基因工程技术-笔记整理(完整资料)

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基因工程技术：按照人们的愿望,进行严密的设计，通过体外ＤNA重组和转移等技术，有目的地改造生物种性,使现有物种在较短的时间内趋于完善，创造出新的生物类型。基因工程技术笔记整理(完整资料）(可以直接使用，可编辑优秀版资料，欢迎下载）质粒是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1－2０0kｂ不等，为双链、共价闭合环状DNA分子cccＤNA，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中,它具有自主的复制和转录系统。质粒在细胞内的复制一般有二种:紧密控制型（strｉngentcoｎtrｏl）和松弛控制型(relａｘeｄｃontrol）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子；后者在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝。质粒的不相容性：利用共同复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共存.从细胞中分离质粒DNＡ的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DＮA。溶菌酶:破坏菌体细胞壁;SDS和TｒitonX-100:使细胞膜裂解。染色体DＮA通常用于构建基因组文库和Soutｈｅrn杂交等.基因组DNA的提取植物基因组ＤNA提取:提取缓冲液(Ｔrｉs。Cｌ—保持ｐＨ，EDTA,NaCl，ＳＤS），氯仿／戊醇/乙醇溶液—沉淀和抽提DNＡ，异丙醇-沉淀ＤNA(提染色体）,ＴＥ（Ｔｒｉs.Cｌ,EDＴA）-－溶解DNA，RNaｓe—保存液，降解ＲNＡ，NａAC—加盐，70％乙醇—漂洗。细菌基因组DNＡ提取：SDS,蛋白酶K,氯仿：异戊醇(2４:1）——沉淀DNＡ,苯酚：氯仿:异戊醇（25：24:１)-—抽提，70％乙醇-漂洗,TE，NaＣｌ-调节离子强度，RNaｓeA，ＣTAB/NaCｌ溶液-CＴAB--一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，异丙醇/无水乙醇—沉淀上清液.总RNＡ制备ｍRNA的分子结构容易受到RNＡ酶的攻击反应而降解,加上ＲNA酶极为稳定而且广泛存在，因此,在提取过程中应严格防止RＮA酶的污染并设法抑制其活性,这是实验成败的关键。仪器-玻璃器皿:200℃烘2h，塑料器皿：DEPC水液处理-所有器皿最后硅烷化处理.RNA酶抑制剂:DＥＰＣ－—强烈但不彻底，与氨水溶液混合会产生致癌物;异硫氰酸胍－－最有效,使RＮA酶失活；其他—-RNA酶蛋白抑制剂（RNaｓiｎ）SDS，尿素等.细胞内总ＲNＡ制备方法：异硫氰酸胍热苯酚法、酚/SDS法、Trizol法。(均先将组织在液氮中研磨成粉末）异硫氰酸胍热苯酚法：异硫氰酸胍(GIT）与β—巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性，ＧIT与十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)作用使蛋白质变性。酚/ＳDS法：用酚和SＤS破碎细胞和去除蛋白质,用LiCl选择沉淀RNＡ以去除DNA和其它不纯物。Triｚｏｌ法：Trｉzol试剂(含酚、异硫氰酸胍和溶解剂等）。mRNA提取制备mRNA原理:分离的总ＲＮＡ可利用mRNA3’端含有pｏlｙ(A）的特点，用oligo（dT）纤维素柱分离,当RNA流经oｌiｇo（dＴ）纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下，ｍRNＡ被特异的吸附在oｌigo(dT）纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mＲNA被洗下。然后经过两次ｏｌigｏ(dT）纤维素柱，可得到较纯的ｍRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中—７0℃可保存一年以上.（上样buｆfeｒ和洗脱ｂｕｆfｅr).溶液中无盐时要沉淀RNA，必须加盐NaAＣ。琼脂糖凝胶电泳DNA凝胶电泳：琼脂糖——分离DNA片段大小范围广；聚丙烯酰胺－-小片段，分辨力高。琼脂糖凝胶电泳特性：1．DNA分子大小:DNA分子在一定琼脂糖浓度下的迁移率；2。琼脂糖浓度:１.0－1．2％；３。ＤNＡ分子构象:超螺旋DＮＡ最快,线状双链最慢；4．电源电压：不大于5V/cm，负—正;５.染料:溴化乙锭（ＥＢ）--强诱变剂;6.离子强度：0.5＊TBE（不能过高，避免buffer发烫）。RNA凝胶电泳:RＮA分子有很多二级结构,需经变性剂处理，可以破坏ＲNA中的二级结构。然后，用琼脂糖凝胶电泳可分级分离不同大小的mRＮＡ分子。ＲNＡ琼脂糖凝胶电泳方法有三种：乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞（剧毒）琼脂变性电泳.DNA限制性内切酶限制性内切酶：限制性内切酶是指能特异性结合于一段被称为限制性识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链ＤNA.I类酶:结合于识别位点并随机切割识别位点不远处的DNＡ;IＩ类酶:由二种酶分子组成的二元系统（核酸酶—切割、甲基化酶—修饰），其识别位点和切割位点是同一位置；III类酶：在识别位点之外切割DNA分子,然后从底物上解离。甲基化:保护DＮA分子，越活跃的地方，甲基化程度越低。切割性能：回文对称特异核苷酸序列、平末端ＤＮA片段、粘性末端。酶单位:在合适缓冲液和反应温度下,在20ul反应体积中一小时内完全降解1mgDNA所需要的量。载体：把一个有用的目的DNＡ片段通过重组ＤNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具。常见载体:质粒、λ噬菌体、粘粒、BAＣ、ＹAC等。质粒载体的特性:分子量小、多拷贝、松弛控制型；具有多种常用的限制性内切酶的单切点;能插入较大的外源ＤＮＡ片段；具有容易操作的检测表型。pBＲ3２2、ｐUC18／１９（分子量更小、α-互补原理—蓝白筛选、多克隆位点区MＣS)、pＢluｅscripｔSK（+／—)（MCS)。乳糖操纵子:α—互补原理:lacＺ(β—半乳糖苷酶基因）基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体之间可以实现互补的现象.蓝白斑筛选：X—ｇａl－－IPTG（乳糖类似物-诱导剂)—－－——-——蓝色吲哚产物（当外源片段插入后,失去α—互补能力,因而不产生β—半乳糖苷酶,无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色)。λ噬菌体:侵染细菌的病毒（裂解性侵染、溶源性侵染)。【碱性磷酸酶-—活性好,但较抗热和去污剂，在去磷酸化反应后很难去除】细胞转化（tｒansformａtion)是将外源ＤＮＡ分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段（E.colｉ）.【如需将质粒载体转移进受体细胞，需诱导受体细胞产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA．】感受态细胞：受体细胞经一些特殊方法（如CaCｌ２、RbCｌ（KＣl)等化学试剂)处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为能允许外源ＤＮＡ分子进入的细胞状态。【LB培养基不含Amp，设2个对照（防污染）】提高转化效率的因素:细胞生长状态和密度（刚进入对数生长期）、质粒的质量和浓度(DNA溶液体积不超过感受态细胞体积的５％)、试剂质量(最高纯度）、防止杂菌和杂DＮA污染（无菌器皿)。PCR技术的3个步骤：变性：目的双链DNＡ在94℃下解链;退火:两种寡核苷酸引物在适当温度（5０℃左右)下雨模板上的目的序列通过氢键配对；延伸：ＴaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNＡ为模板进行合成。ＰCR反应5要素：引物、模板、酶、ｄNＴPs和Mg2+引物设计原则：１．引物长度:（20ｂp）；2。引物扩增跨度:2ｋb左右最有效;3.引物碱基：G＋C含量4０—60％为宜，ATGC分布均匀，不要集中；4、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补；5.引物３’端的碱基:严格要求配对；６。引物中有或能加上合适的酶切位点;7.引物的特异性：与其他序列无明显同源性；8。扩增产物本身无稳定二级结构（以免产生非特异性）；９。引物量:浓度要控制。模板:可以是DNA或RNＡ，可以是线状或环状。TａqDＮＡ聚合酶：活性半衰期为92.5℃(最后加入）。dNTPs：质量、浓度与PCR扩增效率有关,应保存得当,不好冻融，最好分装。Ｍｇ2+：对PCR扩增的特异性和产量有显著影响，浓度过高，特异性降低,出现非特异性；过低，降低TａqDNA聚合酶活性，使反应产物减少.反应缓冲液:Triｓ.Cl,KCl,和适当浓度的Mg２+。(BSＡ、ＤDT）PＣR反应条件：温度、时间和循环次数。温度:变性：９４℃,退火：Ｔm=4（G＋C)＋2(Ａ+T）,值约低5℃,延伸：7２℃.循环次数：25-30循环。【ＰCR常见问题：无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性】实时荧光定量PCR技术：技术是一种在ＰCＲ反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累通过对PＣR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。检测模式有：Tagman探针和SYＢＲGreenI检测模式.SYBRGreｅnI染料方法：是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料,与双链ＤNA结合后，其荧光大大增强。荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一个值。CT值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ｔagman探针:是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。RＡＰＤ（随机扩增的多态性ＤNA)：运用随机引物扩增寻找多态性DNＡ片段可作为分子标记。原理:利用一系列（通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为1０聚体)为引物，对所研究基因组DNA进行ＰCR扩增，聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离，经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DＮＡ片段的多态性，这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。【DNA提取+选择随机引物—PＣR反应-凝胶电泳—图谱分析】.缺点：图谱中某些弱带重复性较差，信息量小,有假阳性结果等等。差别表达基因分析技术:1.mRＮＡ差异显示技术（DD）２.代表性差示分析技术（RＤA）3．抑制性差减杂交技术(SSH）－-—-提取目标样和参照样;将目标样与残照样杂交得到产物;合并杂交产物；特异性片段扩增—－——该方法能使假阳性率降低到6％4．交互差减RNA差别显示技术（RSDD)。分子杂交相关技术：互补的核苷酸序列通过Waｔsoｎ—Cricｋ碱基配对形成稳定的杂合双链DＮA分子的过程称为杂交.杂交的双方是所使用的探针和要检测的核酸.根据核酸的性质：DNA和ＲNA探针；根据是否使用放射性标记物：放射性和非放射性标记探针；根据是否存在互补链:单链和双链；根据放射性标记物掺入情况：均匀标记和末端标记。1）双链ＤNA探针：其合成方法有－-切口平移法和随机引物合成法。切口平移法：当双链ＤNA分子的一条链上产生切口时，E.ｃoliDＮＡ聚合酶Ｉ就可将核苷酸连接到切口的３’羟基末端。通常使用—-[α-3２P]dＮTP。随机引物合成法：利用E.coliDNＡ聚合酶I的Klenoｗ片段,合成含有标记核苷酸的ＤＮＡ链。具有聚合活性，没有５'至3’外切酶活性,称为Ｋｌｅnｏｗ片段.２）末端标记DNＡ探针：3’末端标记（利用Ｋｌeｎｏw片段及T4ＤＮA聚合酶）和ＤＮA５’末端标记（利用Ｔ４多核苷酸激酶ＰＮK）。AKＰ碱性磷酸酶—去磷酸化３）单链DNA探针：以M13载体衍生序列为模板,用Ｋlenｏw片段合成；以RＮA为模板,用反转录酶合成。4)Dig标记的核苷酸分子杂交：分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用标记的探针和被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RＮA分子所处的位置。Sｏｕthern杂交和Northern杂交。Ｓoｕｔｈerｎ杂交：DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为ＤＮA,探针为DＮＡ或RNA。步骤:酶切、DNA片段转移、预杂交、杂交、显色反应.硝酸纤维素滤膜所得的结果背景较低，但易破裂；尼龙膜较耐用，但所得的结果背景较高。硝酸纤维素膜结合DNA依赖高盐溶液。ＤNA转移方法：毛细管转移、真空转移、电泳转移。Nｏｒtｈern杂交：RＮＡ片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交，被检对象为RＮA,探针为DNＡ或ＲNＡ.影响杂交的因素:核酸分子的浓度和长度、温度、封闭试剂、离子强度。变性，酸处理的目的？基因的原核表达:原核表达系统由原核表达寄主菌及原核表达质粒组成，优点:操作简单、方便、快速、成本低、产量高、纯化容易；缺点:产物多以包涵体形式存在;不含内含子,没有转录及翻译后加工过程,表达产物不能正常修饰；有些表达的蛋白没有活性.基因表达方式：组成型表达(不停的表达目的蛋白）、诱导表达（只有在诱导剂作用下才表达）、融合表达（融合表达标签）、分泌表达（信号肽）、可溶性表达(E.coli).启动子：RNＡ聚合酶以很高的亲和性结合在基因调控区域的特定位子,起始RNA合成的序列。(-10区和－35区）。细菌RＮA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子.原核表达系统中常见启动子及其特点：Laｃ(乳糖启动子）—来自E.ｃoli，一段有方向的核苷酸序列，阻止ＲNA聚合酶的结合而抑制转录；Trp（色氨酸启动子）--－—阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性,阻止转录;Taｃ(乳糖和色氨酸的杂合启动子)—－-－由Lac和Ｔrｐ人工构建的杂合启动子,受Lac阻遏蛋白的负调节;PL（噬菌体的左向启动子)——－－左向转录启动子,受温度诱导（４5℃）、T7噬菌体启动子—－－－来自T7噬菌体,具有高度特异性,只有T7RNＡ聚合酶才能使其启动转录,从而得到表达。T７启动子完全专一受控于Ｔ7

RＮA聚合酶。特点：启动子的作用要强;需表现低水平的基础表达活性;具有简便和廉价的可诱导性.终止子:真核基因或操纵子的3’端往往有特定的具有终止转录功能的核苷酸序列.诱导剂:当有诱导物存在时,诱导物与阻遏蛋白结合，使其构象发生变化,从而阻遏蛋白从DＮA分子上脱落下来，RNＡ聚合酶进入启动子区，可诱导基因的转录.T7表达系统质粒：ｐEＴ—3—52、His－Ｔag（6xＨｉsＴaｇ），pET－4１、42、４9还含有GST-Tａg，kam+orＡmｐ+抗性、Ｈis－Tag(６xＨisＴａg)。ｐET质粒：不移码，不改变基因的阅读框架。多克隆位点BａmHI。pGＥX系：GSＴ（谷胱甘肽Ｓ转移酶）基因融合表达质粒.Amp＋，N—端GST，Thrombｉn（凝血酶）orFａｃtorXa蛋白酶切位点。GST融合表达蛋白的纯化原理：选择能识别并特异性结合GＳT的特定配体，其中GＳＴ的底物—－谷胱甘肽是较佳的候选对象，两者结合后用还原型谷光苷肽的洗脱缓冲液竞争洗脱表达蛋白。。pＢAD系列:Hiｓ-Tａg（6xHis），Ａmp+。ｐDH2:6×Hiｓtag，Aｍp+,ＣolE1复制起点，ＩＰTＧ诱导表达。稀有密码子：有些在真核细胞中常使用的而在原核细胞中很少使用的密码子.原核表达中可能遇到的问题及影响因素：基因特性.基因含稀有密码子（无蛋白表达）、基因GＣ含量（超过7０％会降低蛋白表达水平）、基因或蛋白大小（介于5ＫＤ和1００KD之间）、蛋白亲疏水性（亲-表达量高，疏—难表达）、基因二级结构（抑制翻译的起始）、信号肽(疏水性或毒性，应清除）、表达蛋白比预计的小或用其他小的条带(提前终止,可低温诱导、基因改造）、基因毒性（细胞生长困难,应低温低浓度诱导）、质粒不稳定性(用低温高浓度抗生素)、目的ｍRＮA和蛋白不稳定而表达量低（低温长时表达)、包涵体（为变性的表达蛋白）、培养基ｐH。表达不出来时首先想到换菌株.构建原核表达系统，考虑3大因素：表达载体、宿主菌株、表达诱导条件。Hｉstag融合蛋白纯化的原理：利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子Nｉ2+,Ｚｎ2+，Cu2＋，Ｃo2+,Ｆe3＋发生特殊的相互作用，从而把富含这类氨基酸的蛋白质吸附，达到分离的目的。洗脱目的蛋白有几种方式：咪唑(条件最温和）、pH以及ＥDTA。ＴＣA(三氯乙酸）除去盐酸胍:沉淀盐酸胍、离心、乙醇溶解、离心，得到沉淀为洗脱蛋白,用尿素溶解、透析后保存。基因的真核表达系统:穿梭载体：既能在原核细胞中复制,也能在真核细胞中复制的载体。Weｓternbloｔ(免疫印迹)：将蛋白质凝胶电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质检测技术。原理：蛋白质混合样品经SDS－聚丙烯酰胺凝胶(ＳDS—PAGE）电泳使蛋白质按分子大小分离,将分离的各蛋白质条带原位转移到固相载体膜(NC、ＰVDF膜)上用无关蛋白质封闭液封闭膜的非特异性位点，加入特异性抗体后膜上的目的蛋白与一抗发生特异性的免疫结合反应，洗涤后再加入能与一抗发生免疫结合反应的酶标二抗，最后通过二抗上标记酶的性质进行检测,即根据底物显色的颜色及深浅来探测膜上印迹蛋白抗原的存在与否及含量多少.辣根过氧化合酶（HRP)：来源于植物，用于动物性样品的检测(目的是消除样品中内源性酶的干扰,降低背景）。碱性磷酸酶（AP）：来源于动物牛小肠，用于植物性样品的检测，(目的是消除样品中内源性酶的干扰，降低背景).硝酸纤维素（NＣ)膜：其结合能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关,很脆、易破,但是结合蛋白效率比PDVＦ高。聚偏二氟乙烯(PVDＦ）膜:疏水性，不易破,结合蛋白较牢固，可结合小片段蛋白。SDS中SＤS的作用：强阴离子去污剂使蛋白质变性、亚基解离，破坏蛋白质的四级结构.【蛋白质在电泳分离时，其迁移率主要取决于蛋白质本身所带的电荷多少、分子量大小和形态】.酶标二抗：根据使用的第一抗体选择，如第一抗体为兔抗体，则可使用羊抗兔IｇG抗体，若为鼠源抗体,则可使用羊抗鼠ＩgG抗体或兔抗鼠IgＧ抗体。Weｓtｅｒnblot实验步骤：1．SＤS-PＡＧE电泳2。电转移—湿转法:将膜、胶、滤纸整个组合完全浸入有铂丝电极的转移缓冲液中的蛋白原位电转移体系。胶正膜负,(—）－－＞（＋）。Soutｈernblot地高辛法—转膜－-－—UＶ交联（紫外交联原理)：紫外照射使DNＡ和RNA的一小部分胸腺嘧啶（T）残基与膜表面带正电荷的氨基基团之间形成共价交联。免疫球蛋白（Ｉｇ)：是指存在于人和动物血液（血清）、组织液及其它外分泌液中的一类具有相似结构的球蛋白。抗体(Ab）:动物机体受到抗原物质的刺激后，由B淋巴细胞转化成的浆细胞产生的，能与相应抗原发生特异性免疫结合反应的免疫球蛋白.抗原(Ａg）：能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞(免疫原性）并能与之发生特异性免疫反应（反应原性）的物质。抗原决定簇：存在于抗原分子表面的能够决定抗原特异性的特殊化学基团,是与抗体结合的位点。决定着抗原与抗体发生特异结合的能力。EＬISA：把抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机地结合在一起一种免疫学技术。包被：抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。常用的标记基因和选择基因:生化标记基因、抗性标记基因、营养标记基因。生化标记基因:其表达产物可催化某些易检测的生化反应，导入植物２4－48小时内就可以检测结果,迅速对转基因程序的有关因素进行评价和优化，获得基因表达水平、载体等信息。常用基因:β—半乳苷酶基因（ｌａｃZ）、葡萄糖苷酸酶基因（ＧＵS)、氯霉素乙酰转移酶基因（CＡＴ）、荧光素酶基因（Ｌuｃ）、花青素基因（Aｎｔ)、绿色荧光蛋白基因（GFＰ）。氯霉素乙酰转移酶（CＡT)基因：抑制蛋白质生物合成。应用原理：真核生物没有Cat，Ｃａｔ转化的植物细胞具有对氯霉素的抗性，通过Ｃat的活性检测分析外源基因的表达。活性检测：反应底物乙酰CoＡ.方法:硅胶Ｇ薄层层析法、DＴＮB分光光度法.葡萄糖苷酸酶基因（GUＳ）:染色原理-－Gus可以水解葡糖苷酸，形成葡糖醛酸（兰色)。荧光素酶（Luｃ）基因:在AＴP存在下催化D-荧光素的氧化反应生成氧化荧光素和黄—绿色光.这是一种对植物组织没有伤害的检测方法。花青素（Ant)基因:转入这些基因后，可以在植物组织上生成红色的花青素斑点。此基因不需任何底物就可以检测，但使用局限性大。绿色荧光蛋白（GFＰ）基因:是海洋生物水母体内的一种发光蛋白,经过改造后用于做植物的标记基因,基因产物在兰色光或紫色光下可见绿色荧光。抗性标记基因：抗生素抗性基因、重金属抗性基因、代谢抗性基因。抗生素抗性基因:氨苄青霉素抗性基因(Apr）、四环素抗性基因（Tｅtr)、氯霉素抗性基因（Cmr)、卡那霉素抗性基因(Ｋanｒ）、G４18抗性基因（G４1８r）、潮霉素抗性基因（Ｈygｒ）、新霉素抗性基因（Ｎeor)。筛选基因：选择的基本原理：使未转化的组织或细胞，在含有选择剂的培养基上新陈代谢受阻而停止生长,最后死亡。重金属抗性基因:铜、锌、镉抗性基因。代谢抗性基因：抗除草剂基因。农杆菌介导转化法:普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。原理：根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DＮＡ，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将Ｔ—DNＡ插入到植物基因组中。【人们将目的基因插入到经过改造的T－DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合,然后通过细胞和组织培养技术,再生出转基因植株】。Ti质粒：根癌农杆菌细胞核外存在的一种环状双链DＮＡ分子.温度低于30℃？Tｉ质粒携带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应基因,然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表达,它们只有进入植物细胞后才能表达,Ti质粒上的冠瘿碱分解基因产物却能分解冠瘿碱，为宿主细胞提供能源、氮源和碳源。6大功能区:致癌区、冠瘿碱合成区、冠瘿碱分解区、Ti质粒接合转移区、毒性区、DNＡ复制区。T—DNＡ：在致癌区和冠瘿碱合成区的两侧存在着一个24bp直接重复序列，由这三部分所构成的ＤNA区域叫做T－ＤＮA.Ｔ—ＤNA区域中的这些基因只有在T－DNA插入到植物基因组后才能激活表达。Vir区:毒性区,控制根癌农杆菌附着于植物细胞和Ti质粒进入细胞有关部位。VirE,VｉrD，VirＣ，ＶiｒG,ＶirB，VｉrA（最先激活）。根癌农杆菌对高浓度的创伤诱导分子，即一些酚类化合物具有趋化性,在植物细胞表面附着后,受这些创伤诱导分子的刺激，Ti质粒viｒ区毒性基因被激活和表达.右边界的缺失，使得ＤNＡ合成不能起始，因而T－ＤNA不能释放，所以T－DＮA不能转移到植物细胞。而左边界的缺失，仅会影响DNＡ合成过程的终止。基因枪介导法转化:将核酸直接发送至细胞内的物理学方法。原理：利用火药爆炸或高压气体加速，将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。材料:目的基因、受体组织(愈伤组织）、基因枪轰击金粉包埋试剂盒。高压气体-可裂膜—子弹载膜—子弹—挡网（阻挡可裂膜及载膜的碎片)—培养皿—受体组织ChaｐterIＩntrｏduction什么是基因？基因有哪些主要特点?基因是一段可以编码具有某种生物学功能物质的核苷酸序列。①不同基因具有相同的物质基础．②基因是可以切割的.③基因是可以转移的.④多肽与基因之间存在对应关系.⑤遗传密码是通用的。⑥基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。翻译并解释下列名词genｅtiｃｅngiｎeeｒinｇ遗传工程geｎeengineeｒing基因工程：通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物获得新的遗传性状的操作。geneｍanipulaｔion基因操作：对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。ｒｅcombinaｎtDNAtecｈnique重组DNA技术genecloｎinｇ基因克隆:是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝,在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节。molecularclonｉｎｇ分子克隆什么是基因工程？简述基因工程的基本过程？p２ｐ４简述基因工程研究的主要内容？ｐ５简述基因工程诞生理论基础p2和技术准备有哪些p３?基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？否,密码子简并性举例说明基因工程技术在医学、农业、工业等领域的应用。医学:人胰岛素和疫苗农业:抗虫BT农药工业:工程酿酒酵母ＣｈａpteｒⅡThetoolsoｆｔradｅ什么是限制性核酸内切酶?简述其主要类型和特点?是一种核酸水解酶,主要从细菌中分离得到.类型特点p11II型核酸内切酶的基本特点有哪些p1２—１4?简述影响核酸内切酶活性的因素有哪些p14?解释限制酶的信号活性？抑制星号活性的方法有哪些？什么是DNA连接酶ｐ15？有哪几类p１6?有何不同ｐ１６？什么叫同尾酶、同裂酶ｐ１2？在基因工程中有何应用价值？同裂酶:识别位点、切割位点均相同,来源不同。在载体构建方面往往可以取得巧妙的应用。应用较多的同裂酶比如Ｓma1和Xma1，它们均识别ＣCＣGＧG,但前者切后产生钝末端，后者切后产生粘性末端同尾酶:来源各异，识别序列各不相同,但切割后产生相同的粘性末端。由同尾酶(isｏcａudomeｒ）产生的DNA片段,是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。什么是DNＡ聚合酶？根据ＤNA聚合酶使用的模板不同,可将其分为哪两类？各有什么活性？p17—18聚合酶：在引物和模板的存在下，把脱氧核苷酸连续地加到双链ＤNA分子引物链的3‘－ＯH末端,催化核苷酸的聚合作用。依赖于DNA的DNA聚合酶依赖于RNA的DNＡ聚合酶TaqDNA聚合酶:是一种从水生嗜热菌中分离得到的一种耐热的dｎａ聚合酶,具有5－3聚合酶活性和３-５外切酶活性，在分子中主要用于ＰCR.逆转录酶：RNA指导的DNA聚合酶，Kleｎow片段的特性和用途有哪些？举例说明。p1７名词解释：Ｓ1核酸酶、核酸外切酶、磷酸化酶激酶、甲基化酶：甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主

DNA

不被相应的限制酶所切割。什么是末端脱氧核苷酸转移酶？举例说明其应用之一。P１9加p什么是碱性磷酸酶？其在基因工程领域中有哪些用途？ｐ１9减p质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？目的基因片段与载体由相同的单一限制性核酸内切酶消化酶切后,两者的两端均具有相同的黏性末端，成为单酶切位点的黏性末端。为了防止载体的自我环化，通常用碱性磷酸酶去除载体的粘性末端的5‘p以抑制DNA的自我环化。若构建表达载体选用双酶切切割目的基因和载体,可使目的基因与载体的连接发生定向连接重组，以便定向克隆。gap缺口和nick裂口的区别？用寡核苷酸和衔接物DNＡ的短片段连接时为使基因内部的切点保护,常用何种办法解决?哪些酶可用于DNＡ片段的末端标记？ＫlenｏwDNA聚合酶和T4或T７DNA聚合酶在对DNA片段进行末端补平反应或末端的置换反应时可引入标记的核苷酸.ChaptｅrⅢＨosｔandｖｅｃtors根据来源和性质不同，可将基因工程载体分为哪些种类?质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、噬菌粒载体、病毒载体、人工染色体什么是克隆质粒载体?什么是表达质粒载体？什么是穿梭质粒载体?克隆载体是指专用于基因或ＤＮＡ片段无性繁殖的质粒载体。表达质粒载体是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记,因而可以在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体.基因工程中对载体的基本要求？具有复制子,能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制.②具有合适的限制性内切酶位点。③具有合适的选择标基因。④具有较多的拷贝数,易于宿主细胞的染色体ＤNA分开，便于分离提纯.⑤具有较小的相对分子质量,易于操作。什么是质粒？质粒分哪几种?有哪两种复制类型,质粒的分子生物学特性有哪些?质粒是染色体外能自我复制的小型DNA分子.严紧型和松弛型。①不亲和性②转移性质粒存在的三种形式是什么？共价闭合环状DNＡ②开环ＤNA③线性DNA解释质粒的不亲和性和转移性？不亲和性：两种不同质粒不能够在同一宿主细胞系中稳定地共存。转移性:质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。接合型质粒和非接合型质粒.接合性质粒和非接合性质粒有何区别？接合型质粒：相对分子量大，除了携带自我复制遗传信息外，还带有一套控制细菌和质粒接合转移的基因，严紧型质粒.非接合型质粒：相对分子量小，不能携带接合转移基因。理想的质粒载体应具备哪些条件?具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。②具有多个单一限制性内切酶酶切位点。③具有两种以上标记基因。④具有安全性。简述pBR３２2质粒载体的主要特征?P25构建λ噬菌体载体的主要内容有哪些?为什么野生型的l噬菌体DＮA不宜作为基因工程载体?该如何改造？p２8插入型和取代型基因组大而复杂何为α－互补，在载体构建中有何作用？α-互补：指lacZ基因上缺失近操纵基因区

段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β－半

乳糖苷酶（β—ｇalactoｓidase，由1０24个氨基酸

组成）阴性的突变体之间实现互补。α－互补是基于

在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶阴性的突变体之

间可实现的功能互补而建立的。

将缺失编码第1１—4１位氨基酸的β—半乳糖苷酶基

因称为ｌacZ△M１５基因而将半乳糖苷酶基因（lacZ)

的调控序列和编码β-半乳糖苷酶N端140个氨基酸

的序列称为lacZ’．这两个基因的产物单独存在时

都无酶学活性,但混合在一起时却有酶学活性.所以

在载体上加lacZ’/(MＳC),并在受体菌中引入laｃＺ

△M1５即可实现α-互补．IＰTG是lac操纵子的诱导

物,底物X－ｇaｌ被β—半乳糖苷酶分解后可以产生蓝

色．如果质粒载体中插入了外源ＤNＡ，

laｃZ’的产

物则不能与lａｃZ△Ｍ１５基因的产物实现α-互补,在

IPTG诱导下不能产生有活性的β—半乳糖苷酶,菌

落便不可能呈现蓝色。白色菌落便是含有插入了外

源ＤNＡ的重组质粒。因此可利用菌落颜色变化来筛

选插入外源ＤＮA的重组质粒。

这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主

要是在λ载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β

-半乳糖苷酶的基因片段,携带有lac基因片段的λ

载体转入lacˉ的宿主菌后，在含有5－溴-４-氯—3－吲哚—β－D-半乳糖苷（Ｘ—gal)平板上形成白色的噬

菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。将外源性DNA克隆到-半乳糖苷酶失活的插入型入噬菌体上后，如何筛选重组噬菌体？简述单链DNA噬菌体M13在基因工程中的主要用途？什么是Cos质粒？简述其基本特点。什么是酵母人工染色体、细菌人工染色体、哺乳动物人工染色体？从哺乳动物中分离出复制起始区、端粒及着丝粒构建载体可以克隆大于1０0０Kｂ的DNＡ什么叫插入失活,举例说明之。名称来源特点用途Ｍ13噬菌体载体M13ｍｐ1是构建的第一个M13噬菌体载体，随后构建的一系列Ｍ13载体都是在此基础上经改建派生出来的.可用来克隆具有不同限制末端的外源DNA片段,而且克隆片段插入方向是固定的。１。可以制备单链DNA进行ＤNA序列分析。2。可以制备只与外源DNA的任意一条链互补的DNA探针。3．可以在寡核苷酸介导的基因定点突变来制备含有目的基因的单链DNA模板。黏粒载体（cosmidveｃtor）先用特定的限制性核酸内切酶局部消化真核生物的ＤＮA，产生出高相对分子质量的外源DNＡ片段，与经同样的限制性核酸内切酶切割过的黏粒载体线性DNA分子惊醒体外连接反应。1.具有λ噬菌体的体外包装、高效感染特性。2。具有质粒载体的易于克隆操作。3.具有高容量的克隆能力。４.具有与同源序列的智力进行重组的能力。可以克隆外源DNA分子比较大的。酵母人工染色体由酵母的自主复制序列、着丝粒、四膜虫的端粒、以及酵母的选择性标记组成的能自我复制的酵母线性克隆载体。目前克隆最大DNＡ片段的载体。目前克隆最大ＤNA片段的载体。细菌人工染色体以细菌F因子为基础构建的细菌克隆载体。除去了F因子的转移去及整合区等非复制必须片段,并引入了多克隆位点及选择标记BAC克隆容量可以达到3０0ｋｂ。可用于真核生物重要基因及全基因组物理作图、重要性状基因的图位克隆、基因结构及功能分析。ChａpteｒⅣThｅtechnｉｃalｐrｉnciplｅofgeneｔｉcmanipｕlation简述提取基因组DＮA的主要步骤和原理?分离纯化质粒的方法有哪几种?简述CsCl密度梯度分离法、碱变性法的原理，如何选择合适的分离方法？简述提取ＲNA常用的两种方法和相关原理？列举三种常用的核酸检测方法和基本原理？简述琼脂糖－EＢ电泳法分离纯化DNＡ的基本原理？名词解释：分子杂交、核酸杂交探针切口平移标记探针的主要步骤有哪些？简述Southｅｒｎ印迹杂交的基本原理及其主要步骤?简述Ｎｏrthern印迹杂交的基本原理及其应用？简述Wｅsｔeｒn印迹的基本原理及其主要步骤?简述Saｎgｅｒ碱基顺序分析法的基本原理?简述酵母双杂交技术的基本原理和在基因工程中的应用?简述酵母单杂交技术的基本原理和操作过程？什么是噬菌体展示技术？简述其基本操作过程?什么是ＤＮＡ迁移率变动试验？简述其基本原理？什么是DＮaｓeI足迹实验?简述其基本原理?ＣhaｐterⅤPolyｍerasｅCｈaiｎＲeacｔiｏnTｅｃhｎolｏgyanｄAppｌication什么是PCR技术？简述其基本原理?简述PCR反应体系的主要成分与反应流程？简述PCR引物设计的目的和一般原则？简述提高PCR反应特异性的因素和措施？什么是巢式PCR、降落PＣR、反转录PCR？它们分别有哪些应用？简述荧光定量PCR的基本原理?为什么在定量PＣR中要引入Ct值的概念？CｈaｐtｅrⅥＲNAｉandmｉRNＡｒeｇulation什么是RＮA干扰技术?简述利用RＮA干扰技术沉默基因的基本原理和一般操作流程？什么是ｓiRNA?如何选择siＲＮA靶位点？简述获得sｉRNA的途径有哪些？ChaｐｔerⅦＯbｔａinｉｎgｏftargeｔgeｎｅ目的基因克隆时常用哪些方法分离和获得基因?什么是基因文库？简述构建基因文库常用的载体有哪些？什么是基因组文库？简述构建基因组文库的一般步骤？什么是ｃＤNA文库？简述构建cDNA文库的主要步骤？目的基因与载体的连接方法有哪些？各有哪些优点?基因重组时在两个酶切位点中其中有一个不相匹配时，你如何解决连接问题?如果目的基因的基因结构中有内含子存在，而且要采用原核表达系统，你应如何分离克隆基因？ＣhａpｔｅrⅧＲecoｍｂｉnationandgeｎetｒaｎsｆercDNA克隆较之基因组克隆的优越性体现在哪里？试述T—A克隆法的原理和用途？基因工程宿主菌必需具备哪些特性？名词解释：受体细胞、感受态细胞、转化、转染、转导简述将重组DNA导入原核细胞的方法有哪些？简述将重组DNＡ导入真核细胞导的方法有哪些？外源基因导入植物的方法？Ｔi质粒的结构特点?Ｔｉ质粒介导植物基因转移的过程?ChapteｒⅨScrｅｅningandｉdentificatiｏnｏfrecombinaｎtcｌonｅs如何从所克隆到的基因重组载体中鉴定目的基因的存在和正确性重组子的筛选与鉴定主要有哪些方法？重组子的遗传学检测法主要包括哪两类？简述根据载体表型特征进行重组子筛选的常用方法及其基本原理？如何利用抗性标记基因筛选阳性克隆?名词解释:插入失活效应LａcＺ基因通常用于构建质粒载体的目的和原理?如何利用LaｃＺ标记基因筛选阳性克隆？报告基因检测法筛选重组子对报告基因有哪些基本要求？举例说明重用的报告基因有哪几种?ＣhａpｔerⅩExｐｒｅｓｓiｏnoｆclonｉｎgｇene大肠杆菌作为基因工程受体菌有哪些优缺点？实现真核基因在大肠杆菌表达系统的正确表达需要哪些基本条件？名词解释：启动子、终止子、SD序列、包涵体蛋白质包含体复性的方法有哪些?可使外源基因在大肠杆菌中高水平表达的启动子应具备哪些条件？常用大肠杆菌表达载体有哪些？简述λPＬ启动子表达载体和T7噬菌体RNA聚合酶／启动子表达载体的主要特征？原核表达系统常采用的启动子有哪些？Laｃ、Tａc、tｒp启动子各自有何特点？在大肠杆菌中表达外源基因的表达载体需具备哪些条件？利用大肠杆菌进行外源蛋白质主要有哪几种表达部位？采用相应表达形式有何优缺点?名词解释:融合基因、融合蛋白提高外源基因表达效率一般从那几个方面进行考虑？从提高转录启动效率及翻译起始效率角度考虑，可通过哪些措施构建高效率表达载体,提高外源基因表达效率？避免外源基因表达蛋白被宿主细胞内源蛋白水解酶降解的主要措施有哪些?简述大肠杆菌表达外源基因产物的检测方法有哪几种？与原核细菌相比，酿酒酵母做为外源基因表达受体菌有哪些优点？酵母表达系统有哪些优缺点?酵母基因表达系统主要有哪些基本结构?常采用的选择标记基因有哪些？简述酵母表达载体的种类和主要特征?甲醇酵母表达系统的主要特点？酵母DＮＡ转化的方法有哪几种？酵母菌的蛋白修饰分泌系统有哪些功能？对外源基因的蛋白表达有何作用？根据课堂讨论题目扩增思考题目基因芯片技术的概念、原理和主要的应用?基因治疗的概念与策略？基因治疗的基本程序?转基因动物的概念，显微注射法制备转基因动物的主要过程何谓动物克隆技术?有何应用价值？转基因植物有哪些应用价值？基因工程技术在环境保护中的应用随着科技的发展,人类在为自己生产出越来越多生活资料的同时,产生有害物质的数量和种类也大幅度增加,环境污染已远远超出了自然界微生物的净化能力，已成为人们十分关注的问题.基因工程技术是在DNA分子水平上按照人们的意愿进行的定向改造生物的新技术.而利用基因工程技术提高微生物净化环境的能力是用于环境治理的一项关键技术。这一技术发展到今天,正形成产业化并列为世界领先专业技术领域之一,广泛应用于食品、医药、化工、农业、环保、能源和国防等许多部门,并日益显示出其巨大的潜力。一、基因工程在废水处理中的应用基因工程技术应用于废水处理是水处理领域一项具有广泛应用前景的新兴技术。常规的废水处理方法有物化法、生物法等。由于一般的物化方法只是污染物的转移,不能从根本上治理，且容易造成二次污染,成本也较高，生物法逐渐成为废水处理的主要方法。但是由于废水的多样性及其成分的复杂性，自然进化的微生物降解污染物的酶活性往往有限,如果能利用基因工程技术对这些菌株进行遗传改造,提高微生物酶的降解活性，并可大量繁殖,就可以定向获得具有特殊降解性状的高效菌株,方便有效地应用于水污染处理。因此,构建基因工程菌成为现代废水处理技术的一个重要研究方向,且日益受到人们的重视。基因工程技术在废水处理中的应用有以下几个方面。1、基因工程在环境污染监测中的应用目前,聚合酶反应（简称PCR)技术和核酸探针技术是常用于水环境中微生物的检测技术.PCR技术是一种在体外模拟自然DNＡ复制过程的核酸扩增技术，常用于监测海洋环境中存在的微生物。标记的核酸探针可以用于待测核酸样本中特定基因序列,如监测饮用水中病毒的含量。PCR技术和核酸探针技术可能取代常规的水质分析,发展成为一种快速可靠水体微生物的检测技术,并将在细菌、病毒及其他毒物检测中得以迅速的应用发展。2、基因工程菌对水体中重金属离子的生物富集利用基因工程菌代替普通微生物处理重金属是近年来研究的热点。基因工程技术在重金属废水治理中的作用主要体现在提高微生物菌体细胞对重金属离子的富集容量以及提高菌体对特定重金属离子的选择性两个方面.此法采用生物工程技术将微生物细胞中参与富集的主导性基因导入繁殖力强、适应性能佳的受体菌株内,大大提高了菌体对重金属的适应性和处理效率。2.1提高重组菌重金属离子的富集容量若不考虑重组菌对特定重金属离子的选择性而只要提高重组菌重金属离子的富集容量，则通过在微生物细胞表面表达高容量金属结合蛋白或金属结合肽的方法就能很好地达到目的。另外,将经基因技术在菌体中表达的金属结合蛋白分离后固定在某些惰性载体表面同样也能达到重金属离子高富集容量的目的.２.2同时提高重组菌的富集容量和对特定重金属离子的选择性通过特异性金属转运系统的表达，基因工程菌对目标重金属的富集作用就介于特异性蛋白与目标重金属之间才存在的生物亲和力,具有很高的排他性,与生物吸附法的表面吸附特性完全不同,这就使有效回收利用废水中重金属离子，使废水中重金属元素实现再资源化成为可能.3、基因工程菌降解废水中的有机污染物生物处理法是废水中有机污染物降解的主要方法,但是部分难降解有机污染物需要不同降解菌之间的协同代谢或共代谢等复杂机制才能最终得以降解，这无疑降低了污染物的降解效率。首先,污染物代谢产物在不同降解菌间的跨膜转运是耗能过程，对细菌来说这是一种不经济的营养方式;其次，某些污染物的中间代谢产物可能具有毒性，对代谢活性有抑制作用。因此，将不同种属、来源的细菌的降解基因进行重组，把分属于不同菌体中的污染物代谢途径组合起来以构建具有特殊降解功能的超级降解菌，可以有效地提高微生物的降解能力。4、絮凝降解高效基因工程菌处理染料废水运用生物工程技术把降解菌的基因片段通过转基因工程转入絮凝菌株，培养出具有絮凝和降解双功能基因的高效基因工程菌并应用于染料废水的处理.

进一步的工作是继续构建系列基因工程菌,筛选出絮凝—降解性能好、遗传特性好和成本低的系列双功能基因工程菌株。并将该技术应用于染料生产废水的处理或其它领域。５、基因工程在水产养殖废水处理中的应用伴随着生物技术的发展,水产养殖业越来越多地运用生物工程技术来减少排放量和污染物数量。比如用微生物发酵生产和遗传工程技术将合成特定氨基酸的基因克隆进入微生物的细胞质中，然后借助微生物的增殖来生产蛋白质鱼类饲料，可以提高鱼对饲料的利用率,降低氮的排泄物，减少中氮的浓度；利用生物筛选技术和基因工程培育一些去污能力强的植物（特别是藻类）和微生物来净化水产养殖；利用生物工程对鱼类进行生理修正，使鱼类提高耐污能力和减少排泄物，比如Pheｌｐs培育的鱼类对沙门氏菌属形成抗体，这种鱼类就可以在污染水体中生长。郑耀通等对具有高效净化水产养殖水体的紫色非硫光合细菌进行了分离和筛选，筛选出来的紫色非硫光合细菌既有很强的净水能力，又是鱼类的饲料。目前国内的研究主要集中在光合细菌在水产养殖水体净化中的应用.６、转基因水生植物治理工业废水的重金属污染根据一些藻类等水生物植物具有从水环境中大量积累重金属离子的能力,利用基因工程消除水体中重金属的污染。由北京大学生命科学院蛋白质工程国家重点实验室研究成功的转基因蓝藻，可分别用于吸附并排除水域中重金属镉、汞、铅、镍污染,尤其是水稻、人参、中草药、茶叶等多种出口产品的污染和城市工业污水、矿业污水、电镀污水等，使其达到国际出口标准.此外，还可美化城市街道，防止环境再度污染。目前这项成果已经完成实验室阶段工作，可望尽快推广应用。每公斤转基因蓝藻可吸附1０克以上的汞,已成为国家８６３项目和科技部九五重点攻关项目,并处于国际领先水平。二、基因工程在土壤污染中的应用由于人类的活动,使得污染物进入土壤并积累到一定程度，引起土壤环境质量恶化,对生物、水体、空气和人体健康造成危害。相对于其他环境介质污染，土壤污染具有隐蔽性和潜伏性、长期性和不可逆性,并且土壤对污染物有富集作用。因此对于土壤污染的治理受到了广大人民的关注。主要有以下几方面.1、基因工程技术应用于含油土壤的治理落地油和含油污水对土壤造成了严重污染，大量的油泥,不仅造成严重的环境问题,同时也给石油行业造成重大的经济损失。在生命科学已成为自然科学核心的今天，一批具有特殊生理生化功能的植物、微生物应运而生,基因修饰、改造、基因转移等现代生物技术的渗透推动了污油土壤处理生物技术的进一步发展，因此,利用生物技术进行油污土壤治理，具有广阔的应用前景.美国利用DＮＡ重组技术把降解芳烃、萜烃、多环芳烃、脂肪烃的4种菌体基因链接,转移到某一菌体中构建出可同时降解4种有机物的“超级细菌”，用之清除石油污染，在数小时内可将水上浮油中的2/3烃类降解。在石油开采过程中，采出的原油含有大量水分,原油脱下的废水中，含有大量的石油污染物.全向春引入现代生物技术，从一般的筛选工作，转入到降解代谢途径、降解酶系组成及其遗传的控制机制上来，在此基础上,实现定向育种，定向构建具有高效生物降解能力的基因工程菌。基因工程菌降解效率高、底物范围广、表达稳定,比自然环境中的降解性微生物更具竞争力，例如PCP10３菌株的构建。基因工程菌的构建和应用对于美化环境、保护人类健康提供了一系列可行的途径.现代科学工作者把ＰCR技术用于基因工程菌的构建并已取得了一些成绩，国内外正在进行这方面的研究.随着生物技术的发展，基因工程菌在含油污水处理中的应用将会进一步完善，为人类造福.2、基因工程技术已成功开发出能吞食有毒废弃物的细菌美国加利福尼亚大学的微生物学工作者培育出了一种以PＣＢs(聚氯联苯）为食物的细菌。PＣＢs是一种污染环境的致癌物质，它不能被一般的自然过程破坏,这种从实验室中培育成的细菌被认为是有效解决这一难题的工具.该大学的研究人员是将一种一般土壤细菌(恶臭假单胞菌)的两个菌株的DNＡ进行交换，产生一种杂交的突变菌株。该基因交换菌株能破坏联苯基，而联苯基正是构成ＰＣBs分子的一个关键基因。它由两个苯环组成的,有剧毒，在它们紧密结合时便成为潜在的致癌物。PCBs进入人体后,不能被人体的新陈代谢过程破坏，且能传给下一代。这种物质也能长期保存在土壤中不会被分解.新培育出的这种两个菌株的遗传物质发生交换的突变菌株则能分解PCBs，可使这种有毒害的物质变成无害的物质—-—水、二氧化碳和盐类。３、基因工程在治理土壤中重金属污染的应用全球工业化导致大量的潜在毒性化合物释放并进入生物圈,不仅对环境造成了污染，还会通过食物链对人体产生伤害。一般利用化学和物理方法清除土壤中重金属的污染，通常因为成本太高和破坏环境而不被大规模应用.而通过植物修复来转移，容纳或转化环境污染物可以达到清除污染物，治理环境的目的。植物修复技术是利用植物对重金属的吸收、富集和转化能力把土壤中残存的重金属吸收,富集到植物体内，然后收获植物,从而减少土壤中重金属的含量,实现环境修复的目标。可以利用土壤中天然微生物资源或人为添加的目的菌株,甚至是构建的特异降解功能菌株,将滞留的重金属降解和转化成无害的物质。三、基因工程在农业环保中的应用随着科技的发展，人类在为自己生产出越来越多的生活资料的同时，也向大自然排放了越来越多的有害和难降解物质,例如：农药、化肥等，这些物质正严重破坏环境和危害着人类的身体健康。因此,有意识地利用生物界中存在的净化能力进行生物治理,已渐渐成为环境治理的主要手段。基因工程在农业方面的应用前景是相当广阔的，除、抗虫害，还可能培育出能固氮的转基因作物,能抗旱、抗寒的转基因植物等.主要有以下几个方面。1、基因工程技术应用微生物降解农药农田长期过量施用农药,严重破坏生态平衡，造成土壤水质及食品中残留毒性增加，给人畜带来潜在危害。因微生物在物质循环中的重要作用，因此对环境修复也有着重要作用，然而农药(特别是难降解农药)恰恰限制了微生物的降解能力。应用基因工程原理与技术，对微生物进行改造，构建高效的基因工程菌可以显著提高农药降解效率。利用环境微生物知识中对细菌中的农药降解基因、降解途径等许多农药降解机制的阐述,可构建具有高效降解性能的工程菌。例如，现已开发出有净化农药（如DDT)，降解水中染料以及环境中有机氯苯类和氯酚类、多氯联苯的基因工程菌”。农杆菌得到的OpdA（编码有机磷降解基因)构建原核表达质粒，并转到大肠杆菌正E.ｃoliDHl０B中表达，对其表达产物进行研究，发现OpdA能对几种农药有酶解作用。2、基因工程应用于生物替代合成农药、化肥农作物在生长过程中容易受到致病菌及害虫的影响，因此在作物种植过程中往往需要使用大量的农药控制病虫害，这是造成食物中农药残留及环境污染的主要原因。2．1微生物农药代替合成农药、化肥基因工程技术的发展,为防治农林害虫提供了有效的新技术手段，微生物农药因此在世界范围受到广泛重视。微生物农药是指非化学合成,具有杀虫防病作用的微生物制剂,如微生物杀虫剂、杀菌剂、农用抗生素等,这类微生物包括杀虫防病的细菌、真菌和病毒.微生物杀虫剂对人畜安全无毒,不污染环境；杀虫作用具有一定的特异性和选择性，不会致死天敌和非目标昆虫；易和其他生物手段结合综合防治害虫,维持生态平衡；由于杀虫活性蛋白的多样性，昆虫产生抗性较缓慢;可以通过发酵法生产;生产成本较低；可以通过基因工程技术途径筛选或构建优良性能的菌株来满足生产应用的需要等。科学工作者正在对固氮酶及国氮酶基因进行深入的研究，并利用基因工程技术对固氮酶基因进行修饰改造,一方面提高固氮菌的固氮能力，另一方面扩大能与固氮菌共生的作物种类。随着基因工程技术的发展和对固氮菌分子生物学机理研究的不断深入，将会有越来越多的农作物通过固氮菌的作用直接利用空气中的氮气。从而减少化学肥料的使用量.2．２转基因农作物代替合成农药、化肥利用基因工程技术使作物获得抗病、抗虫的能力是替代合成农药最直接有效的方法.目前。已采用基因工程技术将各种抗病