动物免疫学实验技术-免疫PCR技术

PAGE·PAGE5·第二十六章免疫PCR技术(Immuno-PCRtechnique)概述（一）免疫PCR技术的概念免疫PCR是一种抗原检测系统，将一段已知序列的DNA片段标记到抗原抗体复合物上，再用PCR方法将这段DNA扩增，然后用常规方法检测PCR产物。免疫PCR集PCR的高灵敏度与抗体和抗原反应的特异性于一体。其突出的特点是指数级的扩增效率带来了极高的敏感度，能检出浓度低至2ｎｇ/Ｌ的抗原物质，为现行任何一种免疫定量方法所不及。（二）免疫PCR体系的组成免疫PCR体系由待检抗原,特异性抗体,连接分子，DNA和PCR扩增系统。1．待检抗原被检测的样品可以是抗原，或者是作为抗原的某种抗体。待检的抗原可以直接吸附于固相(包被抗原)，这一过程与ELISA试验是相同的。2．特异抗体免疫PCR中的特异性是对应于待测抗原，与ELISA一样，抗体的特异性和亲和力将影响免疫PCR的特异性和敏感性。一般均选用单克隆抗体，这个抗体常采用生物素标记，通过亲和或叶绿素再结合DNA。3．连接分子连接分子是连接特异抗体与DNA之间的分子。Sano等用链亲和素/蛋白Ａ(striptavidin-proteinA)基因工程融合体作为连接分子来连接生物素标记的DNA与抗体，此种融合蛋白的链亲和素部分可识别DNA上的生物素，蛋白部分可识别抗体的Fc段。4．DNA和PCR系统免疫PCR中的DNA是一指示分子，用DNA聚合酶将结合于固相上的DNA特异放大，由此定量检测抗原。免疫PCR的敏感性多于ELISA主要是应用了PCR强大的扩增能力。免疫PCR中的DNA分子可以选择任何DNA，但要保证DNA的纯度，且有较好的均质性，尽可能不选用受检样品中可能存在的DNA。一般可选用质粒DNA或PCR产物等。DNA的生物素化是用生物素标记的dATP或dUTP通过聚合酶标记在DNA分子上，一般是1个分子DNA标记2个生物素，标记率可达百分之百。免疫PCR的PCR扩增系统与一般PCR一样,主要包括引物、缓冲液和耐热DNA聚合酶。（三）、免疫PCR产物的检测PCR扩增产物一般先用琼脂糖凝胶进行电泳，然后经嗅化乙啶染色，再照相记录PCR产物的电泳结果，通过底片上PCR产物的光密度可以得出PCR产物的量，即代表固相上吸附的待检抗原量，将其与标准抗原制备的标准曲线进行比较就可以准确地得出抗原的实际量。二、免疫PCR技术应用（一）材料与方法生物素标记特异性抗体的制备免疫球蛋白（如IgG、IgM）的Fc片段上有糖基存在，因而可用能与糖基结合的Biotin-hydrazide作生物素标记。（1）将纯化的抗体（IgM或IgG，0.1~1.0ml）在标记缓冲液（0.1Mol/LNaAc，pH值5.5，0.1Mol/LNaCl）中4℃透析过夜。（2）吸取0.5ml至微量离心管中，加过碘酸钠溶液至终浓度为10mMol/L，置冰浴上于暗处孵育30min，使抗体分子上的糖基氧化。（3）将氧化的抗体过PBS平衡的SephadexG25PD-10预装柱，使之与过碘酸钠分开。收集蛋白峰。（4）向抗体管中加入Biotin-LC-hydrazide(Pierce)至终浓度5mMol/L，置混摇器上室温孵育1h。（5）用含0.02%NaN3的PBS平衡SephadexG25预装柱，将生物素标记的抗体分子过柱与游离的生物素分开。收集蛋白峰，保存-20℃。生物素标记DNA片段的制备作为将与抗体偶联的报告DNA片段，应确保在待测抗原来源的机体DNA中无同源序列，如可选用大肠杆菌的序列作为报告DNA去检测人源的标本。DNA片段大小为300~500bp，生物素标记可采用PCR方法，根据报告DNA的核苷酸序列合成一对引物，其中一个引物的5’端碱基上带有生物素标记。在0.5mlPCR管中按表25-1将下列试剂混合。表25-1PCR系统组成试剂添加量终浓度10×PCR缓冲液10.0ul1×2.5mMol/L4dNTP混合物8.0ul0.2mMol/L50uMol/L生物素标记的上游引物1.0ul0.5uMol/l50uMol/L生物素标记的下游引物1.0ul0.5uMol/l15mMol/L模板DNA1.0ul1.0ugTaqDNA聚合酶1.0ul5U加水至100uL混匀后上面覆盖液体石蜡。95℃加热5min，然后在PCR仪上按下列程序扩增：94℃1min;55℃1min;72℃1min;40个循环。最后72℃延伸10min。加等量酚-氯仿抽提，然后加10ul3Mol/LKac，250uL无水乙醇，置-70℃30min。离心沉淀DNA片段，用70%乙醇洗一次。将沉淀DNA干燥后溶于TE缓冲液中，保存在-20℃。制备抗体-亲和素-DNA复合物将生物素标记的抗体与亲和素按等分子浓度混合于含有1mg/mlBSA的PBS中，室温孵育30min，再加入两倍分子浓度的生物素标记的DNA片段，继续孵育30min，最后加入10倍分子浓度的生物素，将亲和素分子上的结合部位饱和。最后过凝胶过滤柱将复合物与未结合的单体分开，加入BSA达1mg/ml，分装后冻存于-20℃。4.免疫PCR按常规ELISA方法，用饱和缓冲液稀释抗原，加到96孔塑料板或0.5mlPCR管中，4℃过夜。用PBS洗三次，然后每孔加200ul封闭液（PBS含10mg/mlBSA，1mg/ml鱼精DNA），室温孵育30min。用TETBS（其配方：20mMol/LEDTA，0.02%NaN3）洗三次。将抗体-亲和素-DNA复合物稀释于含有1mg/mlBSA和0.1mg/ml鱼精DNA的TETBS中，每孔加50ul，室温孵育1h。用TETBS洗5次，然后将塑料板或管倒置在吸水纸上拍打以控干水分。每管中加50ulPCR反应液，含有表25-2成分：表25-2PCR反应液试剂添加量终浓度10×PCR缓冲液5.0μl1×2.5mMol/L4dNTP混合物4.0μl0.2mMol/L50uMol/L生物素标记的上游引物0.5μl0.5μMol/l50uMol/L生物素标记的下游引物0.5μl0.5μMol/l15mMol/LMgCl25.0μl1.5μgTaqDNA聚合酶0.5μl2.5U加水至50μL混匀后上面覆盖液体石蜡。95℃加热5min，然后在PCR仪上按下列程序扩增35个循环：94℃1min;55℃1min;72℃1min。最后72℃延伸10min。每管取5ul作琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙锭染色后观察结果，如在PCR时加入了放射性核素标记，则可用X光片显影。亦可在凝胶电泳后做Southern-blot，用特异性探针杂交，进一步提高其特异性和敏感性。三、注意事项本实验的关键步骤是获得适当的抗体-DNA复合物。用链亲和素将生物素标记的抗体与生物素标记的DNA偶联的方法，因每个链亲和素分子可与四个生物素分子结合，因此要优化反应条件，以使得每个链亲和素分子既能结合上抗体分子，又能结合上DNA片段。此外，还可用化学方法将DNA片段与抗体分子共价偶联，即将抗体分子和5’端氨基酸修饰的DNA片段分别用不同的双功能偶联剂激活，然后通过自发的反应偶联到一起，比如，用N-Succinimidyl-S-acetylthioacetate(SATA)活化氨基修饰的DNA片段，用Sulfo-Succinimidyl4-(maleimidomethyl)Cyclohexane-1-Carboxylate(Sulfo-SMCC)修饰抗体分子，然后将二者在一小管中混合，通过加入盐酸胲（Hydroxylaminehydrochloride）使二者偶联在一起。免疫PCR具有高敏感性。因此，抗体和标记DNA的任何非特异性结合均可导致严重的本底问题。因而在加入抗体和标记DNA后必须尽可能彻底地清洗。即使有些特异性结合的抗体或标记DNA被洗掉了，亦可在最后通过增加PCR的循环次数得到弥补。此外，应用有效的封闭剂对防止非特异性结合也是非常重要的。可用脱脂奶粉和牛血清白蛋白做蛋白封闭剂，用鱼精DNA做核酸封闭剂。防止本底信号的另一个重要因素是控制污染，这也是所有敏感的检测系