定后，依标准曲线确定其浓度。出峰顺序为：土霉素、四环素、金霉素。二、氯霉素类抗生素的检验氯霉素类兽药包括氯霉素（CAP）、无味氯霉素（CRP）、乙酰氯霉素（CF）、甲砜霉素（TAP）、氟甲砜霉素（FF）等。CAPs对骨髓细胞、肝细胞有毒性作用，可导致氯霉素敏感者发生严重的再生障碍性贫血，规定为在动物性食品中不得检出。（1）气相色谱法1）原理样品经提取、净化、衍生化后，用毛细管气相色谱分离，电子捕获检测器检测。2）样品处理取适量样品，加乙腈提取，提取液过SPEC18柱净化，净化后用N，O-二（三甲基硅烷）三氯乙酸铵＋三甲基氯硅烷衍生化。3）测定HP-5毛细管色谱柱，程序升温，检测器温度320℃，He气作载气。衍生的目的是使兽药分子中的极性基团，如羟基、氨基、羧基等变成弱极性，使化合物更易于挥发，适合GC分析要求。本法常用于牛奶中氯霉素类抗生素残留的检验。（2）高效液相色谱-质谱法1）原理被分析物用乙酸乙酯提取，提取液浓缩后再用水溶解，固相萃取净化，HPLC-MS测定。3）测定液相色谱串联四级杆质谱仪，电喷雾离子源，C18柱，柱温30℃，离子源温度450℃，乙腈＋水（20＋80）流动相，定性定量测定。氯霉素参考保留时间12.31min。本法为国家标准方法，适用于蜂蜜中CAP残留测定，检测限为2ng/g，采用于CAPs的确认实验。三、磺胺类兽药残留检验1.磺胺类兽药的结构和理化性质磺胺类药（SAs）物具有氨基苯磺酰胺基本结构，常用的有磺胺嘧啶（SD）、磺胺甲恶唑（SMZ）、磺胺甲氧嘧啶（SMM）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）等。磺胺类药物对某些人有致敏作用，易引起皮肤骚痒和荨麻疹，重者引起血管性水肿，甚至出现死亡。在体内蓄积达到一定程度，对肝、肾副作用大，还可以影响人的造血系统。中国和欧美等大多数国家规定动物性食品和饲料中的SAs总量≤0.01mg/kg，日本规定动物性食品中不得检出SAs。检验方法有HPLC法、GC法、GC-MS法、ELISA法、TLC法和分光光度法。HPLC是最常用的方法。2.HPLC法测定磺胺类兽药残留1）原理用乙酸乙酯提取被分析物，加正己烷萃取除去脂肪，过氧化铝柱净化去杂质，减压干燥后残留物用流动相溶解，高效液相色谱测定。2）样品处理取适量样品，加乙腈和少许无水硫酸钠作2次均质化处理，合并上清液，加适量正己烷振荡除去样品中的脂溶性杂质，离心，弃去正己烷层。下层液体加适量正丙醇于50℃减压干燥，加乙腈溶解残留物，过氧化铝B小柱，用95％乙腈洗脱杂质，用70％乙腈洗脱被测组分，收集洗脱液，加适量正丙醇，50℃减压干燥后，准确加入一定量流动相溶解残留物，待测定。3）测定色谱柱：C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相：乙腈＋甲醇＋水＋乙酸（2+2+9+0.2），紫外检测器波长270nm，进样量：20μl。磺胺类药物最大吸收波长在260nm～280nm，本法同时测定多种磺胺类药物，因此选择270nm为测定波长。4)方法说明磺胺类药物极性较强，95%乙腈的极性较小，洗脱能力较弱，仅能洗脱杂质；70%乙腈溶液相对极性较大，能洗脱氧化铝小柱中吸附的磺胺类药物。氧化铝有酸性、中性和碱性三种，氧化铝B为碱性氧化铝。四、硝基呋喃类兽药残留检验1.概述硝基呋喃类（NFs）药物包括：呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等。硝基呋喃分子式：C8H7N3O5结构为：黄色粉末，无臭、味苦，能溶于二甲基甲酰胺，在水、乙醇、三氯甲烷中微溶。硝基呋喃类药物及代谢物均可使实验动物发生癌变和基因突变。国际食品法典委员会、中国和欧盟等大多数国家禁止使用此类兽药。测定硝基呋喃类药物的方法有:HPLC法、GC法、LC-MS法、ELISA法,最常用的是HPLC法。2.HPLC法测定畜禽肉中呋喃唑酮1）原理用乙酸乙酯洗脱C18填料吸附的被分析物，减压浓缩至干，用乙腈－磷酸－水混合液溶解，过氧化铝小柱后供HPLC检测。2）样品处理取适量蓄禽肉样品，按1:1.5的质量比加入C18填料，混匀后装入玻璃层析柱中。用正己烷淋洗，去除脂肪。再用乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液。在55℃～60℃下减压浓缩至干，加少量乙腈－磷酸－水混合液溶解残渣，过氧化铝小柱净化，洗脱液供HPLC测定。3）测定C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈＋0.015mol/LH3PO4（2+8），流速0.7ml/min～1.0ml/min；检测波长367nm。用流动相稀释标准系列，经氧化铝小柱净化依次测定标准系列和样品。本法适于鸡的肌肉、肝、肾组织和鱼肉组织中呋喃唑酮残留测定。第三节盐酸克伦特罗残留的检验一、概述盐酸克伦特罗商品名有咳喘素、息喘宁，俗名瘦肉精，结构为：化学名为α-〔（叔丁氨基）甲基〕-4-氨基-3,5二氯苯甲醇盐酸盐。分子式:C12H18Cl2N2O-HCl白色结晶粉末，无臭、味苦。溶于水、乙醇，微溶与丙酮，不溶于乙醚。化学性质稳定，一般条件不能将其破坏，加入至172℃分解。含有盐酸克伦特罗的肉食品加工时经100℃沸水、烧烤、微波处理等过程其残留不减少。盐酸克伦特罗具有调节动物神经兴奋功能，一次性摄入大量瘦肉精，会出现急性中毒反应。长期食用可致染色体畸变，诱发恶性肿瘤等。鉴于它的副作用，被列为禁止使用的饲料添加剂。WHO和FDA规定盐酸克伦特罗在动物体内的最高残留限量为肉0.2μg/kg；肝、肾0.6μg/kg；奶0.05μg/kg，我国规定的残留限量为牛、马肌肉0.1μg/kg；肝、肾0.5μg/kg；牛奶0.05μg/kg。二、盐酸克伦特罗残留的检测1.GC-MS法1）原理

用高氯酸溶液匀浆样品，超声波辅助提取后净化处理，经N,O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTAF）衍生后用GC-MS测定，内标法定量。2）样品处理（1）提取：取适量肉样品，加一定量0.1mol/L高氯酸匀浆，超声波辅助提取后置于80℃水浴，冷却后离心，取上清液。沉淀用高氯酸洗涤，再离心，合并上清液。加入氯化钠，混匀，用异丙醇+乙酸乙酯（40＋60）振荡提取，取上层有机相，水相用异丙醇－乙酸乙酯再提取一次，合并有机相，用60℃水浴蒸发至近干。（2）净化用乙醇、水、NaH2PO4缓冲液、水依次清洗阳离子交换柱；然后取适量样液过柱；分别用水、乙醇淋洗去杂质；最后用乙醇＋浓氨水（98+2）洗脱分析物；收集洗脱液，吹氮气浓缩至干。（3）衍生化净化后试样残渣加乙醇和内标物：1-异丙氨基-3-〔对-（2-甲氧基）苯氧基〕-2-丙醇L（＋）酒石酸盐（美托洛尔），迅速加入衍生剂（BSTAF），密闭，于75℃衍生化。蒸干后用适量甲苯定容，待用。盐酸克伦特罗标准系列同时衍生化。

3）测定毛细管色谱柱（30m×0.25mm），载气：He（99.99%），进样口温度240℃，进样量1μl，质谱特征离子峰：盐酸克伦特罗：m/z86、187、243、262；美托洛尔：m/z72、223。取1μl样品衍生液或标准系列衍生液注入GC-MS仪，以试样峰（m/z86、187、243、262）与内标峰（m/z72、223）的相对保留值定性，以试样峰（m/z86）和内标峰（m/z72）的峰面积比值单点或多点标准定量。4）方法说明采用超声波辅助提取，介质中的微小气泡爆裂，有破碎细胞壁的作用，加速残留兽药溶出；加氯化钠起液－液萃取时防止乳化作用；衍生化前净化处理，防止有相同官能团杂质生成衍生物干扰测定。2.酶联免疫（ELISA）法ELISA法是国家标准方法（GB/T5009.192-2003）的第三法，目前国内多用ELISA法筛选，GC-MS或HPLC法确认。酶联免疫法基于抗原抗体竞争反应进行测定。微孔板包被有克伦特罗IgG抗体，加入竞争性酶标记克伦特罗和标准（或试样）溶液。克伦特罗与酶标记克伦特罗竞争克伦特罗抗体，没与抗体结合的酶标记克伦特罗在洗涤步骤中被除去。加入底物和发色剂于微孔板，标记物上的酶催化底物反应使无色发色剂转变为蓝色，加入反应停止液使颜色由蓝转变为黄色。在波长450nm处测定吸光度值，与克伦特罗浓度成反比。样品前处理（提取、净化）步骤与GC-MS法相同，采用试剂盒进行抗原抗体反应，用分光光度计测定。第四节激素类兽药残留的检验一、概述激素（hormone)包括同化激素和其他生长促进剂。甾体类同化激素：雄激素类（甲基睾酮、苯丙酸诺龙等；雌激素类：雌二醇、炔雌醇等；非甾体类同化激素，如己烯雌酚、双烯雌酚等；孕激素类：孕酮、炔诺酮等。雌激素类是18个碳原子雌烃为基本结构；雄激素类是以19个碳原子雄烃为基本结构；孕激素类是以21个碳原子雄烃为基本结构。同化激素一般是白色结晶或粉末，不溶于水，易溶于乙醚、乙醇、丙酮、三氯甲烷等有机溶剂。激素残留对人体健康的危害是：扰乱激素平衡、导致内分泌相关肿瘤、出生缺陷、生育缺陷、性早熟、男性女性化，诱发女性乳腺癌、卵巢癌等疾病。中国、欧盟和日本将同化激素列为所有食品动物禁用物质。检验方法有荧光分析法、GC、HPLC和GC-MS等。二、HPLC法测定蓄禽肉中己烯雌酚残留1.原理用甲醇提取分析物，高效液相色谱仪测定，于波长230nm处测定吸光度，同样条件下绘制工作曲线，采用工作曲线法定量。2.样品处理准确称取适量绞碎肉样，加甲醇充分搅拌，振荡提取，离心，移出上清液，重复提取2次，合并上清液，