兽用生物制品质量监控课件

1兽用生物制品质量监控赵蕾2兽用生物制品监察制度

一、兽用生物制品的质量管理体系二、菌（毒、虫）种和标准品的管理三、防止散毒的原则与措施四、生物制品的保存、运输和使用办法3

兽用生物制品的质量管理体系:5

兽用生物制品生产条件:67810只有按照规定项目和方法进行检验证明合格的种子种子批和分级管理制度原始种子基础种子生产种子制造用种子检验用种子中监所或中监所委托单位负责保管中监所或中监所委托单位负责制备、鉴定、保管和供应生产企业自行制备、鉴定、保管（1）定量分装保存原始细胞库主细胞库工作细胞库液氮或-100℃以下均经检定证明适用于生物制品生产与检定细胞种子批系统：可用于相应疫苗或诊断制剂的生产制造每批必检原代细胞检验用禽源健康家禽的正常组织检验用非禽源细胞系质量要求：支原体检验细菌和霉菌检验外源病毒检验健康动物的正常组织每批监测可见特征细胞系细胞来源传代史培养液清楚记录完整各代至少冻结保留3瓶细胞系质量要求：镜检特征生长速度产酸每次传代后的细胞、半成品或成品支原体检验细菌和霉菌检验外源病毒检验致细胞病变红细胞吸附性病毒检查被检物至少应含有75cm2的活性生长细胞或相当的细胞培养物17检定用实验动物——普通级动物（一级动物），应排除人畜共患病及动物烈性传染病病原体；——清洁级动物（二级动物），还应排除影响动物健康的动物传染病的病原体；——SPF动物（三级动物），还应排除隐性感染的病原体；——无菌动物（四级动物），无可检定的一切微生物；——悉生动物（四级动物），无菌动物体内植入已知微生物的实验动物。只有按照规定项目和方法进行检验证明合格的种子细菌申报新生物制品试行规程时，送中监所复核保存研究单位均需标明名称、代号、来源和代次原种规定其培养特性、生化特性、血清学特性、毒力、免疫原性等（3）病毒应规定其生物学特性、理化特性、血清学特性、最小感染量、最小免疫量、安全性等寄生虫支原体衣原体立克次氏体螺旋体纯粹检验应符合规定并作细菌、霉菌、支原体、外源病毒等检验，应符合规定只有按照规定项目和方法进行检验证明合格的种子应符合《规程》有关规定制成基础种子批中监所或中监所委托单位所保管的种子和标准品（5）限制代次使用期限按《规程》进行鉴定批号鉴别号报中监所审核鉴定人签字主管人审核存档委托分管单位记录复印件和结果详细记录只有按照规定项目和方法进行检验证明合格的种子由各生产企业领取的基础种子生产种子批（6）鉴定繁殖制备应符合《规程》有关规定制造和检验制品的原种（8）中监所统一编号立案种子的保管各级种子的保管必须专人负责分别存放于规定条件下加锁或密封，详细的分类清单严格的登记制度建立总账、分类账详细的种子登记卡片和档案新收到的种子立即登记注明收到日期、数量和收到时的状态记载名称、编号、历史、来源、特性、用途、编号、批号、传代、冻干日期等种子使用、移植继代及其他随时详细记录无保存价值的种子本单位主管批准淘汰委托分管单位中监所批准淘汰基础种子保存期冻干种子的保存期限索取生产检验用基础种子和标准品（9）必须由企业的介绍信种子及标准品的索取与分类有产品批准文号生产企业直接向中监所或分管单位领取并保管无批准文号农业部批准方可领取生产企业和其他单位不得分发或转发生产用种子除中监所和受委托单位外寄发种子和标准品金属筒内密封，妥善包装一般可以航寄烈性传染病或人畜共患病强毒种子，须派专职技术人员领取分发种子和标准品应附有责任人签名并颁发证书收到企业应填写回执，注明收到日期、数量、有无破损等情况，寄回中监所或分管单位企业内部制备和领取种子应做好记录26生物制品的保存、运输和使用办法

各生产生物制品企业和经营、使用单位必须设置相应的冷藏设备。各成品、半成品和原材料应分别保管，经检验不合格的制品、超过规定保存期的半成品或已过有效期的成品，应及时销毁。运输生物制品，以最快方法缩短运输时间，运输过程中严防日光曝晒。收到生物制品，立即清点，尽快放到规定温度下保存，专人保管。使用生物制品，严格遵守说明书及瓶签上的各项规定，不得任意更改。27新生物制品的管理

《兽药管理条例》规定，我国研制新生物制品应进行安全性评价、临床试验前申请和新生物制品的注册申请。任何新生物制品都应经过试验室试验、田间试验、中间试生产、及区域试验研究过程。取得种子的选育和鉴定、毒力及稳定性、免疫原性、生产工艺、安全与效力检验标准及其方法、免疫剂量与免疫期、质量标准和检测方法等实验室试验数据。审批过程：预审、初审、审评、国务院兽医行政管理部门批准，发给《新生物制品证书》及试生产批准文号。技术转让，继续考核新制品的质量，完善质量标准。产品批签发工作流程图放行单企业基本情况（每年1次）兽药生产许可证复印件(存档)批签发产品的批准文号及批文复印件产品的标签、使用说明书原件现行兽用生物制品质量标准中尚未收载的产品，提供经农业部批准的产品质量标准及标准批文复印件批签发样品抽样单（每批）报中监所批签发质量监察部仓储部销售部市场生产部成品经检验合格省药检所抽样贴封签留样生产与检验报告单每一种产品第一次申报时提交30兽用生物制品的质量检验

兽用生物制品的质量检验是兽用生物制品质量管理的重要程序之一，是保证生物制品质量的关键。

菌毒种保存和检验工作流程图毒种毒价检测活菌计数中监所领取核对、登记品种和数量传代生物资源室生物资源室质检中心收获检验并记录纯粹检验活菌计数无菌检验效价毒力检测按比例加冻干保护剂分装生物资源室-40℃预冻12h以上冻干18-24h轧盖贴签抽样检验菌种菌种毒种无菌检验登记保存分发无害化处理报废合格分离菌毒种外源病毒检测不合格填写记录出具检验报告支原体检验纯粹检验鉴别检验鉴别检验半成品

活疫苗半成品检验工作流程图请验单质检中心取样员取样细菌类半成品病毒类半成品活菌计数无菌检验不合格入库重检报废合格不合格合格记录出具检验报告毒价检测纯粹检验

灭活疫苗和抗体类半成品检验工作流程图请验单质检中心取样员取样细菌类半成品病毒类半成品抗体类半成品灭活前灭活后纯粹检验无菌检验活菌计数无菌检验灭活检验毒价检测无菌检验效价检验外源病毒检验不合格入库重检报废合格不合格合格记录出具检验报告灭活前灭活后毒价检测效价检测成品

活疫苗成品检验工作流程图请验单质检中心取样员取样细菌类成品病毒类成品活菌计数无菌检验记录外源病毒检验纯粹检验性状检验真空度测定剩余水分测定安全检验支原体检验鉴别检验安全检验效力检验留样室登记保存有效期后一年整理造册质量监察部经理批准销毁并填写销毁记录合格重检并记录入成品库不合格报废无害化处理合格放行质量监察部报中监所批签发样品报告单不合格出具检验报告报告总裁合格重检并记录入成品库不合格报废无害化处理合格物理性状检验无菌检验安全检验效力检验灭活疫苗和抗体类成品检验工作流程图请验单质检中心取样员待检库取样记录留样室登记保存有效期后一年整理造册质量监察部经理批准销毁并填写销毁记录出具检验报告放行质量监察部报中监所批签发样品报告单不合格甲醛、硫柳汞含量测定报告总裁实验动物中心实验动物中心工作流程图实验动物检疫消毒安检动物舍免疫动物舍传递窗（门）攻毒动物舍试验人员一更二更二更淋浴一更物料检验缓冲间喷雾消毒出屏障对动物攻毒观察剖检无害化处理一更二更出动物舍人员流动程序动物流动程序物料流动程序动物粪便染毒物品动物尸体40兽用生物制品的质量检验

一、无菌检验或纯粹检验（一）抽样（二）检验用培养基（三）检验方法及结果测定（四）杂菌计数及病原性鉴定细菌原液及活菌苗半成品的纯粹检验供试品为原纯菌体而无杂菌生长适于本菌生长的培养基斜面2支0.2ml/支TG小管2支0.2ml/支3-5天37℃25℃病毒原液和其他配苗组织乳剂、稳定剂及半成品的无菌检验供试品应无细菌生长G.A斜面2支0.2ml/支TG小管2支0.2ml/支3-5天37℃25℃44无菌检验或纯粹检验操作规程流程图供试品1ml接种到T.G培养基50ml37℃培养小瓶中吸取培养物3日后T.G小管2支0.2ml/支G.A斜面2支G.P小管1支37℃各1支25℃各1支均培养5天应无菌生长供试品0.6mlT.G小管2支0.2ml/支G.A斜面2支G.P小管1支37℃各1支255℃各1支或适宜本菌生长的其他培养基均培养5天细菌性活疫苗应纯粹其他制品应无菌生长供试品0.2ml不加琼脂T.G小管2支0.2ml/支不加琼脂G.A小管2支37℃各1支25℃各1支均培养5天含甲醛、苯酚、汞类等防腐剂和抗生素制品细菌性活疫苗及不含防腐剂、抗生素的其他制品血液制品和混浊制品的检验如培养后浑浊不易判定时，可移植一次，再判定45杂菌计数操作规程流程图普通肉汤或蛋白胨水污染制品重新抽取3瓶样品分别按组织量作50倍稀释接种2个平板0.1ml/样品含4%血清及0.1%血红素马丁琼脂或G.A琼脂平板放置36℃培养48h再放置室温24h分别计算杂菌数任何1瓶每克组织（或每头剂）的病原菌数，不应超过所检产品的规定数量，如污染霉菌，亦作杂菌计算46污染杂菌病原性鉴定操作规程流程图污染杂菌的培养物需氧性细菌检查移植1支T.G或马丁肉汤小管置相同条件培养24h取培养物0.1ml用蛋白胨水稀释100倍接种18-22g健康小鼠3只皮下注射0.2ml/只观察10天污染杂菌的小管培养物厌氧性细菌检查培养时间延长到96h取出置65℃水浴箱中作用30分钟移植培养取T.G小管或厌气肉肝汤小管培养基1支接种0.2ml置同条件培养24-72h杂菌培养物接种350-450g健康豚鼠2只，肌肉注射1ml/只如有细菌生长如果制品同时污染需氧性及厌氧性细菌时则按上述方法同步进行鉴定小白鼠、豚鼠均应健活，如有死亡或局部化脓、坏死，证明有病原菌，该批制品应废弃47禽沙门氏菌检验操作规程流程图污染杂菌的培养物划线法接种于麦康凯琼脂平板或S.S琼脂平板2个37℃培养24-48小时挑选无色半透明、边缘整齐、表面光滑并稍突起的可疑小菌落2-3个如无可疑菌落或菌落较小时，再继续培养24-48小时用0多价1沙门氏菌因子血清平板凝集试验方法：用毛细血管或铂金耳在玻片上滴1-2滴因子血清，然后用铂金耳取少量被检物与因子血清混合，轻轻摇动玻片结果判定2分钟内出现凝集反应，判为阳性48支原体检验操作规程流程图每批制品取样3-5瓶混合后备用取5ml混合物接种于20ml小瓶液体培养基取0.8ml移植0.2ml/付2支小管液体培养基2个平板培养基置37℃培养置5%CO2培养箱培养每日观察培养物有无变化5日后重复以上移植过程3次所有移植培养物均观察14天每次移植培养均设阴阳性对照，在同条件下培养观察。阳性对照：禽类疫苗用滑液支原体，非禽类疫苗用猪鼻支原体；阴性对照：同批培养基结果判定任何一次琼脂平板上出现支原体菌落，判疫苗或血清不合格；阳性对照中至少有一个平板上有菌落生长，而阴性对照中无菌落生长，则检验有效观察其内，如发现小瓶或任何一支小管培养物颜色出现明显变化，即PH值变化达±0.5时，立即移植于小管液体培养基和固体培养基，观察液体培养基中是否出现恒定的PH变化及固体上有无典型的“煎蛋”状支原体菌落49禽源细胞（原代或细胞系）及其制品外源病毒检验流程图样品处理2-3瓶样品

毒种活疫苗细胞鸡检查法样品混合中和特异性血清不作处理混合3次冻融鸡胚检查法鸡检查法细胞检查法

无结果结果可疑鸡胚液9-11日龄SPF胚20个10枚第1组10枚第2组尿囊腔0.1ml绒毛尿囊膜接种0.1ml37℃培养7天弃去接种后24h内死亡胚，每组胚至少存活8只血凝试验判定适宜日龄SPF鸡20只肌肉注射100羽份点眼滴鼻10羽份21日后重复一次有关病原的血清抗体检验采血不应有疫苗引起的局部或全身症状和呼吸道症状或死亡除特异性抗体外，不应有其他病原的抗体存在如有死鸡病理学检查证明是否由移苗所致细胞观察红细胞吸附试验COFAL不出现由外源病毒所致的红细胞吸附现象不出现CPE无白血病病毒阴性胎儿发育正常绒毛尿囊膜无病变安全检验检查内容：

制品中外源性细菌污染

灭活疫苗和类毒素的灭活或脱毒状况

弱毒疫苗残余毒力或毒性物质

有的制品还要检查对胚胎的致畸情况和致死毒性

成品的安全检验是利用动物进行接种试验，将生物制品按要求量接种到动物后，观察数日，动物应健康存活实验动物：

兔、豚鼠、地鼠和大白鼠应符合国家规定的一级（普通级）标准；

小白鼠应符合二级（清洁级）标准

鸡、鸡胚应符合三级（SPF级）标准

猪应无朱瘟病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒、口蹄疫病毒、弓形虫感染和体外寄生虫；

犬应无狂犬病病毒、皮肤真菌感染和体外寄生虫。

上述动物还应无本制品的特异性病原和抗体。52安全检验---动物选择和剂量选择敏感性动物能用小动物做出正确判断者品种品系日龄等多用实验小动物如：猪丹毒弱毒疫苗用鸽子和10日龄小鼠做试验有一定的要求禽用疫苗可直接用鸡或鸡胚作安检大于使用剂量通常高于免疫剂量的5-10倍必要时还要用同源动物进行复检安全检验要点及结果判定充分混合安检动物有死亡确属意外死亡按各标准中的规定进行检验和判定安全检验期内及时剖检取样培养每批抽样3瓶无结论检验结果可疑难以判断以加倍动物数进行重检如不安全该批制品应予以报废凡规定用多种动物进行安检的制品多种动物都要合乎标准要求安全检验举例—猪丹毒灭活疫苗的安检各皮下注射疫苗0.3ml安检动物有死亡确属意外死亡观察10天均应健活及时剖检取样培养18-22g小白鼠5只无结论检验结果可疑难以判断以加倍动物数进行重检如不安全该批制品应予以报废55效力检验目的效力检验目的疫苗和类毒素效力不好的制品评价制品的实际使用价值无法有效地控制疾病治疗用血清无法治愈患病动物诊断制品影响诊断的正确性56效力检验检验内容效力检验检验内容免疫原性疫苗最小免疫量PD50或IMD50灭活疫苗种类加入冻干保护剂的种类PFU免疫的持续期抗原量的测定生物制品的热稳定性制备工艺血清诊断制品弱毒疫苗疫苗细菌病毒菌落形成单位病毒蚀斑形成单位效力检验检验方法----动物保护力试验动物保护力试验定量免疫定量强毒攻击法分别接种动物观察动物被攻击后存活或不感染比例免疫组同一剂量的制品接种免疫定量免疫变量强毒攻击法变量免疫定量强毒攻击法抗病血清的抗体效力测定攻击强毒若干小组比较两组存活率2-3周后判定制品效力对照组若干小组不同稀释倍数攻击强毒2-3周后疫苗稀释不同的免疫剂量观察一定时间后存活和死亡数攻击同一剂量强毒2-3周后用统计学方法计算能使50%动物得到保护的免疫剂量待检制品接种动物免疫组对照组检测免疫血清中特异性抗体效价攻击相应的强毒衡量其免疫力或效力免疫血清注射易感动物活菌计数方法操作规程流程图原菌液一步放大稀释稀释液准确吸取1ml第1支试管盛放9ml稀释液置于微型漩涡混合仪上混合5次另取一支试管吸取1ml第2支试管盛放9ml稀释液……最后一管依次稀释吸取0.6ml滴3平皿0.1ml/皿倾斜转动平皿使菌液散开先错开平皿盖晾干30-60分钟36-37℃翻转平皿培养24-48h加3平皿1ml/皿15-18ml45-50℃培养基轻轻摇动平皿使两者混合均匀琼脂凝固36-37℃菌落数计算算出三付平皿的平均菌落数用记号笔在平皿底面点数×10算出最后一管稀释菌液每毫升含菌数乘以最终稀释倍数样品含菌数表面培养测定法混合培养测定法病毒半数感染（致死）量（LD50、ELD50、EID50、TCID50）

的测定操作规程流程图病毒悬液10倍稀列稀释取适宜稀释度病毒定量接种动物（鸡胚、细胞培养物）由最高稀释度开始，每个稀释度接种4-6只（管、瓶、孔）观察记录动物（鸡胚、细胞培养物）死亡数或病变情况计算各稀释度死亡或病变动物（鸡胚、细胞培养物）的百分率计算距离比例病毒半数感染量=高于50%的死亡或病变数-50%的死亡或病变数高于50%的死亡或病变数-低于50%的死亡或病变数=高于50%的病毒稀释度的对数+距离比例+稀释系数的对数效力检验检验方法----血清学试验61物理性状检验-外观检查操作规程流程图随即取出待检样品（3-5瓶/批）一字排列于操作台上观察各瓶间在包装、外观方面有无明显差异液体产品应当注意动作轻缓逐瓶检查样品的瓶、塞、标签有无破损和毁坏液体产品注意检查液体有无分层，油乳剂灭活疫苗注意检查有无破乳观察产品的颜色检查产品状态注意检查同批各瓶间、相同产品不同批之间颜色是否一致冻干产品注意检查冻干团块的大小，质地是否均一，表面有无塌陷、是否与萍壁粘连，有无杂质。打开1-2瓶产品加入稀释液，注意观察团块溶解速度和溶解后的溶液有无不溶物质液体产品注意检查在静置时和振摇后的状态油乳剂产品应当注意有无组织块、杂质和破乳外观检查容易受主观影响，应当由2名检验员共同进行，检验环境要有合适的自然光条件62物理性状检验-剂型检查操作规程流程图随机抽取待检样品（1-2瓶/批）一字排列于操作台上在玻璃平皿或烧杯中盛入冷水（不超过室温），准备好吸管振摇每瓶样品使之混匀打开铝封和瓶塞吸取疫苗0.5ml将一滴疫苗滴在平皿的水面上1ml吸管距水面方2-3cm处由于表面张力的影响，液滴往往在液面上扩散再滴入2-3滴疫苗注意从上观察疫苗在液面的扩散情况和从容器侧面观察疫苗向下扩散的情况记录液滴的扩散情况第一滴和以后各滴分别记录。描述为“扩散”或“不扩散”。第一滴不作为判定依据结果判定油包水型除第一滴在液面出现扩散外，其他各滴滴入水中均不扩散水包油包水剂型滴入水中在液面及水中均呈现云雾状扩散，并有拖尾现象。63物理性状检验-稳定性检查操作规程流程图随机抽取待检样品（1-2瓶/批）一字排列于操作台上振摇每瓶样品使之混匀打开铝封和瓶塞分两次吸取疫苗约20ml加入小试管中10ml吸管试管用胶塞塞好将小试管放到试管架中放入37℃温箱观察结果在试管上用记号笔记录产品批号和检验日期21天后具体时间按照被检产品的质量标准确定检查试管（或离心管）上部、中部、底部有无油和水析出，试管中部疫苗有无分层记录检验全过程随机抽取待检样品（1-2瓶/批）一字排列于操作台上振摇每瓶样品使之混匀打开铝封和瓶塞吸取疫苗10ml加入离心管中离心管用胶塞塞好10ml吸管在离心管上用记号笔记录产品批号记录检验全过程或振摇每瓶样品使之混匀将离心管放到普通离心机中3000r/min离心15分钟具体转速和时间按照被检产品的质量标准确定方法一方法二记录分层和破乳情况64物理性状检验-粘度检查操作规程流程图随机抽取待检样品（1-2瓶/批）一字排列于操作台上放置室温（25℃左右）6小时，准备好专用吸管和秒表振摇每瓶样品使之混匀打开铝封和瓶塞一人用专用1ml吸管吸取疫苗1ml，使吸管垂直流出疫苗0.4ml共进行3次重复，记录每次所用秒数记录与计算结果判定为防止污染，应在无菌室内进行另一人用秒表计时检验完毕后用丙酮或其他有机溶剂清晰吸管后保存备用计算3次测定所耗时间的算术平均数，以秒表示除另有规定外，一般油包水型疫苗在8秒以内，水包油包水型疫苗应当在5秒内65冻干制品剩余水分测定之真空干燥法操作流程图含水分量2.6kPa以下准确称重样品真空干燥箱60-70℃干燥重复一次恒重样品减少量３hP2O566冻干制品剩余水分测定之卡式测定法法操作流程图费休氏液配制费休氏液标定容量滴定法测定称碘110.0g无水吡啶160ml干燥具塞烧瓶冷却振摇全部溶解无水甲醇300ml称重

冰浴冷却通入干燥二氧化硫增重72.0g1000ml无水甲醇密塞摇匀暗处放置24h水分测定仪直接标定精密称取供试品适量甲醇水分测定仪直接测定置硫酸干燥器内48h以上约消耗费休氏液1.0-5.0ml除另有规定外沉降菌监控测试方法：沉降法，即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿，经若干时间，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以平板培养皿中的菌落数来判定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室（区）的洁净度。1于监测日期前两日准备所需培养皿，平皿由精洗干烤灭菌，培养基自行高压灭菌。2制得培养皿于37℃温室培养2d（＞36h）检查是否无菌，进行挑选，弃去长菌者。3监测3.1根据时间安排完全按照GMP流程进入对应车间进行监测，四连体由各车间准备。3.2监测前用酒精棉球进行手消毒。4操作步骤及注意事项4.1按照一定顺序进行平皿摆放，将皿盖完全打开，使培养基完全暴露。摆放时，由里到外平均分布整个房间，并离墙一定距离（＞20cm），避开开关门经过的范围，动态监测时注意不要放在人员走动频繁的地方，尽量不影响正常生产。每一项用平皿至少为2个，一般房间为4个，走廊、大厅等面积较大的地方为8个以上。（一般一个房间就是一项，层流罩为单独一项，也就是有局部百级的房间有两项。）4.2培养皿在空气中暴露0.5h,再将平皿盖盖上，收平皿时，仍按房间顺序，房间内从外到里，并在平皿盖上用记