分子生物学检查

分子生物学检查南京中医药大学西内教研室徐庆分子生物学定义

分子生物学（molecularbiology)是从分子水平研究生命现象的科学。它的核心内容是通过生物的物质基础—核酸、蛋白质、酶等生物大分子的结构、功能及其相互作用等运动规律的研究来阐明生命分子基础，从而探索生命奥秘分子生物学发展简史1871年Miesscher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离到DNA1953年Watson和Ｃrick阐明DNA双螺旋结构1958年Meselson和Stahl提出DNA半保留复制模型1965年发现质粒1966年Nirenberg等破译全部遗传密码1970年Smith分离到第一种核酸内切限制酶1973年Boyer和Cohen建立DNA重组技术1977年Sanger以及Maxam和Gilbert发明快速DNA测序技术1981年Palmiter和Brinster成功获得第一只基因小鼠1985年PCR方法问世；Watson出任“人类基因组计划”首席科学家1990年美国批准第一个体细胞基因治疗方案分子生物学发展简史1995年英国“自然”杂志发表人类基因组全物理图1997年英国爱丁堡罗斯林研究所培养出第一只克隆羊多莉1999年中国正式加入“人类基因组计划（HGP）”2000年全部人类基因组测序工作宣告完成，进入后基因组计划时代(基因克隆计划、基因组多样性计划、cDNA计划、蛋白质计划、细胞计划）分子生物学与现代医学一、分子生物学在发病机制中的应用

1阿尔兹海默病（AD）的基因定位2生物活性多肽及蛋白质mRNA研究

确证肾素血管紧张素系统在遗传性高血压发病中起重要作用

3对某些病毒致病作用的研究发现肝癌细胞DNA整合有HBV-DNA，认为乙肝与肝癌发病密切相关4认识了某些遗传疾病的发病机制地中海贫血是或基因缺失或点突变所致二、分子生物学在疾病诊断中的作用发病过程：基因突变---mRNA---蛋白质（激素）---细胞病变---组织器官病变---临床症状根据基因突变检测、基因连续性分析、mRNA检测三种途径，使用核酸分子杂交和PCR技术，进行分子生物学检查，使遗传性疾病、感染性疾病和肿瘤等的诊断提前到基因和mRNA水平

三、分子生物学在疾病治疗中的应用基因治疗：将目的基因加以修饰，转移到体细胞中，以达到治疗作用应用：单基因遗传病、肿瘤、心血管、自身免疫疾病及病毒感染等危害较大且目前无有效治疗途径的疾病四、重组DNA技术与新药研究

重组微生物、基因疫苗、细胞因子合成、转基因动植物等分子生物学的一般原理和研究方法一、核酸的结构和功能1核酸的一级结构：磷酸二酯键连接成的核苷酸链核苷酸：戊糖、磷酸基团、碱基碱基：DNA：A、G、T、CRNA：A、G、U、C核酸是极性分子，5’端为磷酸基团，3’端为羟基，核酸序列的习惯写法是5’端3’端核酸的结构和功能2DNA的二级结构：著名的双螺旋结构两条核苷酸链通过碱基间氢键相连（A—T，C—G），走向相反。DNA的变性与复性：诱导因素：加热、酸、碱、乙醇、丙酮、高盐等

应用：分子杂交的基础核酸的结结构和功功能3DNA的三三级结构构：DNA双双螺旋和和核小体体串珠装状状的核小小体压缩缩成螺旋旋形，进进一步折折叠成染染色单体体，DNA长度度因此缩缩短10000倍4DNA功能能携带和传传递遗传传信息，，体现遗遗传过程程的相对对保守性性遗传的中中心法则则DNARNA蛋蛋白质复制转录逆转录复制（病病毒）翻译核酸的结结构和功功能5DNA的的半保保留复制制原则核酸的结结构和功功能6RNA：：rRNA：组组成核糖糖体mRNA：传传递遗传传信息由由核内至至胞浆的的核糖体体tRNA：转运运氨基酸酸密码子：：共64个个密码子子，有61个用用于编码码20个个氨基酸酸，另外外还有3个作为为终止密密码(UAA、、UAG、UGA)二、基因因及其表表达调控控基因：合成有功功能的蛋蛋白质多多肽链或或RNA所必需需的全部部核酸序序列。一一个基因因不仅包包括编码码序列，，还包括括所需的的调控序序列、5’端不不翻译序序列、内内含子和和3’非非翻译序序列等所所有核酸酸序列基因组：：一个生物物体的所所有基因因。人类类指23对染色色体中的的所有基基因基因及其其表达调调控基因表达达调控：：多层层次DNA及及染色体体水平转录水平平转录后水水平翻译水平平蛋白质加加工水平平三、人类类基因缺缺陷的主主要类型型突变指突变体体中DNA结构构的任何何改变，，致使基基因作用用（结构构蛋白、、酶等）），以致致个体表表型改变变（一）点点突变：：单个核核苷酸的的置换（1）同同义突变变：GAUGAC均均是天门门冬氨酸酸密码子（2）错错义突变变：翻译译出的氨氨基酸改改变（3）无无义突变变：产生生提前出出现的终终止密码码子（4）延延长突变变：终止止密码子子突变为为氨基酸酸密码子子人类基因因缺陷的的主要类类型（二）缺缺失或插插入小的缺失失或插入入，碱基基数量非非3的整整倍数，，称移码突变变，若为3的整整倍数，，出现密密码子的的插入或或缺失（三）染染色体畸畸变染色体结结构发生生大范围围改变：：倒位、、缺失、、插入、、易位四、基因因工程基因工程程是指在体体外的条条件下，，人工将将DNA分子““剪切””并重新新“拼接接”，，形成一一个新的的杂合的的DNA分子，，然后将将它导入入微生物物或真核核细胞内内进行扩扩增，使使该基因因在细胞胞内高效效表达，，从而产产生人类类需要的的基因产产物或改改造、创创造新的的生物类类型基因工程程基因工程程的基本本程序（1）带带有目的的基因的的DNA片片段的获获得（2）DNA片片段与载载体DNA连连接（体体外重组组）（3）连连接产物物导入宿主细胞胞（4）重重组体的的扩增、、筛选与鉴鉴定（5）目目的基因因在细胞胞中的表达（6）表表达产物物的分离离、鉴定等基因工程程（一）基基因工程程的工具具酶限制性核核酸内切切酶核酸修饰饰酶：连接酶、、聚合酶酶、核核酸酶、、碱性磷酸酸酶等（二）基基因工程程的宿主主细胞和和载体原核细胞胞：大肠杆菌菌、枯草草杆菌宿主细胞胞真核细胞胞：哺乳乳动物细细胞大肠杆菌菌：质粒粒、噬菌体体衍生载载体常用载体体哺乳动物物细胞：：单链噬噬菌体载载体、逆转录病病毒、腺腺病毒基因工程程（三）目目的基因因的分离离已知基因因的获得得：限制性内内切酶酶酶切法PCR法法、RT-PCR法、、人工合成成DNA片段法法基因文库库筛选法法未知基因因的获得得：蛋白质DNA策略基因工程程（四）目目的基因因与载体体的连接接工具：DNA连连接酶酶产物：重重组体（五）重重组DNA分子子导入宿宿主细胞胞转化：导导入细菌菌转转染染：导入入噬菌体体、病毒毒宿主菌必必须是限限制酶缺缺陷型和和DNA重组缺缺陷型基因工程程（六）重重组体的的筛选直接筛选选法：借助遗传传表型进进行筛选选插入失活活法：pBR322质质粒结合合氨苄青青霉素（（Ap））和四环环素（Tc）抗抗性基因因，插入入后失活活Tc插入表达达法：pTR262质质粒的四四环素抗抗性（Tcr）基因上上游cI基因，，插入后后cI基基因失活活，抗性性表达（七）克克隆基因因的表达达基因工程程插入失活活法筛选选重组体体示意图图基因诊断断一、基因因诊断的的基本原原理运用现代代分子生生物学和和分子遗遗传学方方法检测测基因结结构及其其表达功功能是否否正常，，从而对对人体状状态和疾疾病作出出诊断。。基因诊诊断检测测的靶物物是DNA或mRNA基因诊断断二、基因因诊断的的特点1高度度特异性性2高灵灵敏度及及精确性性：PCR方法法克检测测出pg级水平靶基因因3早期快快速：结合合杆菌培养养需几周，，痰涂片染染色阳性率低，，PCR方方法一个工工作日确诊诊4被测基基因不一定定处于活化化状态三、基因诊诊断的临床床意义1优生优优育3预防医医学2器官移移植4感感染性疾病病核酸分子杂杂交技术定义：依据DNA双链碱基基互补、变变性和复性性原理，用用已知碱基基序列的单单链核苷酸酸片段作为为探针检测测样本中是是否存在与与其互补的的同源核酸酸序列的方方法核酸分子杂杂交技术一、探针的的特征和种种类探针是一段段与被测核核苷酸序列列互补的带带标记的核核苷酸片段段特征：1要加以以标记，带带示踪物2单链3选取基基因编码序序列4高度特特异性5长长度十几到到几千碱基基6标记探探针高灵敏敏度、稳定定，标记方法简便、、安全种类：基因组DNA探针、、cDNA探针、寡核苷酸探探针、RNA探针核酸分子杂杂交技术二、探针的的标记物放射性核素素：32P、35S、3H、125I、131I非放射性物物质：生物物素、地高高辛、荧光光素、酶（（辣根过氧氧化物酶、、碱性磷酸酸酶、半乳乳糖苷酶等等）及金属属Hg等三、核酸分分子杂交方方法液相杂交；；固相杂交交固相载体：：硝酸纤维维素膜、尼尼龙膜、乳乳胶、磁珠等核酸分子杂杂交技术杂交基本程程序核酸分子杂杂交技术几种固相核核酸分子杂杂交方法：：1Southern印迹迹杂交法：：DNA分子子经酶切核核琼脂糖凝凝胶电泳后后，放入碱碱溶液中变变性，将变变性后的单单链DNA从凝胶上上吸印到硝硝酸纤维素素膜或尼龙龙膜上用与与杂交核酸分子杂杂交技术2Northern印迹迹杂交法：：经典的RNA分析法法，类似Southern印印迹，主要要区别是在在变性剂存存在下，以以琼脂糖凝凝胶电泳分分离RNA3斑点或或狭缝杂交交4原位杂杂交：核酸分子探探针与细胞胞或组织切切片中核酸酸进行杂交交核酸分子杂杂交技术四、杂交信信号的检测测1放射自自显影：X光片检测测放射性核核素标记物物2非放射射性探针检检测：（1）偶联联（2）显色色：酶促、、荧光、化化学发光聚合酶链式式反应（PCR）1985年年KaryBM创建了了聚合酶链链反应（polymerasechainreaction,PCR)技术术，又称体体外基因扩扩增技术，，该技术可可扩增核酸酸靶序列，，增加106倍，极大提提高检测灵灵敏度原理：利用DNA聚合酶依依赖于DNA模板的的特性，模模仿体内的的复制过程程，在附加加的一对引引物之间诱诱发聚合酶酶反应。PCR全过过程由DNA模板板变性、模板与引物物结合及引物延伸三个步骤组组成聚合酶链式式反应（PCR）PCR反应应的原理示示意图1DNA模板板变性2模板与引物物结合3引物延伸聚合酶链式式反应（PCR）PCR条件件的优化1模板核核酸：来源广泛、、需部分纯纯化、去除除DNA聚聚合酶抑制制剂一般宜用ng级的克克隆DNA，g水平的的染色体DNA或104拷贝贝的待扩增增模板用于检测目目的，扩增增片段长度度一般不超超过500bp，以以100-300bp为好2引物应纯化，浓浓度不宜过过高一般终浓度度为0.2-1.0mol/L聚合酶链式式反应（PCR）3缓冲液液目前最常用用PCR反反应的缓冲冲液体系为为10-50mmol/LTris-HCl（PH8.3-8.8，，20°C）偏碱性有利利于TaqDNA聚合酶作作用缓冲液中50mmol/LKCl利利于引物退退火Mg2+对产量和特特异性有显显著影响，，过高特异异性下降；；过低产量量减少。在在各种dNTP浓度度为200mol/L时Mg2+为1.5-2.0mmol/L较合适适聚合酶链式式反应（PCR）4dNTP浓度度常采用50-200mol/L的dNTP4种dNTP浓度要要一致5TaqDNA聚合酶用用量在100l总总反应液中中，一般所所需TaqDNA聚合酶用用量为0.5-5U，通常常加入2.5U，，足以达到到每分钟延延伸1000-4000个核核苷酸速度度聚合酶链式式反应（PCR）6循环参参数（1）变性性温度与时时间94°C30s（2）退火火温度与时时间退火温度决决定反应特特异性取决于引