脂质体磁性复合纳米颗粒的制备与发展 杨文清123513

脂质体磁性复合纳米颗粒的制备与应用

杨文清123513摘要：造影剂辅助的核磁共振成像是目前肿瘤诊断的最好方法之一。但是由于核磁共振成像内在的低灵敏性以及造影剂的非特异性，导致肿瘤早期诊断较为困难。文章将一种新的肿瘤靶向核磁造影剂纳米粒子应用于早期肿瘤的影像诊断。这种新的肿瘤靶向核磁造影剂纳米粒子由配体转铁蛋白(Tf)、纳米水平的正电脂质体(Lip)载体和临床常用的造影剂Magnevist(TfNiR_LipNBD_Magnevist)三部分构成。另外转铁蛋白和脂质体粒子上，亦标记了荧光物质用于确定转铁蛋白．脂质体．造影荆纳米粒子的靶向性，以及肿瘤的光学影像诊断。关键词：肿瘤诊断；脂质体；纳米颗粒；磁性；靶向一、引言在科学技术飞速发展的时代，新的技术和新的理论不断涌现和完善。这些技术和理论快速地向各个领域渗透，给人类社会带来新的生机，推动社会向前发展。21世纪对社会发展最具影响力的技术是生物技术、信息技术和纳米技术。率先发展起来的生物技术和信息技术已渗透到人们生活的各个领域，为大众所熟悉；而上世纪90年代才发展起来的纳米技术却仍然披着神秘的面纱，等待着人们去探索、去完善。纳米技术(nanotectmology)是指在纳米尺度空间内操纵原子和分子，对材料进行加工，制造出具有特定功能的产品或对物质及其结构进行研究，掌握其原子和分子运动规律和特性的一门综合性的技术体系。EricDrexler教授在1986年首次正式提出纳米技术一词，对纳米技术的发展起了指导性作用。目前纳米技术已涉及从农业到医药，从基础到临床，从诊断到治疗，从纳米生物材料到人工器官、机器人各个方面，进而向诊断和治疗的微创、微型、微量、快速、实时、遥距、动态、智能化方向发展。纳米医学是纳米科技的一个新分支，是运用纳米科技的理论与方法，在传统医学和现代医学的基础上，开展医学研究与实践的新兴边缘学科。在医学领域中，纳米科技已经得到成功的应用，最引人注目的是作为药物载体和传感器载体。纳米药物载体研究始于30多年前，但一直受制于基础研究进度，产业化基础不成熟，到了上世纪90年代后才逐步走向市场，现在正呈加速发展状态。目前中国的纳米药物载体技术的产业化进程比较快，不久的将来就可有纳米医药产品问世。而其中最具有发展潜力和市场前景的是以纳米脂质材料制成的药物载体。脂质纳米粒用作药物载体具有下述显著优点：(1)载药脂质纳米粒作为异物而被巨噬细胞吞噬，到达网状内皮系统分布集中的肝、脾、肺、骨髓、淋巴等靶部位；连接有配基、抗体、酶底物所在的靶部位。(2)到达靶部位的载药脂质纳米粒，可有载体材料的种类或配比不同而具有不同的释药速度。调整载体材料种类或配比，可投资药物的释放速度，制备出具有缓释特性的载药脂质纳米粒。(3)由于载药脂质纳米粒的粘附性及小的粒径，即有利于局部用药时滞留性的增加，也有利于药物与肠壁的接触时间与接触面积，提高药物口服吸收的生物利用度。(4)可防止药物在胃酸性条件下水解，并能大大降低药物与胃蛋白酶等消化酶接触的机会，从而提高药物在胃肠道中的稳定性。(5)载药脂质纳米粒可以改变膜运转机制，增加药物对生物膜的透过性，有利于药物透皮吸收与细胞内药效发挥。随着靶向药物的不断发展，科学家希望通过特异性生物分子介导，合成出一类具有肿瘤靶向性的造影剂，以进一步降低核磁共振成像技术的检测极限，用于肿瘤的早期诊断。肿瘤靶向造影剂主要由配体、造影剂载体和造影剂三部分构成。从理论上讲，由于肿瘤表面抗原过度表达，肿瘤靶向造影剂可以特异性地聚集在肿瘤细胞表面，从而增强微小肿瘤病灶的核磁信号，实现肿瘤早期诊断。文献报道，纳米尺度的阳离子脂质体(Lip)可被用作药物或基因治疗的载体。在脂质体的表面修饰上如叶酸、转铁蛋白(tf)或抗肿瘤表面抗原抗体等靶向配体，就可以特异性引导造影剂到达癌细胞。用于肿瘤靶向的靶向基团一般需要具有体积小、毒性低、对肿瘤特异性结合能力强、无免疫原性等特性。肿瘤靶向脂质体粒子不但能选择性地运载药物或基因到癌细胞，而且更增加了脂质体的转染效率。转铁蛋白受体在许多肿瘤，包括口腔、前列腺、乳腺、胰腺等癌细胞表面呈现高表达。比如，有研究表明在74％的乳腺癌、76％的肺腺癌、93％的肺鳞癌中转铁蛋白受体呈现高表达。且转铁蛋白受体的表达水平与肿瘤的增长速度及预后成正比。因此，近年来基于转铁蛋白的肿瘤靶向药物研发十分活跃，转铁蛋白、转铁蛋白受体的抗体、或单链抗体片段等被用来做靶向的基团。本文利用阳性脂质体粒子、转铁蛋白和临床上使用的核磁造影剂Magnevist构建了转铁蛋白.脂质体.Magnevist肿瘤靶向纳米粒子(tfNIR-LipNBD-Magnevist)，来增强核磁共振影像的对比度，用于肿瘤的早期诊断。为了研究方便，我们还在转铁蛋白上标记了近红外荧光物质。在实验中，采用光学成像的方法，确定转铁蛋白.脂质体一造影剂纳米粒子的生物分布。光学成像方法简易，检测灵敏度高(可达10-9-10-i2mol/L),没有放射性，因此在动物模型观察基因表达、基因传递，以及手术中确定肿瘤的边界上已有很好的应用。光学影像受限制于荧光在体内有限的穿透力，目前仅能提供较好的二维空间的影像。如果核磁共振高解析度成像和高灵敏度的光学成像相组合，可在分子水平上显示某疾病特殊丰富的影像表位。一系列实验表明，通过转铁蛋白介导的靶向型核磁造影剂纳米粒子，特异性地富集于肿瘤组织，显著增强了核磁共振影像的对比度。二、 实验方法：2.1实验步骤阳离子脂质体和DOTAP按1：1的比例(重量)混合溶解在氯仿溶液中(Lip),或在DOTAP：DOPE中再加入0.1%NBD—DOPE［荧光标记脂质体DOPE-N-(7-nitro-2-1-3-benzoxadiazol-4-y1)(AvantiPolarLipids,Alabaster,AL)］构建带有NBD荧光标记的脂质体(LipNBD)。取3.6p1(精确度只能到0.1pl)LipNBD混合液经氮气吹干后加入50pL含12plMagnevist造影剂(Berlex,Wayne,NJ)的水溶液重新水化LipNBD。每微升Magnevist造影剂含469.01pggadopentatatedimeglumine。震荡10分钟后用水调至175pl。将此混合液先用超声降解(80-90w,10min),然后分别经孔径为0.2pm和0.1pm的聚碳酸脂薄膜过滤。最后加入25pl荧光剂Alexa680标记的人转铁蛋白(TfNIR,5mg/mL)(Invitrogen,Carlsbad,CA),混匀后静置l0分钟以上。所有实验都用新鲜制备的探针。最终反应物的体积为200pl。脂质体、人转铁蛋白与Magnevist的比例为10：12.5:0.56(nmol/pg/mg)。另夕卜，为研究探针的细胞内吞作用，用近红外Alexa680荧光剂替代核磁共振造影剂构建了Tf-LipNBD-dye探针。浓度为200pl探针内含2plAlexa680荧光剂。2.2细胞培养和动物模型我们用人乳腺癌MDA-MB-231-1uc(CaliperLifeSciences,Hopkinton,MA)培养细胞和动物模型来测试我们新构建的靶向纳米核磁造影剂的有效性。MDA-MB-231-1uc细胞转染了北美萤火虫荧光素酶基因，表达高水平的转铁蛋白受体。细胞常规培养在含10%dx牛血清的DMEM/F-12培养基中。8到10周左右的胸腺缺陷型雌性裸鼠(Harlan,Indianapolis,IN)用于制作皮下肿瘤模型。1x107个细胞悬浮于100plDPBS中注射于裸鼠后背皮下。直径0.4至1.2cm的肿瘤用于试验。三、 结果分析3.1TfNIR-LipNBD-Magnevist的细胞内吞共聚焦显微镜观察细胞和TfNIR-LipNBD-Magnevist分别培养5分钟至2小时。TfNIR-LipNBD-Magnevist孵育的细胞显示很强的T严近红外荧光信号(图1A,D1)和绿色LipNBD信号(图1B,E1)。在和Magnevist

孵育的细胞中检测不到任何荧光信号（图1D2,E2）。LipNBD（绿色）和荧光染料（红色）在孵育5分钟后即能观察到其在胞浆中的信号。荧光强度不断增加，直至1小时后达到最大值。后，LipNBD和染料蓄积形成多个内含体。这些内含体主要位于胞浆的周边区域。在2小时后更加明显。相对仅有染料孵育的对照组,细胞对染料的摄取并不明显。利用光学成像进一步确定了探针在肿瘤细胞中的摄取。201J0O-二201J0O-二（图1）利用核磁共振成像，当探针Tf^R-LipNBD-Magnevist或Lip^D-Magnevist与细胞共孵育后，相对于Magnevist，细胞显示明显的信号增强和T1短缩。T1在与TfzR-LipNBD-Magnevist探针孵育时间减短至366ms，在与探针Lip^D-Magnevist孵育时为374ms，而与Magnevist孵育时为408ms。与TfNIR-LipNBD-Magnevist孵育的细胞较与Lip^^BD-Magnevist孵育的细胞显示更高的信号强度。这些结果证明，Tf对于探针经靶向性细胞的内吞，具有重要作用。LipNBD-Magnevist和仅Magnevist介导产生的核磁信号强度和T1不同，反应了肿瘤细胞膜和脂质体的有效融合。3.2TfNiR-LipNBD-Magnevist介导的肿瘤影像对比度增强为了研究探针是否在体内能够特异性的富集在肿瘤，我们首先进行了以TfNIR肿瘤内积聚为目标的光学成像。在静脉注射探针TfNIR-LipNBD-Magnevis诟，近红外荧光信号在10分钟时便清晰可辨，90分钟至2小时荧光的强度达到最大（图2）。荧光强度和肿瘤的大小成正比，大的肿瘤（0.8cm直径）在注射2天后仍可测到明显的荧光信号。小的肿瘤，其荧光强度在24小时后已很微弱。虽然LipNBD能够在体外被清晰地检测到，但因绿色荧光较差的穿透能力，在体内无法被检测到。组织自发荧光也是体内检测LipNBD困难的另一个重要原因。在静脉注射探针后，探针快速地分布到全身，并且很快被血流丰富的器官吸收，如肝、脾、肺、脑和骨髓。然而，探针很快从这些器官中代谢出去，与之不同的是，在肿瘤中探针衰退的过程非常缓慢。肿瘤对探针的摄取，因转铁蛋白和转铁蛋白受体的结合而增强。背景荧光在最初的快速增强之后，其背景也快速下降（图2）。根据肿瘤的大小不同，在不同的时问点上（10分钟至48小时）肿瘤的荧光强度和正常组织（对侧腿肌肉）的荧光强度比为1.3至3.4。小于3mm直径的肿瘤显示较弱的荧光信号，可能是由血管系统差异造成的。含有荧光染料的Lip而没有Tf交联的探针并没有使肿瘤组织的荧光增强。在无胸腺裸鼠实体瘤动物模型同样表明了核磁共振成像信号的增强。肿瘤直径大小从0.4至1.2cm不等（共10只动物）。相同的小鼠用来比较探针和仅用Magnevist时信号增强的不同。使用TfNIR-LipNBD-Magnevist探针或仅用Magnevist的实验相隔至少三天。静脉注射TfNIR-LipNBD-Magnevist探针明显增强了肿瘤成像对比度（图3）。在注入10分钟后可观测到增强信号，并不断增强，在90分钟至2小时信号达钊高峰（图3），达到高峰的时间与肿瘤的大小有关。之后，信号逐渐减弱。在肿瘤内不同部位信号增强有很大的差异。在1至3小时内，信号

增强的形态分布渐趋稳定。肿瘤的一些区域增强很快，而另一些区域增强较慢。小的肿瘤，信号的增强在整个肿瘤中比较均匀。通常增强从周边开始。使用Magnevist造影剂进行核磁共振成像，肿瘤的影像对比度在给入Magnevist后比无造影剂的影像有轻微的增强(图4)。最大增强效果通常在注入30至60分钟后观测到。信号增强度在3小时内逐渐下降并回至给与造影剂之前的水平。单纯Magnevist的药物动力学和T伴Lip阻Magnevist探针表现不同。含Magnevist但无Tf交联的脂质体，相对于Magnevist或TfNIR-LipNBD-Magnevist表现出更弱的信号增强作用。图2)图3图3)图4)四、总结磁性脂质体纳米颗粒作为一种新兴的磁性靶向药物载体。脂质体能够降低药物的毒性，保护被包封的药物，且天然靶向性和通透性良好。磁性纳米颗粒可以提供热疗，磁共振造影MRI等,脂质体与磁导向的基核相结合提高了靶向作用，降低了血管阻塞的危险性，通过进一步偶联抗体可以进一步提高脂质体磁性复合纳米颗粒的特异性靶向能力，最终实现诊疗一体化的作用。除此之外，还有脂质体与银纳米颗粒相偶联等其他做法，总之脂质体纳米颗粒是一类极具开发潜力的药物载体，其