基因克隆的技术

基因克隆技术摘要：基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。本论文主要从以下几个方面来介绍基因克隆技术：目的基因的获得、目的基因和载体的连接、重组分子的扩增和鉴定。关键词：目的基因；限制性内切酶；克隆；重组分子ABSTRACT:Genecloningtechnologyisthecoreofmolecularbiologytechnology,itspurposeisobtainageneorDNAfragmentsofthecopy,usedforin-depthanalysisthestructureandfunctionofgenes,andmayachievehumancellsandthetransformationofthespeciesgeneticspurpose.Thisthesismainlyfromthefollowingseveralaspectstointroducegenecloningtechnology:thepurposeofthegeneforthepurpose,genesandcarrier,restructuringofthemoleculesconnectedamplificationandidentification.Keywords：purposegene;restrictionendonuclease;clone;restructuringmolecules基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为：分、切、连、转、选。“分”是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。目的基因的获得目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段，。所需目的基因的来源，不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选[1]PCR方法PCRPCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA⑵。聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方.聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加ADNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制⑶。PCR由变性一退火（复性）一延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94°C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40〜60C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72C左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性一退火一延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2〜4分钟，2〜3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍⑷。RT-PCR反转录PCR（RT-PCR）又称为逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术⑷。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。real—timePCR实时荧光定量PCR技术于1996年由美国appliedbiosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规的PCR相比，它具有特异性更强，灵敏度高，重复性好，定量准，等优点，目前已得到广泛应用［员。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR技术不仅广泛地应用于分子生物学的各个研究领域，而且也开始作为一种诊断手段应用于兽医临床。其应用涉及到的范围包括病原体的检测、基因表达的定量和等位基因的鉴定等多个领域［6］。实时定量PCR反应是在带透明盖的塑料小管中，激发光可以直接透过管盖，使其中的荧光探针被激发。荧光探针事先混合在PCR反应液中，只有与DNA结合后，才能够被激发发出荧光。随着新合成目的DNA片段的增加，结合到DNA上的荧光探针，即被激发产生的荧光相应增加⑶。Woo等uh利用SYBRGreenI作为荧光染料建立了一种鉴定钩端螺旋体的方法，利用熔点曲线分析来区别特异产物、引物二聚体和非特异性产物，不需要电泳来鉴定，该方法快速而敏感，整个过程在20min内完成。Jamest51等应用TaqMan探针建立了从小牛腹泻粪便中定量检测水源性寄生虫小隐孢子虫的Cj基因和18SrRNA的方法。Frank等［12］建立了基于TaqMan探针的实时RT-PCR方法，从感染马传染性贫血病毒(EIAV)的马血浆中定量检测EIAV的荷裁量，比竞争性RT—PCR更省事，有更大的检测范围。1.2基因组文库或cDNA文库的构建和筛选将基因组DNA用限制性内切酶消化后插入到适当载体中，得到含有不同插入片段的克隆载体，这种克隆载体的混合物含有长短不同的基因组片段，这就是基因文库。若将细胞内所有mRNA均逆转录成cDNA，然后将所有cDNA片段克隆到适当的载体中，构建成含有不同cDNA片段的克隆载体混合物，这就是cDNA文库。cDNA的合成可用RT-PCR法，也称反转录PCR［9］。它是一种酶促合成法，即以mRNA为模板，在反转录酶的作用下，以4种脱氧核苷三磷酸为材料合成DNA(cDNA),再经复制后即成双链DNA。从真核生物中提取mRNA,由于mRNA后有100-200bp的Poly(A),用与Poly(A)互补的12-18个核苷酸的Oligo(dT)合成的一种组织中所有mRNA对应的cDNA第一链。然后使用末端转移酶在cDNA第一链末端加上多聚C,经变性和水解mRNA后，加入1个末端为多聚G的引物合成其互补链(第二条链)，再经PCR进行大量扩增。因为真核生物的基因由编码的外显子和大量不编码的内含子两种序列组成，用这种方法得到的基因没有内含子，不具有启动子和终止子，所以缺乏功能活性。如果外接一段调节序列，就能在受体细胞中表达，所以此法是克隆真核生物基因的有效方法⑺。自从1970年Temin等发现反转录酶以来，此法已广泛应用于人⑻、猪、田鼠、鸭子。当获得了基因组文库或cDNA文库，可以根据已知的信息合成特异性探针，采用核酸分子杂交的方法从文库中筛选感兴趣的基因片段，这仍是目前获得新基因的一种常用手段。1.3化学合成法制备基因片段采用DNA合成仪，对目的基因进行分段合成，然后进行连接，可以得到所需的目的基因。化学合成法可以改变原始的基因序列，甚至可以合成自然界不存在的序列。在合成过程中可以根据需要改变核苷酸的密码子，如将真核基因序列中不易在E.coli中利用的稀有密码子改成E.coli偏爱的密码子，有利于真核基因在E.coli中的表达。重组质粒的构建DNA体外重组是将目的基因在DNA连接酶作用下，连接到合适的载体DNA上，以便下一步转化之用。这种由两种不同DNA片段重新组合而成的DNA称重组DNA，简称重组体。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4DNA连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连［10］。很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。连接反应的温度在37°C时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12〜16C，连接12〜16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。重组分子的扩增和鉴定3.1重组DNA分子导入受体细胞目的基因和载体在体外连接形成重组DNA分子后，需要被导入受体细胞中才能进行增殖和（或）表达。接受重组DNA分子的细胞称作受体细胞或宿主细胞。受体细胞分为原核细胞（如大肠杆菌）和真核细胞（如酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞）。原核细胞可作为基因复制扩增的场所，也可作为基因表达的场所；而真核细胞一般只用作基因表达系统。受体细胞是重组基因增殖的场所，所以对受体细胞也应具有几点要求：①容易接纳重组DNA分子；②对载体的复制扩增无严格限制；③不存在特异的能降解外源DNA的内切酶体；④不对外源DNA进行修饰。由于载体的不同，所具备的筛选标志不同，所用的受体细胞也不同，因此可根据所用的载体选择合适的受体细胞。一般将重组DNA分子导入原核细胞的过程称为转化，而导入真核细胞的过程称为转染。未经处理的大肠杆菌很难接受外源重组DNA分子，但经物理或化学方法处理后，细菌对摄取外来DNA分子变得敏感了，这种经处理而易接受外源DNA分子的细胞叫做感受态细胞。将重组DNA分子和感受态大肠杆菌细胞相混合，使重组DNA分子进入大肠杆菌中，就可以实现重组DNA分子的转化［10』3.2重组DNA分子的鉴定重组DNA分子导入受体细胞后是否得到扩增，扩增后的重组DNA分子是否正确，导入的重组DNA分子是否含有正确的插入片段，重组DNA分子能否表达插入的目的基因，一般可以采用以下几种方法对重组DNA分子进行鉴定。抗生素筛选可根据所选用载体的特性，尤其是抗药基因的存在与否进行初步筛选。例如载体具有抗氨苄青霉素的抗性基因，若转化后的细胞能在含氨苄青霉素的培养基中生长，说明载体DNA被导入到了受体细胞中并且能够扩增繁殖。但这种筛选并不能说明目的基因一定连接到了载体上。但通过抗药基因的失活筛选可以证明有外源基因插入。X-gal筛选有些载体为了方便筛选，根据细菌乳糖操纵子原理，将LacZ基因构建到了载体的多克隆酶切位点处。如果目的基因连接成功，LacZ基因将由于目的基因的插入而失活，不能产生分解乳糖及其类似物的半乳糖苷酶，菌落在含有X-gal的培养基上呈现白色，无目的基因插入的克隆菌落为蓝色。根据这种特性，可以基本判断重组成功与否。酶切电泳鉴定将重组DNA分子提取出来，用特定内切酶切割重组DNA分子并电泳。如果目的基因被成功地插入到了载体分子中，可以通过目的基因两端的酶切位点将目的基因切割下来，经琼脂糖凝胶电泳即可以判断目的基因的存在与否，这是简便而常用的鉴定方法。序列分析经过初步鉴定后的重组DNA分子往往需要进行目的基因片段的DNA序列分析，通常采用多克隆酶切位点两端的载体序列作为测序时引物的结合位点，即所谓的通用引物。有关DNA序列分析技术将在有关章节详细叙述。一般需要表达的目的基因都必须经过DNA序列分析予以确认。其他方法如采用核酸分子杂交或菌落原位杂交鉴定重组DNA分子，或采用蛋白印迹方法直接检测目的蛋白的表达情况。一些常用试剂的配置在实验过程中，需要配置一些试剂，如LB培养基，琼脂糖凝胶、电泳缓冲液等，具体配置方法如下［13』4.1LB(Luria-Bertani)培养液、平板的配制配制每升LB培养液，应在950ml去离子水中加入：细菌培养用酵母提取物(bacto-yeastextract)5g细菌培养用胰化蛋白月东(bacto-tryptone)10gNaCl10g摇动容器直至溶质完全溶解，用5mol/LNaOH(约0.2ml)调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1L，在高压下蒸汽灭菌20min。LB琼脂平板的配制：先按上述配方配制液体培养基，临高压灭菌前加入琼脂糖15g/L，同法高压蒸汽灭菌20min。从高压灭菌器取出培养基时应轻轻旋动以使熔解的琼脂糖能均匀分布于整个培养基溶液中，应使培养基降温至50°C时，加入抗生素等不耐热的物质。4.2琼脂糖凝胶的配制根据所需凝胶的浓度称取琼脂糖，加入相应电泳缓冲液中，用微波炉加热煮沸至琼脂糖完全溶解，加入适量TAE混匀，适当冷却后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，凝胶厚度不超过梳孔。4.3电泳缓冲液Tris-乙酸（TAE）：50X浓贮存液（每升）：242gTri碱57.1m、冰乙酸100ml、0.5mmol/LEDTA（pH8.0）使用时再稀释50倍。Tris-磷酸（TPE）：10X浓贮存液（每升）108gTri碱15.5ml、85%磷酸（1.679g/ml）40ml、0.5mmol/LEDTA（pH8.0）使用时再稀释10倍。Tris-硼酸（TBE）：5X浓贮存液（每升）：54gTri碱27.5g、硼酸20ml、0.5mmol/LEDTA（pH8.0）使用时再稀释10倍。30%丙烯酰胺：将29g丙烯酰胺和1gN,N'一亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中，加热至37C溶解之，补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器（0.45孔径）过滤除菌查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温。1mol/LCaCl:2在200ml纯水中（Milli-Q水或相当级别的水）溶解54gCaCl2-6H2O，用0.22滤器过滤除菌，分装成10ml小份贮存于一20C。2.5mol/LCaCl:2在20ml蒸馏水中溶解13.5gCaCl2-6H2O，用0.22滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于一20C。1mol/L二硫苏糖醇（DTT）：用20ml0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09gDTT，过滤除菌后分装成1ml小份贮存于一20C。0.5mol/LEDTA（pH8.0）：在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na-HO），在磁力2搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0，然后定容至1升，分装后高压灭菌备用。漠化乙锭（10mg/ml）：在100ml水中加入1g漠化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。10%十二烷基硫酸钠(SDS)：在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68°C助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加入水定容至1L，分装备用。总结在分子生物学中，基因克隆是一种常用的技术。其中关键技术是DNA重组技术，它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。有目的地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。本论文主要介绍了基因克隆技术的几个重要过程。参考文献：萨姆布鲁克J.,E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯，著.分子克隆实验指南[M].北京:科学出版社，1999:60-75.董明，宫月华，王兰，等.DNA提取的应用与相关技术分析[J].遗传，2003,25(