工业微生物菌种保藏技术

第九节工业微生物菌种保藏技术

在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。一、理想的菌种保藏方法应具备的条件(1)

经长期保藏后菌种存活健在；(2)

保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。一、微生物菌种保藏在一定时间内使菌种不死、不变、不乱基本要求：基本方法：生活态休眠态培养基传代培养寄主传代培养冷冻干燥斜面、平板液氮、低温冰箱沙土管、冷冻真空干燥

由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。

对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。国际重要菌种保藏机构中国菌种保藏单位二、工业微生物菌种保藏技术

(1)超低温或在液氮中冷冻保藏；(2)冷冻干燥或真空干燥保藏；(3)

转接培养或斜面传代保藏；(4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。菌种保藏方法暂时保藏法

斜面传代法穿刺法长期保藏法

液体石蜡法甘油管法砂管保藏法砂土管保藏法滤纸片保藏法冷冻干燥保藏法液氮冷冻法

2.1

冷冻保藏

冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。冷冻保保藏种种类一、普普通冷冷冻保保藏技技术(-20℃℃)二、超超低温温冷冻冻保藏藏技术术(-60一-80℃)三、液液氮冷冷冻保保藏技技术普通冷冷冻保保藏技技术(-20℃℃)将液体体培养养物或或从琼琼脂斜斜面培培养物物收获获的细细胞分分接到到试管管或指指管肉肉，然然后贮贮藏于于一冰冰箱的的冷藏藏室中中，或或于温温度范范围在在-5～-20℃的的普通通冰箱箱(-20℃)中。。或者者，将将菌种种培养养在小小的试试管或或培养养瓶斜斜面上上，待待生长长适度度后，，将试试管或或瓶口口用橡橡胶塞塞严格格封好好，同同上置置于冰冰箱中中保存存。用此方方法可可以维维持若若干微微生物物的活活力1—2年。。应注意意的是是经过过一次次解冻冻的菌菌株培培养物物不宜宜再用用来保保藏。。保藏过过程中中应注注意控控制保保藏温温度，，培养养瓶或或试管管应严严格密密封。。这一方方法虽虽简便便易行行，但但不适适宜多多数微微生物物的长长期保保藏。。二、超超低温温冷冻冻保藏藏技术术(-60一-80℃)要求长长期保保藏的的微生生物菌菌种，，一般般都要要求在在-60℃℃以下下进行行保藏藏。在超低低温冷冷藏柜柜中保保藏菌菌种的的一般般方法法是：：1．离离心收收获对对数生生长中中期至至后期期的微微生物物细胞胞；2．用用新鲜鲜培养养基重重新悬悬浮所所收获获的细细胞；；3．加加入等等体积积的20％％甘油油或10％％二甲甲亚砜砜；4．混混匀后后分装装入冷冷冻指指管或或安瓿瓿中，，于-70℃超超低温温冰箱箱中保保藏。。如果待待保藏藏菌种种生长长在斜斜面上上，则则可用用含10％％甘油油的新新配制制液体体培养养基洗洗涤收收获。。超低低温冰冰箱的的冷冻冻速度度一般般控制制在1-2℃／／min。。若干干细菌菌和真真菌菌菌种可可通过过此保保藏方方法保保藏5年而而活力力不受受影响响。三、液液氮冷冷冻保保藏技技术(一)冷冻冻保护护剂在液氮氮冷冻冻保藏藏中，，最常常用的的冷冻冻保护护剂是是二甲甲亚砜砜和甘甘油，，最终终使用用浓度度一般般为甘甘油10％％、二二甲亚亚砜5％。。所使使用的的甘油油—般般用高高压蒸蒸汽灭灭菌，，而二二甲亚亚砜最最好为为过滤滤灭菌菌。(二)液液氮冷冻冻保藏微微生物菌菌种的步步骤1．待冷冷冻保藏藏菌种悬悬液的制制备(1)从从生长斜斜面制备备菌悬液液：每一一斜面加加入5ml含10％甘甘油的营营养液体体培养；；用巴氏氏吸管吹吹吸斜面面制成孢孢子及菌菌体细胞胞悬液；；0.5～lml分装装玻璃安安瓿或液液氮冷藏藏专用塑塑料瓶。。(2)从从浸浸没没培培养养物物制制备备菌菌悬悬液液：：在浸浸没没培培养养液液中中加加入入等等体体积积20%无无菌菌甘甘油油；；轻轻轻轻振振荡荡混混匀匀培培养养液液，，如如果果菌菌体体絮絮凝凝较较紧紧，，则则需需先先用用玻玻璃璃珠珠打打散散；；0.5-lml分分装装玻玻璃璃安安瓿瓿或或液液氮氮冷冷藏藏专专用用塑塑料料瓶瓶，，玻玻璃璃安安瓿瓿用用酒酒精精喷喷灯灯封封口口；；将将所所有有封封好好的的安安瓿瓿置置于于5℃℃冰冰箱箱中中3min，，以以使使细细胞胞和和悬悬浮浮培培养养基基之之间间达达到到平平衡衡。。2．．控控速速冷冷冻冻．．(1)将将安安瓿瓿或或液液氮氮瓶瓶置置于于铝铝盒盒或或布布袋袋中中，，然然后后置置于于一一较较大大的的金金属属容容器器中中；；(2)将将此此金金属属容容器器置置于于控控速速冷冷冻冻机机的的冷冷冻冻室室中中；；(3)以以1-2℃℃/min的的致致冷冷速速度度降降温温，，直直到到温温度度达达到到相相对对温温度度之之上上几几度度的的细细胞胞冻冻结结点点(通通常常为为-30℃℃)；；(4)补补加加一一定定量量的的液液氮氮至至系系统统中中，，使使细细胞胞在在冻冻结结点点时时尽尽可可能能快快地地发发生生相相变变；；(5)细细胞胞冻冻结结后后，，将将致致冷冷速速度度降降为为1℃℃/min，，直直到到温温度度达达-50℃℃；；(6)将将安安瓿瓿迅迅速速移移入入液液氮氮罐罐中中于于液液相相(-196℃℃)或或气气相相(-156℃℃)中中保保存存。。如果果无无控控速速冷冷冻冻机机，，则则一一般般可可将将安安瓿瓿或或液液氮氮瓶瓶置置于于一一70℃℃冰冰箱箱中中冷冷冻冻4h，，然然后后迅迅速速移移入入液液氮氮罐罐中中保保存存。。(三三)复复苏苏1．．从从液液氮氮罐罐中中取取出出所所需需的的安安瓿瓿，，立立即即置置于于冰冰浴浴中中；；2．．迅迅速速将将安安瓿瓿置置于于37-40℃℃水水浴浴中中，，并并轻轻轻轻摇摇动动以以加加速速解解；；3．．用用巴巴氏氏吸吸管管将将安安瓿瓿中中贮贮存存培培养养物物移移接接入入含含有有2m1无无菌菌液液体体培培养养基基的的试试管管中中，，用用同同一一支支吸吸管管反反复复抽抽吸吸数数次次，，然然后后取取0.1-0.2ml(约约4、、8滴滴)转转接接入入琼琼脂脂斜斜面面上上。。2.2冻干干保保藏藏冷冻冻干干燥燥的的基基本本方方法法：：是是通通过过在在减减压压条条件件下下使使冻冻结结的的细细胞胞悬悬液液中中的的水水分分升升华华，，使使培培养养物物干干燥燥。。此法法是是微微生生物物菌菌种种长长期期保保藏藏的的最最为为有有效效的的方方法法之之一一。。冷冻冻干干燥燥过过程程中中必必须须使使用用冷冷冻冻保保护护剂剂，，目目前前国国内内常常用用脱脱脂脂乳乳和和蔗蔗糖糖，，国国外外尚尚有有运运用用动动物物血血清清等等的的。。大部部分分微微生生物物菌菌种种可可以以在在冻冻干干状状态态下下保保藏藏10年年之之久久而而不不丧丧失失活活力力。。而而且且经经冻冻干干后后的的菌菌株株无无需需进进行行冷冷冻冻保保藏藏，，便便于于运运输输。。培养养物物的的冻冻干干过过程程冷冻冻真真空空干干燥燥操操作作流流程程安培培瓶瓶配制保护剂灭菌菌种培养制备菌悬液分装安培瓶洗净烘干装标签加棉塞预冻真空干燥测定水分熔封管口检查真空度包藏(三三)冻冻干干菌菌种种的的保保藏藏与与再再生生1．．保保藏藏：：冷冷冻冻干干燥燥后后的的培培养养物物在在低低于于5℃℃下下保保藏藏。。较较低低的的保保藏藏温温度度(-20～～-70℃℃)对对于于培培养养物物的的长长期期稳稳定定更更好好。。2．．复复苏苏：：(1)在在超超净净工工作作台台中中用用70％％酒酒精精棉棉球球擦擦洗洗安安瓿瓿，，然然后后用用砂砂轮轮在在安安瓿瓿中中锉锉一一道道沟沟。。(2)用用无无菌菌纱纱布布或或无无菌菌毛毛巾巾包包好好安安瓿瓿，，然然后后用用手手掰掰开开安安瓿瓿。。(3)在在安安瓿瓿中中加加入入0.5～～1ml营营养养液液体体培培养养基基，，慢慢慢慢旋旋转转安安瓿瓿，，使使冻冻干干菌菌种种复复水水。。然然后后将将此此转转接接到到一一含含有有再再生生培培养养基基的的无无菌菌试试管管中中，，或或直直接接接接种种琼琼脂脂斜斜面面或或涂涂布布平平板板。。(4)在在指指管管中中冻冻干干的的菌菌种种通通常常为为絮絮粉粉状状，，可可以以将将此此直直接接振振落落入入盛盛有有l～～2ml液液体体培培养养基基的的试试管管中中，，轻轻轻轻振振荡荡5～～l0min，，然然后后用用此此悬悬液液接接种种适适宜宜的的再再生生培培养养基基。。2.3传代代保藏藏将菌种种定期期在新新鲜琼琼脂培培养基基上传传代，，然后后在一一定的的生长长温度度下生生长和和保存存的传传代保保藏方方法。。可用于于实验验室中中若干干菌种种的保保藏。。此法最最为简简单和和经济济，且且不要要求任任何特特殊的的设备备。但此方方法易易发生生培养养基干干枯、、菌体体自溶溶、基基因突突变。。2.3传代培培养法法实验原原理：：保藏藏的菌菌种通通过斜斜面、、穿刺刺或疱疱肉培培养基基（用用于厌氧细细菌））培养养好后后，置置4C˚冰冰箱中中存放放，定定期进行传传代培培养、、再存存放。。可用胶塞塞代替棉棉塞或在在斜面上上覆盖一一层无菌菌液体石蜡来进进一步延延长保存存期。操作方法法1、斜面面保藏法法将菌种转转接在适适宜固体体斜面培培养基上上，待其其充分生生长后，，用牛皮皮纸将棉棉塞部分分包扎好好（棉塞塞换成胶胶塞效果果更好）），置4C˚冰冰箱中包包藏。保藏时间间依微生生物的种种类而定定。霉菌菌、放线线菌及芽芽孢菌保保存2－－4个月月移种一一次，酵酵母菌间间隔两个个月，普普通细菌菌一个月月，假单单胞菌两两周传代代一次。。此法优点点是操作作简单、、使用方方便，缺缺点是保保藏时间间短、易易被污染染。2、液体体石蜡保保藏法将无菌石石蜡加在在已长好好菌的斜斜面上，，其用量量以高出出斜面顶顶端1CM为准准，使菌菌种与空空气隔绝绝。将试管直立立，置低温温或室温下下保存。此法实用且且效果较好好。霉菌、、放线菌、、芽孢菌可可保藏两年年以上，酵酵母菌可保保藏1－2年，普通通细菌也可可保藏1年年左右。3、穿刺保保藏法按穿刺接种种方式培养养菌种，菌菌种长好后后用胶塞封封严，置4℃冰箱存存放。矿物油中浸浸没保藏将琼脂斜面面或液体培培养物浸入入矿物油中中于室温下下保藏，此此方法简便便有效。可用于丝状状真菌、酵酵母、细菌菌和放线菌菌的保藏。。特别对难难于冷冻干干燥的丝状状真菌和难难以在固体体培养基上上形成孢子子的担子菌菌等的保藏藏更为有效效。浸没保藏的的操作要点点是首先让让待保藏菌菌种在适宜宜的培养基基上生长，，然后注入入经170℃下灭菌菌1-2h的矿物油油，矿物油油的用量以以高出培养养物1cm为宜。以液体石蜡蜡作为保藏藏方法时，，应对需保保藏的菌株株预先作试试验。因为为某些菌株株在液体石石蜡下生长长还十分明明显，有些些菌株如某某些假丝酵酵母还会同同化液体石石蜡，也有有的对液体体石蜡保藏藏敏感。所所有这些菌菌株都不能能用液体石石蜡保藏。。为了预防防不测，一一般保藏株株2～3年年也应做一一次存活试试验。2.4载体法实验原理：：使生长合合适的微生生物吸附在在一定的载载体上进行行干燥。常用的载体体有土壤、、砂土、硅硅胶、明胶胶、麸皮、、磁珠和滤滤纸片等。操作方法（（砂土管保保藏法）（1）河砂砂处理取河砂若干干加入盐酸酸10%，，加热煮煮沸30min除去去有机机质质。倒去盐盐酸溶液，，用自来水水冲洗至中中性，最后后一次用蒸蒸镏水冲洗洗，烘干后后用40目目筛子过筛筛，弃去粗粗颗粒，备备用。（２）土壤壤处理取非耕作层层不含腐殖殖质的痩黄黄土或红土土，加自来来水浸泡洗洗涤数次，，直至中性性。烘干后后碾碎，用用100目目筛子过筛筛，粗颗粒粒部分丢掉掉。(3)砂土土混合处理妥当的的河砂与土土壤按3：：1的比例例掺合(或或根据需要要而用其他他比例，甚甚至可全部部作砂或土土)均匀后后，装入10x100mm的的小试管或或安瓿管中中，每管分分装1g左左右，塞上上棉塞，进进行灭菌(通常采用用间歇灭菌菌2--3次)，最最后烘干。。2.4基因工程菌菌的保藏由载体质粒粒等携带的的外源DNA片段通通常是遗传传不稳定的的、且很易易丢失其外外源质粒复复制子。质质粒基因通通常为宿主主细胞生长长非必需。。一般情况下下当细胞丢丢失这些质质粒时，生生长速度会会加快。当培养基中中加入抗生生素时，抗抗生素提供供了一有利利于携带质质粒的细胞胞群体的极极有用的生生长选择压压。而且在在运用基因因工程菌进进行发酵时时，抗生素素的加入可可帮助维持持质粒复制制与染色体体复制的协协调。我们建议基基因工程菌菌应保藏在在含低浓度度选择剂的的培养基中中。不同菌种保保藏方法比比较细菌的保藏藏放线菌菌种种的保藏保藏方法主主要有：沙土管法、、冷冻干燥燥法、液氮氮冷冻法放线菌菌种种的长期保保藏依保藏藏放线菌的的分生孢子子为主要方方式。2.5微微生物活活力和稳定定性测定所有保藏菌菌种的方法法都必须是是长期可靠靠地保持菌菌种的优良良性状不变变。在保藏时定定期检测菌菌种活力，，以确定保保藏培养物物的保藏期期限和保藏藏方法的可可靠性，以以及确定在在实际保藏藏过程中出出现的细胞胞死亡程度度和遗传稳稳定性。对工业微生生物生产菌菌种来说，，建议保藏藏菌种的形形态学和生生化特征(如代谢产产物的产生生、酶活力力、遗传特特征及生化化指标)应应在保藏后后加以检测测和确定。。加速保藏试试验可用于于预测保藏藏过程中保保藏培养物物的稳定性性。在一给给定温度下下通过对高高温下短期期活力丧失失程度检测测，可以用用来预测嗜嗜酸乳杆菌菌的稳定性性。成功的菌种种长期保藏藏方法之有有价值的指指标包括在在保藏6个个月、1年年或更长时时间后存活活百分率(或存活单单位)。细细胞群体的的形态学特特征或一些些特别的生生化特征应应在菌种保保藏前后保保持同一性性，以及实实验室中、、中试车间间中和生产产发酵中产产品滴度的的稳定性，，后者极为为重要。第十节菌种的衰退退与复壮在生物进化化的历史长长河中，遗遗传性的变变异是绝对对的，而它它的稳定性性反而是相相对的；退退化性的变变异是大量量的，而进进化性的变变异却是个个别的。在自然情况况下，个别别的适应性性变异通过过自然选择择就可保存存和发展，，最后成为为进化的方方向；在人人为条件下下，人们也也可以通过过人工选择择法去有意意识地筛选选出个别的的正变体用用于生产实实践中。相反，如不不自觉、认认真地去进进行人工选选择，大量量的自发突突变菌株就就会趁机泛泛滥，最后后导致菌种种的衰退（（degeneration）。在长期接触触菌种的实实际工作人人员中，都都有这样的的体会，即即如果对菌菌种工作长长期放任自自流，不搞搞纯化、复复壮（rejuve-nation））和育种，，则菌种就就会对你进进行“惩罚罚”，反映映到生产上上就会出现现持续的低低产、不稳稳产。这说说明菌种的的生产性状状也是不进进则退的。。菌种衰退的的表现对产量性状状来说，菌菌种的负变变就是衰退退。其他原有的的典型性状状变得不典典型时，也也是衰退。。最易觉察察到的是菌菌落和细胞胞形态的改改变。生长速度缓缓慢，产孢孢子越来越越少。代谢产物生生产能力或或其对宿主主寄生能力力的下降。。衰退还表现现在抗不良良环境条件件（抗噬菌菌体、抗低低温等）能能力的减弱弱等。菌种衰退的的实质菌种的衰退退是发生在在细胞群体体中的一个个由量变到到质变的逐逐步演变过过程。开始时，在在一个大群群体中仅个个别细胞发发生负变，，这时如不不及时发现现并采取有有效措施，，而一味移移种传代，，则群体中中这种负变变个体的比比例逐步增增大，最后后让它们占占了优势，，从而使整整个群体表表现出严重重的衰退。。所以，在开开始时所谓谓“纯”的的菌株，实实际上其中中已包含着着一定程度度的不纯因因素；同样样，到了后后来，整个个菌种虽已已“衰退””了，但也也是不纯的的，即其中中还有少数数尚未衰退退的个体存存在着。复壮的概