动物细胞制药的培养需求

基因工程动物细胞培养制药工艺

药用蛋白质的合成复杂，要有精确折叠的空间结构，要有糖基化，才能使药物发挥真正的功能。细菌和酵母等产品要么是包涵体，要么难以糖基化功能修饰。动物细胞的培养技术来生产有功能的蛋白质，大规模动物细胞特别是人源细胞的培养在药物生产中的位置会越来越重要。人畜病毒疫苗:口蹄疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病和脊髓灰质炎、乙肝疫苗。干扰素、单克隆抗体、重组基因工程产品。组织型血纤蛋白溶酶原激活剂、免疫珠蛋白G、M、尿激酶、人生长因子等。第一节动物细胞制药的表达系统与特征

昆虫系统、哺乳动物细胞系统，最成功、重要表达活性外源蛋白的有效系统，应用于药物蛋白质的表达。

一、哺乳动物细胞表达系统与特征1.动物细胞的特征细胞膜、细胞质和细胞核没有细胞壁。亚细胞器，功能独特。2.动物细胞代谢动物细胞的不同代谢途径及其相应的酶体系定位于特定的亚细胞区域。通过胞内运输（囊泡包裹）实现区域之间的物质、信息和能量流动，通过穿梭实现不同代谢途径之间的交换。在动物细胞培养中，葡萄糖和谷氨酰胺提供能量并作为合成代谢的前体，因此动物细胞的培养具有一定的灵活性。葡萄糖受限可增加谷氨酰胺的消耗得以补偿，反之亦然。谷氨酰胺是动物细胞的氮源，谷氨酰胺受限时，可增加其他氨基酸的消耗得以补偿。糖代谢特点：动物细胞吸收葡萄糖后，进行糖酵解，大部分葡萄糖分解为丙酮酸，进一步被还原为乳酸，乳酸分泌到胞外并在培养液中积累。丙酮酸还可转化为乙酰辅酶A，进入三羧酸循环，彻底氧化产生CO2和水。小部分（4％～8％）葡萄糖进入戊糖磷酸途径，把葡萄糖转化为4、5、7碳糖和还原力NADPH，5碳糖用于核酸合成，其他中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。葡萄糖代谢旺盛，会产生大量的乳酸，对细胞产生毒性。

氨基酸代谢特点：吸收谷氨酰胺后，进入氨基酸代谢途径，通过脱氨、转氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。大多数谷氨酰胺在脱氨酶催化下，生成谷氨酸，并释放氨，对细胞产生毒性。小部分谷氨酰胺通过转氨生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖等合成代谢的前体。谷氨酸还原酶把谷氨酸转化为中间产物α-酮戊二酸，进入三羧酸循环，为细胞提供能量。所以谷氨酰胺在细胞能量代谢中具有重要作用。谷氨酰胺与丙酮酸和草酰乙酸发生转氨作用，生成丙氨酸和天门冬氨酸，丙氨酸可进入培养液并积累。在快速生长的动物细胞培养体系，转氨作用是主要的代谢途径。

不同的培养条件，葡萄糖和谷氨酰胺代谢重叠于丙酮酸。在正常细胞系中，丙酮酸羧化产生草酰乙酸，而草酰乙酸来源于谷氨酰胺。在连续细胞系中，没有这种流动。能量是以ATP和NADPH的形式提供，来源于葡萄糖和谷氨酰氨，但二种细胞系对各个代谢途径的贡献和所起的作用不同。常流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，避免有毒废物积累。

3.蛋白质糖基化蛋白质合成是以mRNA为模板，在核糖体上完成。而蛋白质的糖基化无需模板指导，因此糖蛋白的寡糖结构容易发生变化。糖蛋白的单糖单元:α-D-葡萄糖、α-D-半乳糖、α-D-甘露糖、α-D-木糖、α-D-岩藻糖、N-乙酰-α-D-葡萄糖胺、N-乙酰-α-D-半乳糖胺和α-N-乙酰神经氨酸（或唾液酸）。糖基化类型：寡糖基以共价键与蛋白质的氮原子结合为N-糖基化，或与氧原子结合为O-糖基化。这两种糖基化的位点和数量及糖的种类都不同。N-糖基化：聚糖部分连接在天门冬酰胺的氨基上，其模体的保守序列为Asn-X-Thr/Ser(X为除脯氨酸以外的任意氨基酸)。如果X为Trp、Asp、Glu和Leu，对糖基化有负影响，而第三位Thr能增强糖基化。N-糖基化分为高甘露糖型、复合型和杂合型三种类型，共同核心是3个甘露糖和2个N-乙酰葡萄糖胺组成的5糖（Man3GluNAc2），其他糖形成支链。高甘露糖型的支链为甘露聚糖（5～9聚体），无其他糖。复合型含有2个以上支链，如乙酰半乳糖胺、果糖和唾液酸等。杂合型至少含有一条复合糖链，另一个链含有甘露糖。O-聚糖连接在Thr/Ser的羟基上，还没有发现保守序列。O-聚糖有四种不同的核心结构，都含有N-乙酰半乳糖胺基，糖基化会影响蛋白质的局部构象。O-糖基化比较小，一般为1～6个寡聚糖，但比N-糖基化变化更大。O-糖基化只在高尔基体上进行，糖基单元有木糖、葡萄糖。糖基化磷脂酰肌醇锚着点：它在膜与蛋白质之间形成稳定的相互作用，都具有相同的核心结构：胆胺-PO4-Man2-GlcHN2-肌醇-PO4-脂。胆胺形成膜内蛋白的桥，而肌醇在膜内。在细胞培养生产重组蛋白时，磷脂酶C可切割此类蛋白，有利于纯化。细胞特特异性性糖基基化途途径———淋淋巴细细胞中中进行行，它它不依依赖于于内质质网和和高尔尔基体体。IgG的糖糖基化化，等等分GlcNAc残残基连连接在在核心心甘露露糖上上，该该糖基基化在在抗体体依赖赖性细细胞介介导的的细胞胞毒性性中起起重要要作用用。IgG蛋白白的铰铰链区区，富富含Ser、Thr和Pro，5个Ser全部部糖基基化。。促黄体体激素素、促促甲状状腺素素等的的硫酸酸化只只能在在垂体体中发发生。。尽管哺哺乳动动物细细胞具具有细细胞内内的糖糖基化化装置置，但但不同同细胞胞系，，糖基基化特特征不不同。。鼠和猪猪细胞胞倾向向于添添加乙乙酰果果糖而而不是是乙酰酰唾液液酸，，在鼠鼠杂交交瘤或或人鼠鼠杂交交瘤生生产的的抗体体中，，乙酰酰果糖糖占优优势。。CHO细胞不不能合合成等等分N-乙酰葡葡萄糖糖胺，，而鼠鼠细胞胞系却却能形形成半半乳糖糖末端端，对对人有有免疫疫原性性。要根据据糖基基化的的结构构，选选择适适宜的的细胞胞系。。细胞系FucGal唾液酸α1,6α1,3Fucα1,3GalSO4-GalNAcα2,3

α2,6糖基化等分GluNAcBHK++0+0++0-0CHO++-00++0+0鼠杂交瘤++0++0++0+++0C127++0+++++++++++0J558L++0++-+++++++0人淋巴细胞++000++0++人垂体++00+++++0++Namalwa++000++++--人鼠杂交瘤++000+++02.哺哺乳乳动物物细胞胞表达达系统统基因工工程哺哺乳动动物细细胞系系：失失去分分化能能力的的无限限生长长细胞胞系，，即永永久性性细胞胞。表表达的的蛋白白质能能正确确加工工、修修饰并并折叠叠形成成具有有生物物活性性的功功能分分子，，接近近或类类似天天然产产物。。糖基化化等修修饰是是糖蛋蛋白行行使功功能所所必需需的，，而且且对产产品质质量有有影响响，如如生物物活性性、稳稳定性性、免免疫原原性等等。原原核细细胞表表达的的EPO无无糖基基化，，在体体内表表现无无活性性。原原核表表达的的GM－CSF虽有有活性性，但但在体体内产产生抗抗体。。动物细细胞表表达产产物分分泌到到培养养液，，容易易分离离纯化化。约约有70％％批准准的蛋蛋白质质药物物由哺哺乳动动物细细胞系系统表表达制制造，，而且且数目目还在在不断断增加加。表达系统O-糖基化寡聚甘露糖高甘露糖复合体大肠杆菌0000酿酒酵母＋＋0＋＋＋＋－昆虫Sf9＋＋＋＋＋＋0－仓鼠CHO＋＋＋＋0＋＋仓鼠BHK＋＋＋＋0＋＋鼠杂交瘤＋＋＋＋0＋＋鼠骨髓瘤＋＋＋＋0＋＋C127＋＋＋＋0＋＋J558L＋＋－0＋＋人淋巴细胞＋＋00＋Namalwa＋＋＋＋0＋＋人鼠杂交瘤－＋＋0＋＋

大肠杆菌酵母哺乳动物细胞产物浓度高高低分子量低高高二硫键有限不受限制不受限制分泌无有或无有形式包涵体单链，天然单链，天然折叠不正确正确正确糖基化无可能完全逆转录病毒无无可能热原可能无无培养特点容易容易较难，成本高分离纯化复杂复杂简单细胞类型表达水平（μg/ml）猴CV11～10猴CV10.05猴COS1小鼠成纤维细胞C1271～5小鼠成纤维细胞3T30.1～0.5CHO（dhfr－）0.01~0.05CHO（dhfr－）10动物细细胞表表达系系统的的不足足是细细胞生生长缓缓慢，，生产产效率率较低低，产产量远远远落落后于于其他他表达达系统统。骨髓细细胞MPG－11生生产IgG的能能力为为5pg/(细细胞.分钟钟)，，10L反反应器器，密密度为为107/ml，生生产能能力不不到1g/d。。连续细细胞系系增加加了生生长和和代谢谢速率率，但但同时时导致致了副副产物物的增增加。。动物细细胞对对培养养条件件要求求苛刻刻和敏敏感，，对温温度、、pH、渗渗透压压、剪剪切力力等忍忍受能能力差差。培培养基基要求求高，，需要要添加加氨基基酸、、维生生素等等，往往往需需要附附加血血清，，提供供生长长因子子，费费用较较高。。同时时可能能有潜潜在的的致病病因子子、免免疫原原性存存在。。表达载载体的的改进进和宿宿主细细胞的的改造造是动动物细细胞表表达系系统的的研发发重要要内容容。3.昆昆虫细胞胞表达系系统与特特征表达载体体为昆虫虫病毒，，转染昆昆虫细胞胞，表达达出目标标蛋白质质。昆虫虫病毒主主要有杆杆状病毒毒科核多多角体病病毒。苜蓿尺蠖蠖核多角角体病毒毒－秋黏黏虫细胞胞表达系系统，家家蚕核多多角体病病毒－家家蚕幼虫虫表达系系统。Micro－GeneSys公司司表达艾艾滋病基基因工程程疫苗，，随后猪猪生长素素、CD4膜蛋蛋白及疟疟疾疫苗苗、鸡新新城病毒毒疫苗、、血吸虫虫GST疫苗、、乙肝表表面抗原原、重组组人GM－CSF等。。日本批批准用家家蚕系统统生产干干扰素已已上市。。生物试试剂盒的的标准品品大多用用昆虫表表达系统统生产。。至少有600多多种昆虫虫可以作作为宿主主，每年年有数百百个基因因利用昆昆虫系统统进行表表达，越越来越成成为非常常有用的的表达宿宿主。优点1）安全全：杆状状病毒无无致病性性，产品品安全性性受FDA认可可。2）易饲饲养：家家蚕丧失失了野外外生存能能力，饲饲养，发发育快，，3）高量量表达：：用强启启动子，，外源基基因可超超量表达达。表达达产物在在昆虫细细胞内能能结晶，，对产物物纯化非非常有意意义。4）高效效表达：：可容纳纳较大的的外源基基因（12kb），表表达数个个外源基基因，并并且正确确装配成成有功能能的分子子。如表表达抗体体的重链链和轻链链，自主主装配成成有功能能的抗体体。5）翻译译后的加加工：昆昆虫细胞胞能进行行一系列列翻译后后的加工工，包括括糖基化化、脂肪肪酸酰基基化、磷磷酸化、、氨基酸酸的乙酰酰化、氨氨酰化等等，大部部分产物物显示出出良好的的活性。。缺点：1）重组率率低，筛筛选困难难，周期期长，需需要4－10天。2）外源基基因的表表达在转转染的晚晚期，大大约在20h后起始基基因表达达，在72－94h细胞裂解解死亡，，基因表表达时间间约30－50h，高水平平表达不不连续且且时间短短，这对对表达不不利。3）昆虫细细胞糖基基化等加加工途径径与哺乳乳动物细细胞不完完全相同同，它不不提供复复杂的N糖基化，，如添加加半乳糖糖和唾液液酸残基基，有可可能造成成溶解性性、稳定定性、免免疫性等等变化。。表达水水平非常常高，加加工装备备跟不上上，蛋白白质修饰饰效率可可能不高高。研究开发发的主要要方向：：有效的的病毒表表达载体体；决定基因因表达时时期启动动子，无无血清培培养昆虫虫细胞系系。第二节基基因工工程动物物细胞系系的构建建构建高效效表达载载体转染动物物细胞筛选鉴定定获得生产产用工程程化细胞胞系动物细胞胞的表达达载体：：病毒载载体，质质粒载体体。病毒载体体：逆转录病病毒、腺腺病毒、、痘苗病病毒、杆杆状病毒毒等载体体，对原原始病毒毒改造而而来。同源重组组构建腺腺病毒载载体，在在静止期期转染细细胞，表表达时间间较长。。痘病毒载载体可插插入25～40kb外源基因因，甚至至是多个个基因。。无感染染性和致致癌性，，可用于于构建基基因工程程疫苗。。美国Genentech公司已用用SV40载体生产产乙肝疫疫苗，其其他载体体可用于于基因治治疗。质粒载体体：微生物的的质粒载载体类似似，一般般是穿梭梭质粒，，具有两两个复制制子和抗抗性筛选选标记基基因。大肠杆菌菌的复制制子，细细菌中繁繁殖。抗生素抗抗性标记记，原核核细胞筛筛选。动物细胞胞的复制制子，在宿主细细胞中稳稳定表达达。还有丝状状噬菌体体复制子子。启动子序序列：含含有RNA聚合合酶识别别和结合合位点，，以便有有效转录录。TATA盒盒，确定定起始位位置；GG盒，，影响转转录频率率。来源于病病毒、动动物基因因和噬菌菌体的启启动子。。动物病毒毒启动子子：逆转转录病毒毒的长末末端重复复序列（（LTRS）、、SV40病毒毒的早期期和晚期期启动子子、腺病病毒的晚晚期启动动子、人人巨噬病病毒（CMV））立即早早期基因因启动子子。动物基因因的启动动子：转转录因子子EF-1α启启动子、、泛素蛋蛋白启动动子、ββ-肌动动蛋白启启动子、、干扰素素-α启启动子、、IgG启动子子、鼠金金属硫蛋蛋白基因因启动子子等。噬菌体T7启动动子比动动物基因因启动子子表达水水平高。。PolyA信号号序列：：保持mRNA的稳定定性，防防止降解解，保证证了转录录产物的的加工和和正确性性，但序序列不宜宜太长，，避免能能量过度度消耗。。添加PolyA信号号和5′′端转录录暂停位位点，可可以减少少上游序序列转录录通读造造成的背背景。牛生长素素（BGH）基基因的PolyA信号号比SV40PolyA更更强，常常用于高高效表达达载体中中。终止序列列：AAUAAA或连连续的终终止密码码UGA、UAA和UAG，，能防止止转录通通读，使使转录在在正确的的位点结结束。在转录起起始点上上游或下下游使用用相同类类型的增增强子，，有利于于提高外外源基因因的转录录水平。。双顺反子子表达载载体：两个基因因在同一一启动子子控制之之下，内内部核糖糖体进入入位点使使同一mRNA中的第二二个基因因得到翻翻译。将将dhfr与目标基基因串连连，dhfr的cDNA插入内含含子中，，其转录录产物被被剪切，，翻译不不出蛋白白质，而而目标基基因的转转录产物物得到翻翻译。顺反子在在多亚基基蛋白的的偶联表表达及其其控制策策略等方方面有广广泛应用用前景。。使筛选容容易，而而且能高高效表达达。选择适宜宜的启动动子，可可实现定定向表达达。CMV启启动子和和人EF-1αα启动子子，可实实现同一一载体上上的二个个基因的的独立表表达。组织特异异性启动动子：如如鼠、山山羊酪蛋蛋白启动动子，可可使基因因主要在在乳腺中中表达。。N端设计计分泌信信号肽：：如Igκ链链的可变变区和恒恒定区之之间序列列，使外外源基因因的表达达产物向向胞外分分泌。C端设计计跨膜锚锚定序列列：可使使外源蛋蛋白展示示在细胞胞表面。。亚细胞定定位信号号肽：目目标基因因产物将将转运到到细胞核核、线粒粒体、内内质网或或细胞质质中，这这对基因因的功能能研究非非常合适适。基因的扩扩增系统统：在逐渐提提高选择择压的情情况下，，使选择择标记基基因拷贝贝数增加加，并可可连带其其两侧序序列一起起扩增，，从而提提高表达达基因水水平。最常用二二氢叶酸酸二氢叶叶酸还原原酶（DHFR）基因系系统和谷谷氨酰氨氨合成酶酶（GS）基因系系统。氨甲喋呤呤基因与与目标基基因重组组，氨甲甲喋呤使使dhfr基因与目标基基因大量增加加，达到数千千拷贝。硫胺蛋氨酸使使GS系统的基因得得到大量扩增增。二、受体细胞胞1．人源细胞胞株系Namalwa：类淋巴巴母细胞，非非整体核型。。表达IgM，悬浮生长长。外源基因因的表达水平平较高，可用用无血清培养养基高密度培培养，已成功功地表达了rhEPO、、rhG-CSF、tPA等。英国国Wellcome公司司用Namalwa细胞胞的反应器达达8000L，用Sendai病毒毒诱导，大规规模生产α干干扰素，并批批准上市。WI-38：：二倍体成纤纤维细胞系，，2n=46，第一个被被用于制备疫疫苗。贴壁生生长，对很多多病毒敏感，，广泛用于疫疫苗生产。MRC-5：：二倍体成纤纤维细胞系，，但生长较WI-38快快，对逆境有有一定抗性也也用于制备疫疫苗。2．哺乳动物物细胞株系CHO细胞：：中国仓鼠卵卵巢中分离的的上皮样细胞胞系，贴壁型型生长，是目目前使用最为为普遍和成熟熟的表达糖基基化蛋白药物物的宿主细胞胞。核型为亚亚二倍体，分分泌表达外源源蛋白，而内内源蛋白分泌泌很少。贴壁壁型生长细胞胞，但可进行行悬浮培养，，对剪切力和和渗透压有较较高的忍受能能力。蛋白质质翻译后的修修饰准确，表表达产物的结结构、性质和和生物活性接接近天然。有多种衍生突突变株应用于于药物的生产产，培养时需需要添加脯氨氨酸。二氢叶叶酸还原酶缺缺陷株表达的的药物有tPA、EPO、HBsAg疫苗、G-CSF、、凝血因子ⅧⅧ、DNA酶酶Ⅰ，已上市市。使用氨甲酰喋喋呤，增加外外源基因的拷拷贝数，提高高蛋白质表达达水平。BHK－21：幼仓鼠肾肾脏中分离的的成纤维样细细胞，非整倍倍体。用于增增殖病毒、制制备疫苗和重重组蛋白。BHK-21表达的重组组凝血因子ⅧⅧ已被获准上上市。C127：从从小鼠乳腺肿肿瘤中分离获获得的上皮样样细胞，贴壁壁型生长。C127细胞胞系已表达多多种外源基因因，其中EPO的水平达达10mg/L，生产产rhGH已已被批准上市市。3T3：HINSwiss小鼠胚胎培养养物中分离建建立的连续细细胞系，能大大量表达外源源蛋白，广泛泛用于药物毒毒理学研究。。骨髓瘤细胞：：J558L是小鼠BALB/c骨髓瘤细胞，，分泌IgA，用于转染研研究。NSO和SP2/O－Ag14不分泌Ig，与淋巴细胞胞融合筛选杂杂交瘤，分泌泌制备特异性性抗体。杂交瘤细胞：：从小鼠脾细细胞与骨髓瘤瘤细胞的融合合细胞中分离离获得杂交瘤瘤细胞系，能能在无血清培培养基中高密密度悬浮生长长，容易转染染和生长，能能进行糖基化化等加工修饰饰，大量分泌泌和高效表达达。很多杂交交瘤细胞系用用于抗体的制制备。Vero：从从成年非洲绿绿猴肾中分离离获得的贴壁壁型成纤维细细胞，多倍体体核型，能适适应灌流操作作，进行连续续培养。已有有突变细胞系系能用无血清清培养。最为为常用VeroE6增增殖多种病毒毒，如脊髓灰灰质炎、狂犬犬病毒、乙脑脑病毒等，生生产病毒性疫疫苗，已被批批准用于人体体。也可作为为转染的宿主主细胞，用于于表达外源基基因的蛋白质质药物和病毒毒的检测。COS：是从SV40DNA转化的非洲绿绿猴肾细胞CV1中分离得到的的，广泛用于于外源基因瞬瞬时表达的研研究。GH3用于生生长激素研究究，293细细胞系用于基基因治疗的研研究。3．昆虫细胞胞株系Sf21：从从秋粘虫卵巢巢细胞中分离离得到，细胞胞较大，容易易放大，高效效表达外源基基因。Sf9：从秋秋粘虫的卵巢巢细胞（SF21）中分分离得到，是是最常用的昆昆虫表达细胞胞。对杆状病病毒高度敏感感，生长快，，能高效表达达外源基因。。抗机械剪切切，能在无血血清培养基的的搅拌反应器器中生长。TN-5B1-4：从粉粉纹夜蛾卵细细胞匀浆中分分离得到，无无血清培养，，快速倍增。。分泌表达重重组蛋白的能能力比Sf9细胞系高20多倍，能能适应悬浮培培养。三、细胞转染染转染（是将外外源基因导入入哺乳动物细细胞的技术通通用名称。基基因导入真核核细胞的方法法很多，主要要有化学转染染、物理转染染和病毒介导导的转化。方法表达类型毒性细胞类型特点基因枪瞬时，稳定无多种细胞组织，器官有效，仪器操作显微注射瞬时，稳定无多种细胞有效，技术难度大电穿孔瞬时，稳定无多种细胞有效，仪器操作冲击波瞬时，稳定无多种细胞，局部组织简单有效，仪器操作方法表达类型毒性细胞类型特点逆转录病毒瞬时，稳定无对应的宿主细胞有效原生质体融合瞬时，稳定无悬浮细胞技术复杂生物转染特点点化学转染是最最常用的转染染方法。其基本原理是是磷酸钙、二二乙氨乙基（（DEAE）－葡聚糖（（dextran）和阳离子树树脂与核酸形形成复合物，，附着于细胞胞表面，通过过细胞的内吞吞作用进入细细胞。磷酸钙与DNA形成不溶性沉沉淀，带正电电荷的DEAE－葡聚糖与带带负电荷的DNA磷酸基团结合合，阳离子树树脂包裹DNA形成脂质体。。渗透性休克和和DMSO等化学试剂能能促进DNA进入细胞。转转染试剂盒商商业化供应，，特别是脂质质体材料的转转染试剂。影响因素：细细胞培养物的的密度、DNA的大小、纯度度与用量、化化学试剂的用用量与处理时时间、促进剂剂的使用等。。方法表达类型毒性细胞类型特点磷酸钙瞬时、稳定无贴壁细胞，悬浮细胞简单DEAE-葡聚糖瞬时有CV1，COS简单阳离子树脂瞬时、稳定有或无贴壁、原代悬浮细胞简单，有效化学转染的特特点四、转染体筛筛选与分离转染后1～6天收获细胞胞，进行核酸酸分子杂交或或蛋白质杂交交，检测外源源基因的瞬时时表达。为了获得稳定定整合的细胞胞系，先在非非选择性培养养基上培养24～48小小时，让细胞胞倍增1～2代，使转染染DNA表达达。再按1：：15比例转转移到选择性性培养基上，，每2～4天天更换培养基基，持续2～～3周，促进进抗性细胞生生长，清除死死细胞残骸，，最后得到独独立的克隆。。在转染中大约约有万分之一一的细胞将稳稳定整合外源源基因，因此此需要显性选选择标记来分分离转染细胞胞。哺乳动物细胞胞的选择标记记，使用与之之相对应的选选择剂。选择剂基因使用浓度氨甲喋呤dhfr－0.01～300μmol/L氨喋呤tk＋0.4μmol/L5-溴脱氧尿苷tk－30μg/mlG418,Zeocinneo100～800μg/ml潮霉素Bhyg10～400μg/ml杀瘟稻菌素bsd2～10μg/ml霉酚酸gpt25μg/ml嘌呤霉素乙酰基转移酶0.5～10μg/mlXyl-Aada4μmol/L报告基因特点使用与分析方法cat内源活性低，蛋白稳定，线性范围窄，体外，荧光或免疫分析lacZ有内源活性，X-gal染色，线性范围宽体内外，染色，比色、化学发光或荧光分析碱性磷酸酶分泌型，线性范围宽，受到细胞类型限制体外，比色、化学发光或荧光分析gus蛋白质稳定，线性范围宽，X-Gluc染色体内外，染色，比色、化学发光或荧光分析gfp无内源活性，分子量小，稳定，无需底物，紫外线激发体内外，荧光分析第三节动物物细胞培养的的需求与培养养基的制备动物细胞离体体后，失去了了消化等系统统，不能利用用多糖、蛋白白质等聚合程程度高的化合合物。只能利用简单单的单体化合合物如单糖、、氨基酸等，，为了维持细细胞正常生长长，还必须添添加维生素、、无机盐类、、生长类因子子及激素、结结合蛋白质、、贴附与伸展展因子及其它它附加成分等等。动物细胞对培培养环境的要要求高，不同同细胞系的要要求也不尽相相同，培养基基要尽可能与与体内生活条条件接近。一、动物细胞胞培养的营养养需求1.糖类糖类是细胞主主要的营养物物质，分解后后释放出能量量ATP。培养基中都必必须添加葡萄萄糖，有时添添加核糖等。。提高细胞生长长的碳源和能能源，主要是是葡萄糖和谷谷氨酰胺。2.氨基酸酸氨基酸是蛋白白质和酶的组组成单位。氨氨基酸还参与与合成一些含含氮化合物，，核苷酸的四四种嘌呤和嘧嘧啶碱基、儿儿茶酚胺等含含氮激素及神神经递质等。。氨基酸可通通过生糖或生生酮途径转变变为糖或脂肪肪酸，间接提提供能量。动物细胞：8－10种必必须氨基酸。。离体容易失去去，20种氨氨基酸中至少少12种是必必需氨基酸：：精氨酸、半胱胱氨酸、组氨氨酸、异亮氨氨酸、亮氨酸酸、赖氨酸、、蛋氨酸、苯苯丙氨酸、苏苏氨酸、色氨氨酸、酪氨酸酸、缬氨酸等等。谷氨酰胺还可可作为重要的的碳源和能源源而被利用。。3.维生素素维生素是一类类微量的小分分子有机生物物活性物质，，对代谢和生生长起调节和和控制作用。。水溶性维生素素包括B族维维生素和维生生素C。B族族维生素以辅辅酶或辅基形形式参与酶反反应，主要调调节酶活性和和代谢活性。。维生素C，，抗坏血酸，，在体内参与与还原反应、、羟化反应，，促进胶原蛋蛋白合成和粘粘多糖合成，，抗氧化作用用。脂溶性维生素素包括维生素素A、D、E、K四种。。维生素A维持持正常视觉和和上皮组织。。维生素D为为视固醇类化化合物，主要要是调节钙磷磷代谢。维生生素E即生育育酚，是抗氧氧化剂，防止止生物膜中磷磷脂的不饱和和脂肪酸被氧氧化。维生素素K，促进合合成凝血酶原原，促进血液液凝固。5.无机盐盐类无机盐是细胞胞代谢所需的的酶的辅基，，同时保持细细胞的渗透压压和缓冲pH的变化。Na＋和Cl－参与生理电活活动，维持水水平衡、保持持渗透压和酸酸碱平衡。离离体培养为细细胞提供足够够的Na和Cl离子是基基本条件，一一般生理盐水水的离子浓度度（0.9%NaCl）。Ca2＋、Mg2＋，对细胞间的的互黏稳定起起重要作用。。在离体培养养时，螯合细细胞间的Ca2＋和Mg2＋，可以达到分分散细胞的目目的。磷是核酸、磷磷脂等的组成成成分。碳酸盐缓冲液液是重要的体体内缓冲体系系，与K＋、Cl－等在维持酸碱碱平衡具有重重要作用。6.生长类类因子及激素素细胞之间是相相互联系的，，而非孤立的的。特别是高高度分化功能能的动物细胞胞更是如此。。细胞离体生长长时，必要添添加激素与细细胞生长因子子等。胰岛素素是最常用的的激素，促进进糖原和脂肪肪酸的合成，，对细胞的生生长有刺激作作用。其它激激素有促卵泡泡激素、甲状状腺素、乳激激素、生育酚酚等。细胞因子有表表皮生长因子子、成纤维细细胞生长因子子和神经细胞胞生长因子，，根据不同细细胞添加。为了细胞的贴贴壁生长，必必需添加贴附附因子，纤维维结合蛋白、、胶原等，伸伸展因子如表表皮生长因子子、成纤维细细胞因子等。。二、动物细胞胞培养的环境境需求1.水与渗渗透压细胞生长离不不开水，水是是细胞反应的的重要介质。。1）水是一一种良好的溶溶媒，营养物物质在水中被被吸收，废物物在水中被排排泄。2）具具有热稳定性性和导热性，，调节稳定温温度。正常常血血浆浆渗渗透透压压主主要要是是无无机机盐盐Na＋、K＋、Cl－、HCO3－等构构成成，，蛋蛋白白质质构构成成胶胶体体渗渗透透压压较较小小。。动物物细细胞胞对对渗渗透透压压有有较较强强的的耐耐受受性性，，常常用用增增减减NaCl的的浓浓度度调调整整渗渗透透压压，，每每增增加加1mg/mlNaCl，，渗渗透透压压增增加加32mOsm/kg。。离体体培培养养细细胞胞的的渗渗透透压压应应控控制制为为等等渗渗透透溶溶液液。。2.温温度度不同同种种类类的的动动物物细细胞胞对对温温度度的的要要求求是是不不同同的的，，变变温温动动物物对对温温度度要要求求没没有有恒恒温温动动物物严严格格。。哺乳乳动动物物细细胞胞最最佳佳培培养养温温度度为为37℃，，鸡鸡细细胞胞为为39－－40℃℃，，而而昆昆虫虫类类细细胞胞为为25－－28℃℃。。在培培养养过过程程中中，，根根据据细细胞胞种种类类选选择择确确定定适适宜宜的的培培养养温温度度。。哺乳乳动动物物细细胞胞的的耐耐受受温温度度范范围围较较窄窄，，在在35-37℃内内能能正正常常进进行行代代谢谢和和生生长长，，超超出出范范围围会会引引起起细细胞胞伤伤害害甚甚至至死死亡亡。。细胞胞对对低低温温的的耐耐受受性性比比高高温温要要强强，，低低温温抑抑制制生生长长，，但但无无伤伤害害作作用用，，在在冰冰点点温温度度附附近近仍仍能能存存活活。。3.氧氧气气动物物细细胞胞生生长长必必须须有有氧氧气气，，无无氧氧下下，，能能获获得得能能量量供供应应，，但但细细胞胞缺缺氧氧时时不不能能生生存存。。离离体体培培养养的的气气体体含含有有5％％CO2和95％％空空气气，，其其中中氧氧浓浓度度为为21％％。。有有时时充充以以N2气稀稀释释O2浓度度。。O2浓度度在在60%以以上上为为高高氧氧环环境境，，对对细细胞胞毒毒性性较较大大。。4.pH值值动物物细细胞胞对对pH值值很很敏敏感感，，低低于于6.8或或超超过过7.6会会产产生生严严重重影影响响。。机机体体细细胞胞的的pH范范围围为为6－－8，，血血液液和和体体液液中中，，变变化化范范围围很很小小。。人人血血液液pH维维持持7.36-7.44。。pH低低于于7.05会会发发生生酸酸中中毒毒，，高高于于7.45发发生生碱碱中中毒毒。。细细胞胞代代谢谢产产生生CO2，使使培培养养液液变变酸酸，，pH发发生生波波动动。。合合成成培培养养基基偏偏酸酸性性，，为为了了稳稳定定pH，，可可用用缓缓冲冲体体系系配配制制。。在在开开放放体体系系中中，，CO2逸出出，，使使培培养养基基变变碱碱。。通通入入5％％CO2，可可维维持持在在pH7.2-7.4范范围围内内。。5.生生长长基基质质改变变生生长长表表面面特特性性，，促促进进细细胞胞贴贴附附的的物物质质。。贴附附细细胞胞生生长长需需要要一一个个支支持持介介质质，，采采用用在在培培养养液液中中添添加加或或在在器器皿皿表表面面覆覆盖盖生生长长基基质质，，帮帮助助细细胞胞的的贴贴附附和和生生长长。。生长长基基质质为为胞胞外外基基质质成成分分，，多多聚聚赖赖氨氨酸酸、、纤纤维维连连接接蛋蛋白白、、胶胶原原、、层层黏黏蛋蛋白白、、韧韧黏黏素素等等。。生长基基质已已有商商业化化产品品，用PBS或或BBS配配成10倍倍贮存存液，，在37℃下包包被，，静置置2－－4小小时或或室温温过夜夜，对对器皿皿表面面进行行包被被，然然后无无菌生生理盐盐水洗洗涤后后使用用。有有些还还可以以直接接加入入培养养液。。生长基质贮存液浓度使用浓度使用方法多聚赖氨酸0.5mg/L0.05mg/L表面包被纤维连接蛋白10mg/ml1mg/ml加入培养液层粘蛋白

5～10μg/ml表面包被韧粘素75μg/ml5～15μg/ml包被或加入培养液胶原蛋白1～3mg/ml0.1mg/ml表面包被6．抗抗生素素动物细细胞培培养过过程中中，由由于培培养基基营养养丰富富，很很容易易被微微生物物污染染。虽虽然对对使用用抗生生素仍仍存在在质疑疑，但但还是是常添添加抗抗生素素，以以避免免轻度度污染染。抗生素素使用用浓度度差别别很大大，一一般范范围为为50～100μμg/ml。在在大规规模生生产中中，除除了青青霉素素和ββ-内内酰胺胺类抗抗生素素外，，其它它抗生生素可可以使使用。。抗生素素使用用对细细胞会会产生生毒性性，而而且使使实验验室保保留抗抗药性性微生生物，，应加加以注注意和和克服服。抗生素作用对象工作浓度（μg/ml）稳定性（天）两性霉素B真菌1～2.53制霉菌素真菌503氨苄青霉素G＋、G－细菌1003红霉素G＋细菌，支原体1003四环素G＋、G－细菌，支原体104庆大霉素G＋、G－细菌，支原体505利福平G＋、G－细菌503卡那霉素G＋、G－细菌1005链霉素G＋、G－细菌1003氯霉素G－细菌55青霉素GG＋细菌1003三、动动物细细胞培培养基基的种种类与与组成成动物细细胞对对培养养基的的要求求高，，不同同细胞胞系的的要求求也不不尽相相同，，因此此培养养基成成分复复杂而而且昂昂贵。。但是是要尽尽可能能提供供与体体内生生活条条件接接近的的培养养环境境。主主要组组成成成分如如下：：糖类、、必需需氨基基酸、、维生生素、、无机机盐类类、生生长类类因子子及激激素、、结合合蛋白白质、、贴附附与伸伸展因因子及及其它它附加加成分分等。。不同细细胞对对葡萄萄糖利利用相相似，，但对对氨基基酸的的利用用相差差很大大，不不同的的细胞胞过程程对氨氨基酸酸的需需求存存在差差别。。目前前停留留在流流加谷谷氨酰酰胺上上。血清：：蛋白白质、、氨基基酸、、葡萄萄糖、、激素素和生生长因因子等等。胎胎牛血血清、、新生生牛或或成牛牛血清清、马马血清清、鸡鸡血清清、羊羊血清清及人人血清清，最最广泛泛应用用的为为胎牛牛血清清和新新生牛牛血清清。水水解乳乳蛋白白和胶胶原富富含氨氨基酸酸。血血清和和水解解酪蛋蛋白应应用于于许多多细胞胞系和和原代代及传传代细细胞培培养。。脂类化化合物物对动动物细细胞培培养是是必需需的，，实际际中类类脂及及其前前体和和血清清常平平行使使用。。添加加的蛋蛋白质质试剂剂主要要有铁铁传递递蛋白白，起起离子子载体体的作作用，，有时时用无无机铁铁盐代代替。。胰岛岛素起起生长长素的的作用用，白白蛋白白起保保护剂剂作用用。其其他附附加成成分如如核苷苷类及及丙酮酮酸盐盐等是是培养养基的的必需需成分分，有有助于于细胞胞克隆隆和特特异化化细胞胞的培培养。。动物细细胞培培养过过程中中，被被微生生物污污染。。常添添加抗抗生素素，以以避免免轻度度污染染。1.天天然然培养养基直接取取自于于动物物组织织提取取液或或体液液作为为培养养基，，如血血浆凝凝块、、血清清、淋淋巴液液、胚胚胎浸浸出液液等。。营养养价值值高，，成分分复杂杂，不不稳定定，来来源受受到限限制，，不宜宜大量量培养养和生生产使使用。。2.合合成成培养养基合成培培养基基用化化学成成分明明确的的试剂剂配制制的培培养基基，组组分稳稳定。。现在在已有有几十十种合合成培培养基基，大大部分分已商商品化化。组成：：无机机盐、、糖、、氨基基酸、、维生生素及及其他他成分分。由于细细胞种种类和和培养养条件件不同同，所所用合合成培培养基基也不不同，，在动动物细细胞培培养中中最常常用培培养基基有7－8种。。3.无无血血清培培养基基无血清清培养养基是是全部部用已已知成成分组组配的的、不不加血血清的的合成成培养养基。。在含含有营营养和和贴壁壁因子子的基基础培培养基基中，，加入入适宜宜的细细胞生生长因因子，，细胞胞良好好生长长，适适合于于制药药生产产。无血清清培养养基提提高了了培养养的质质量，，避免免了使使用血血清带带来的的麻烦烦，产产品纯纯化容容易，，组分分稳定定，可可大量量配制制。无血清清培养养基通通常需需要添添加激激素与与生长长因子子、结结合蛋蛋白、、贴壁壁与伸伸展因因子、、低分分子营营养成成分等等。大多数数无血血清培培养基基含有有蛋白白质和和激素素等大大分子子物质质，适适宜于于多种种细胞胞系的的培养养。对对于大大规模模生产产用的的无血血清培培养基基，往往往成成分不不完全全清楚楚，但但简单单而且且低成成本。。四、培培养基基的控控制1.培培养养用水水质细胞培培养水水质最最低要要求电电导率率在1X106Ωcm以以上。。水存存放时时间不不宜超超过2周。。对于于制药药，必必需使使用纯纯净水水配制制培养养基，，普通通水必必需除除去各各类元元素有有毒或或有害害物质质及微微生物物，还还必需需除热热源，，达到到纯净净水标标准。。2.缓缓冲冲液缓冲液液：弱弱酸与与弱酸酸盐或或弱碱碱与弱弱碱盐盐组成成的，，pH恒定定但不不干扰扰试验验。不不同种种类细细胞对对pH要要求不不一致致，不不同生生长阶阶段对对pH要求求也不不同。。原代代细胞胞pH要求求严格格，而而传代代细胞胞要求求较宽宽。细细胞培培养过过程中中代谢谢产生生酸性性物质质，使使培养养基的的pH不断断下降降。缓缓冲液液中和和培养养液中中的酸酸性物物质。。最广泛泛使用用为碳碳酸氢氢钠/碳酸酸,其其次为为磷酸酸二氢氢钠/磷酸酸氢二二钠，，调节节二者者的比比例，，配制制成不不同pH缓缓冲液液。碳酸盐缓缓冲液除除了直接接的缓冲冲作用外外，还有有间接作作用，碳碳酸生成成挥发性性CO2后很快逸逸出。细细胞呼吸吸产生的的CO2与水形成成碳酸，，任何碱碱在培养养液中都都被中和和，生产产相应碳碳酸氢盐盐其他缓冲冲液:Tricine-Glycine、、MOPS、、TES、HEPES、、DIPSO、、HEPPSO等等等有机机缓冲液液，缓冲冲能力强强。Tris所所含氨基基具有高高的化学学反应活活性，能能抑制细细胞生长长，并通通过生物物膜，它它调节pH要依依赖于温温度的变变化，因因此不宜宜作为培培养液。。离体培培养中，，缓冲液液多为平平衡盐溶溶液的重重要组分分之一，，很少单单纯使用用。3.生生理盐水水与平衡衡盐溶液液在缓冲液液的基础础上，添添加调节节渗透压压的盐类类，在一一定程度度上能满满足细胞胞对pH和盐离离子要求求。缓冲液或或缓冲盐盐溶液用用于:配配制溶液液,处处理细胞胞的溶液液。对于于直接接接触、长长期培养养的培养养液，常常用生理理盐水和和平衡盐盐溶液，，是渗透透压与胞胞浆渗透透压平衡衡的溶液液。生理盐水水供给细细胞水分分和各种种离子，，维持一一定渗透透压，并并能良好好溶解试试剂和药药物。有有各种不不同成分分的生理理盐水，，分别加加入pH缓冲剂剂与指示示剂、葡葡萄糖，，形成平平衡盐溶溶液。平衡盐溶溶液：集集缓冲液液的缓冲冲能力、、生理盐盐水的等等渗能力力、营养养供给为为一体，，具有多多种功能能和作用用。BSS配配制：1）先分分别溶解解CaCl2、MgCl2、MgSO4。2）在另另一容器器中依次次溶解其其他试剂剂。3）在另另一容器器中用5.6%NaHCO3数滴溶解解酚红。。4）将含含Ca2+、Mg2+溶液缓慢慢倒入步步骤2配配制的溶溶液中，，搅拌，，防止沉沉淀。5）再加加入酚红红溶液。。6）补足足水，并并用NaHCO3调节pH。含葡萄糖糖的BSS过滤滤除菌，，不含葡葡萄糖时时常规高高压灭菌菌。小量量培养液液可置4度保存存。一旦旦出现沉沉淀，要要重新配配制。注意事项项：细胞只利利用L型型氨基酸酸，不能能利用D型，对对于DL混合型型氨基酸酸，使用用量应该该加倍。。谷氨酰胺胺溶液中中很不稳稳定，要要单独配配制成浓浓缩液。。NaHCO3一般配成成3.7％、5.6%、7.4%三三种浓度度，过滤滤除菌或或高压灭灭菌，4度保存存，使用用前加入入，调节节培养基基pH。。为了优化化细胞生生长环境境，还添添加其他他成分，，如嘌呤呤和嘧啶啶类，维维生素C、谷胱胱甘肽、、巯基乙乙醇。一般情况况下，培培养基成成分如氨氨基酸、、维生素素、葡萄萄糖、缓缓冲液等等、补充充因子几几类，先先配制成成高倍浓浓缩的母母液，过过滤灭菌菌，冷藏藏。使用用时按一一定比例例稀释，，配制成成工作液液。第二节动动物细细胞增殖殖生长的的动力学学过程一、单细细胞生长长增殖周周期从一个细细胞分裂裂形成两两个新细细胞的过过程为一一个细胞胞周期或或一个细细胞世代代。单个个细胞周周期包括括细胞间间期、细细胞分裂裂期，间间期又包包括间期期1、DNA合合成期和和间期2三个时时期。不同的细细胞类型型其分裂裂周期及及各期的的时间都都不同，，培养条条件及培培养基成成分也会会影响细细胞周期期,一般地动动物细胞胞分裂周周期为12－48小时,典型的细细胞周期期为24小时。对连续细细胞系，，失去了了细胞周周期控制制，人工工培养条条件不适适，细胞胞将发生生程序化化死亡即即凋亡。。在培养养过程中中，缺乏乏生长因因子或血血清、营营养受限限和逆境境等可引引发凋亡亡发生。。二、细胞胞群体的的生长过过程细胞群体体生长增增殖过程程与微生生物的生生长增殖殖过程相相似1.潜潜伏期，，细胞经经历一段段悬浮状状态，贴贴附于器器皿表面面。2.对对数生长长期：细细胞分裂裂旺盛，，指数增增加。细细胞相互互接触汇汇合成片片，接触触抑制，，限制分分裂和运运动，密密度不再再增加。。3.静静止期：：分裂裂数与死死亡数相相等的相相对动态态平衡时时期。4.衰亡亡期：细细胞死亡亡数目大大于分裂裂数目的的时期。。三、群体体细胞生生长的动动力学参参数细胞分裂裂代数G就可用用下列公公式计算算：G＝logN－－logN0））/log2第四节动动物细细胞的分分离与培培养一、细胞胞的种类类生物体是是由多种种多样的的分化细细胞构成成，如人人体的细细胞类型型达200余种种。这些细胞胞都是由由受精卵卵分裂产产生的细细胞后代代生长增增殖分化化而来。。不同细细胞具有有不同的的功能，，细胞分分化异常常导致癌癌变。分分化程度度越高，，脱分化化的能力力越差。。在胚胎发发育过程程中，高高等动物物细胞的的分化是是由全能能性变成成多能性性，再变变成单能能性，进进而失去去再分化化的能力力。虽然成熟熟细胞不不能再分分化，但但其细胞胞核仍然然具有全全能性，，因此可可以通过过核移植植，克隆隆动物。。体外培养养细胞，，可分为为原代细细胞系、、传代细细胞。原代培养养：从体内取取出的组组织细胞胞进行体体外接种种培养，，原代培培养的细细胞为原原代细胞胞，它生生长分裂裂并不旺旺盛，与与体内细细胞相似似，适合合于药物物检测实实验。生生产中有有些产品品仍沿用用原代细细胞，如如鸡胚细细胞，兔兔或鼠肾肾细胞、、淋巴细细胞。传代细胞胞:原代细胞胞转接后后培养的的细胞。。传代后后，细胞胞分裂增增殖旺盛盛，能保保持一致致的二倍倍体核型型，所以以又成为为二倍体体细胞系系。传代代细胞的的增殖能能力有限限，所以以也称为为有限细细胞系。。如WI－38、MRC－5、2BS等用用于生产产。根据细胞胞的传代代次数和和寿命，，可分为为有限细细胞系和和无限细细胞系或或连续细细胞系。。有限细胞胞系:正正常细胞胞经过多多次传代代后，一一般可连连续培养养30－－50代代，就会会逐渐失失去增殖殖能力，，也就是是说它们们只能生生长有限限的时间间，经过过若干传传代培养养后将老老化死亡亡。无限细胞胞系：当当细胞经经过自然然或人为为的因素素转化为为异倍体体后，才才能变为为无限细细胞系。。如肿瘤瘤细胞就就是自发发形成的的永久细细胞系，，没有分分裂次数数的限制制。物理理、化学学或生物物因素也也能获得得。细胞寿命命无限，，生长不不受细胞胞密度的的影响，，倍增时时间短不不具接触触抑制现现象，它它对培养养条件和和生长因因子等要要求低，，，非常常适合于于工业化化生产，，理想的的药物生生产细胞胞系。根据细胞胞对生长长特性和和对基质质的依赖赖性，可可分为贴贴壁依赖赖性细胞胞和非贴贴壁依赖赖性细胞胞。贴壁依赖赖性细胞胞：生长长需要在在适量带带电荷的的固体或或半固体体支持表表面，细细胞自身身分泌或或人为在在培养基基中加入入贴附因因子，使使细胞依依附在支支持物表表面，才才能生长长和增殖殖，大多多数动物物细胞都都属于此此类。非贴壁依依赖性细细胞：生生长不依依赖于固固体支持持物表面面，可在在培养液液中悬浮浮生长，，有时被被称为悬悬浮细胞胞。血液液、淋巴巴细胞、、肿瘤细细胞和某某些转化化细胞属属于此类类，生长长干扰素素的Namalwa细细胞。有些细胞胞对支持持物的依依赖性不不严格，，可贴壁壁生长，，可悬浮浮生长。。中国仓仓鼠卵巢巢细胞、、小鼠L929细胞、、BHK细胞。。二、工程程细胞的的获得与与保存目前用于于制药的的动物细细胞有4类，即即原代细细胞系、、二倍体体细胞系系、异倍倍体细胞胞系和融融合的或或重组的的工程细细胞系。。细胞无限限传代，，使大规规模工业业化生产产药物成成为可能能。异倍体细细胞用于于产生重重组基因因工程产产品，使使动物细细胞成为为药物生生产的一一个新领领域。1.原原代细胞胞系的分分离与培培养用原代细细胞系生生产药物物需要大大量的动动物。动物组织织或器官官洗涤粉粉碎酶解消化化离心或过过滤接种培养养培养液稀稀释细胞胞洗涤37度消消化，检检查是否否充分和和完全。。胰蛋白酶酶：细胞胞间质较较少的软软组织，，胚胎、、肝、肾肾及传代代细胞胶原酶：：纤维、、上皮、、癌组织织工作浓度度：0.1-0.3mg/ml链霉蛋白白酶、粘粘蛋白酶酶、蜗牛牛酶2.传传代细胞胞培养长满器皿皿表面的的细胞进进行分离离，接种种到新的的培养基基上，进进行新一一轮培养养。掌握好最最佳时期期：刚刚刚全部汇汇合的细细胞，过过早产量量低，过过晚健康康状态不不佳。过程与原原代细胞胞相同，，用30－50倍体的的0.25％胰胰蛋白酶酶和EDTA对对细胞块块消化，，消化后后再培养养。要注意消消化程度度，细胞胞对酶的的反应不不同，有有的敏感感，掌握握好适宜宜的消化化时间和和方法，，不要过过度，获获得细胞胞浓度均均匀，生生长速度度一致的的传代细细胞。曾经广泛泛应用，，但不是是理想的的生产细细胞系3.细细胞系的的建立与与保存一旦获得得了稳定定的有一一定特性性的细胞胞系，就就建立细细胞库，，进行长长期保存存。根据据药品生生产的有有关规定定，必须须建立原原始细胞胞库和生生产用细细胞库或或工作细细胞库。。WCB1QCWCB2QCQC原始培养物MCBQC内容容：细胞胞活性检检测、无无菌实验验、核型型、DNA分析、同同工酶分分析、支支原体试试验、其其他外源源物试验验、稳定定性和基基因型分分析等，，工作细细胞库必必须与主主细胞库库完全一一致。低温冷冻冻保存：：用冷冻保保护液（（含10％血清清的培养养液，附附加10％甘油油或7.5%-10%二甲基基亚砜））细胞预预冷，稀稀释成106细胞/ml。分分装，火火焰下封封口。缓缓慢冷冻冻，细胞胞放入CO2低温冰柜柜或液氮氮中，温温度为-150—-190℃，细胞的的全部活活动几乎乎处于停停止状态态。复苏细胞胞：冷冻细胞胞取出，，立即在在37℃水浴中，，快速融融化。在在保护剂剂存在下下，慢冻冻快融是是保存复复苏细胞胞的要领领。融化化后的细细胞可用用于进一一步实验验。三、大规规模培养养方法根据动物物细胞的的生长特特点，只只能采用用悬浮培培养、贴贴壁培养养、固定定化培养养等三种种主要方方法进行行大规模模培养。。1.单单层贴壁壁培养细胞贴附附于一定定的固体体支持表表面上，，进行的的培养方方法。大大多数动动物细胞胞属于贴贴壁依赖赖性，贴贴壁培养养是动物物细胞培培养的一一种重要要方法。。接种后后，细胞胞经过吸吸附、接接触而贴附于基基质表面面，然后后进行生长、分分裂繁殖殖，很快快进入对对数期。。一般数数天就长长满整个个表面，，形成致致密的单单层细胞胞。贴壁培养养容器:转