丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶活性的测定

丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶活性的测定一、目的要求学习果蔬组织中丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶活性的测定原理和方法。二、基本原理丙酮酸脱羧酶（Pyruvatedecarboxylase，PDC）是作用于α-酮酸的羧化酶的一种，需要以硫胺素焦磷酸为辅酶，同时需要Mg2+和Mn2+的参与。PDC可催化丙酮酸转化生成乙醛。在NADH存在的情况下，乙醛可在乙醇脱氢酶（Alcoholdehydrogenase，ADH）作用下被还原形成乙醇，同时，NADH因为被氧化形成NAD+而减少。已知NADH在波长340nm处具有最大光吸收，因此，通过测定反应体系在340nm处的吸光度值的减小变化，可以测定PDC和ADH活性。三、材料、仪器及试剂（一）材料冬枣、梨、苹果。（二）仪器及用具研钵、高速冷冻离心机、移液器、离心管、水浴锅、容量瓶（100mL、1000mL）、分光光度计、试管。（三）试剂1．100mmol/L、pH6.5MES（2-(N-morpholino)ethanesulfonicacid）缓冲液称取19.52gMES溶于850mL蒸馏水中，用5.0mol/LNaOH溶液调节pH值至6.5，用水定容至1000mL。2．提取缓冲液（含2mmol/LDTT和4%(w/v)PVPP）称取30.8mgDTT、4gPVPP，用100mmol/L、pH6.5MES缓冲液溶解、定容至100mL。3．5mmol/L焦磷酸硫胺素（TPP）称取23.0mg焦磷酸硫胺素盐酸盐（Thiaminepyrophosphatechloride，TPP），用蒸馏水溶解、定容至10mL。4℃保存。4．1.6mmol/LNADH称取11.4mg还原型辅酶I钠（NADH-Na2），用蒸馏水溶解并定容至10mL。4℃保存。5．50mmol/L丙酮酸称取55mg丙酮酸钠，用蒸馏水溶解、定容至10mL，保存于冰箱（4℃）。6．乙醇脱氢酶（ADH）用100mmol/L、pH6.5MES缓冲液配制15个酶活单位（U）的ADH溶液，4℃保存。7．80mmol/L乙醛溶液取1.12mL40%乙醛溶液，用蒸馏水稀释、定容至100mL。8．50mmol/LMgCl2溶液称取476mg无水MgCl2，用蒸馏水溶解、定容至100mL。四、实验步骤（一）酶液提取称取5.0g果蔬组织样品，置于经预冷的研钵中，加入5.0mL提取缓冲液，研磨成匀浆，于4℃、10000×g离心30min，收集上清液用于PDC和ADH活性的测定。（二）丙酮酸脱羧酶（PDC）活性测定反应体系由以下溶液组成：（1）1.5mL100mmol/L、pH6.5MES缓冲液；（2）0.2mL5mmol/L焦磷酸硫胺素溶液；（3）0.2mL50mmol/LMgCl2溶液；（4）100µL1.6mmol/LNADH溶液；（5）0.2mL乙醇脱氢酶溶液；（6）0.2mL酶提取液；（7）200µL50mmol/L丙酮酸溶液。加入丙酮酸后摇匀，立即计时。在反应15s时开始记录反应体系在波长340nm处的吸光度值，每隔30s记录一次，连续测定5min。以蒸馏水作为参比空白进行调零。重复三次。（三）乙醇脱氢酶（ADH）活性测定反应体系由以下溶液组成：（1）2.0mL100mmol/L、pH6.5MES缓冲液；（2）100µL1.6mmol/LNADH溶液；（3）0.2mL酶提取液；（4）200µL80mmol/L乙醛溶液。加入乙醛后摇匀，立即计时，在反应15s时开始记录反应体系在波长340nm处的吸光度值，每隔30s记录一次，连续测定5min。以蒸馏水作为参比空白进行调零。重复三次。五、实验结果与计算1．将测定的数据填入下表重复次数样品重量W(g)提取液体积V(mL)吸取样品液体积Vs(mL)340nm吸光度值样品中PDC/ADH活性(0.01△OD340·min-1·g-1FW)OD0OD1OD2OD3OD4OD5△OD计算值平均值±标准偏差1232．计算结果记录反应体系在波长340nm处的吸光度值，制作OD340值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD340。然后，以每克鲜重（FW）样品每分钟OD340值变化0.01时为一个PDC或ADH酶活性单位（U），则U=0.01△OD340·min-1·g-1FW。