蛋白质纯化方法及问题解答

蛋白质纯化一.可溶性蛋白的纯化方法粗分离中度纯化精细纯化AC++IEX+++GF+.盐析硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白，可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清继续加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。.亲和纯化TagSize(aa)Capacity(mg/ml)MW(kDa)CleavageElutionHis6401TEV/ThrombinImidazoleGST2181026Thrombin/PreScissionGlutathionereducedMBP3961042.5TEVmaltoseStrep(II)861NoneeddesthiobiotinFlag80.61NoneedFlagpeptideNi柱纯化Ni柱纯化操作流程.蛋白质上清与Ni柱填料在4℃下进行充分旋转混合（三60min）；也可以让上清液缓慢流经Ni柱（三6sec/drop）o.上清与填料混合后，低速离心（W500xg）,吸去大部分上清，然后将填料悬起，加入柱子中。也可以直接上柱。.上样后先用5-10柱体积（CV）的lysisbuffer冲洗不结合的杂蛋白，然后再用低浓度的咪唑洗去弱结合的杂蛋白。在不知道清洗条件时可以进行咪唑浓度梯度洗脱（如10,20,30,40,50mM）,然后在纯度和得率之间选择最合适的咪唑浓度来进行清洗。.清洗结束后，用高浓度咪唑（如200mM）洗脱目的蛋白质。.洗脱下来的目的蛋白质除电泳留样外，透析除去咪唑，并换成下一步所需的buffero.一般情况下histag不需要切除。当需要切除时：TEV：咪唑对其没有影响，可以在洗脱后直接酶切。100OD280的蛋白质最少可用1OD^的TEV切过夜，温度20或4℃（20℃的效率是4℃8的三倍）。Thrombin：必须先除去咪唑才能进行酶切。在1xPBS中，10U/mg蛋白质，4或20℃酶切过夜。可适当加大酶量或延长酶切时间。Ni柱纯化注意事项.新的Ni柱填料存放于20%乙醇中（体积约为1:1）。在取用前，请先估算目的蛋白质的量，再决定取用的填料体积（Qiagen的Ni-NTASuperflow最大结合能力为30mgprotein/mlbeads）。填料用量不要大大超过所需量，不然会结合较多的杂蛋白，难以清洗干净。.新填料使用前，要先进行处理和平衡。填料先用ddHO冲洗，除去乙醇。再2用至少5CV的buffer进行平衡。.在使用前后，要注意不能让填料放干，不然会影响纯化的效果。.每次使用结束后，填料用高浓度咪唑（如500mM）清洗，再用ddHO清洗，2最后保存在20%乙醇中。.不推荐Ni柱在柱酶切，这样效率很低。.多次使用后填料需再生。再生步骤为：5CVHOf3CV2%SDS-1CV225%EtOHf1CV50%EtOHf1CV75%EtOHf5CV100%EtOHf1CV75%EtOHf1CV50%EtOHf1CV25%EtOHf1CVHOf5CV1002mMEDTA,pH8.0fH2Of2CV100mMNiSO4f2CVH20f20%EtOH。Q&A.目的蛋白质挂柱能力差？可能是由于所用buffer中含有过多的detergent或还原剂如-ME等。Ni柱填料和试剂兼容性请查阅手册。还可能是由于蛋白质折叠不正常，或折叠时将histag包裹在内所致。可以采用的方法是：1）控制破菌条件，不可以过于剧烈；2）改变buffer条件，可能有利于蛋白质折叠稳定；3）将histag构建到蛋白质另一端。.杂蛋白很多，无法清洗干净？解决方案有：采用更高浓度的咪唑进行清洗；在破菌或结合时加入少量咪唑（如10mM）；减少填料使用量。.蛋白质洗脱不下来？解决方案有：采用更高浓度的咪唑进行洗脱；更换buffer。.蛋白质发生降解？更换蛋白质抑制剂，或多种抑制剂混合使用；截取其它truncatesoGST柱纯化GST柱纯化操作流程.蛋白质上清与GST填料在4℃下进行充分旋转混合，或可以让上清液缓慢流经GST柱（三6sec/drop）；.在充分混合后，将混有填料的上清load上柱子;.用大量的lysisbuffer（1xPBS）清洗GST柱，至没有杂蛋白流出（用bradford检测）；.新鲜配制洗脱液：50mMTris-HCl,10mMreducedglutathione,pH8.0。将5-10CV的洗脱液加到柱子上，静置一段时间（如10min）,再缓慢流出（三6sec/drop）。.洗脱后酶切：洗脱后的GST融合蛋白质溶液先透析除去reducedglutathione,然后加入PreScission或Thrombin进行酶切。.在柱酶切：在洗脱之前，吸取beads,500xg离心5min,弃上清。然后加入酶液，进行酶切。PreScission：酶切buffer：50mMTris-HCl,150mMNaCl,1mMEDTA,1mMDTT,pH7.5。10U/mgprotein,5℃酶切4hr。可适当加大酶量或延长酶切时间。Thrombin：在1xPBS中，10U/mgprotein,4或20℃酶切过夜。酶切结束后，用3-5CV的1xPBS冲洗柱子，收集目的蛋白质。最后用洗脱液清洗beads上残余的GST和GST融合蛋白。GST柱纯化注意事项GE的GlutathionSepharose4BFastFlow最大结合能力为10mgprotein/mlbeads。GST填料使用前用至少5CV的buffer平衡，buffer的pH范围为：6.5—8.0。GST填料机械强度较差，所以在混合时要注意控制力度和时间。洗脱后，GST填料可用6M盐酸胍或8M尿素清洗，再生。然后用ddH2O清洗后浸泡在20%乙醇中。Q&A.目的蛋白质挂柱能力差？解决方案有：1）保证充分混匀；2）检测蛋白质溶液的pH值是否在合适范围内;3）检查蛋白质溶液是否加入过多的DTT（＞1mM）。.目的蛋白质无法洗脱？提高reducedglutathione浓度，但注意不要改变pH值；延长洗脱时间，并不定期吹打；在洗脱液中加入一些非离子型detergents如0.1%TritonX-100。.GST切不下来？一般情况下，洗脱后酶切比在柱酶切效率高，所以选择洗脱后酶切；可以提高酶的用量，升高酶切温度，延长酶切时间；更换相应载体，用另一种酶进行酶切。IgG纯化纯化操作流程如下：制备单克隆抗体.购来F1代小鼠，或Bab/c小鼠，饲养一周；.腹腔注射Plaston200ul/只，饲养10天；.将特定细胞注入腹腔；.一周起观察小鼠腹水的产生的情况，随时采集腹水。2.3.2.硫酸核沉淀.取来的腹水用生理盐水以1:1比例稀释；.稀释后腹水用滤纸过滤，去除脂蛋白及杂质，得到澄清的上清溶液；.在上清中缓慢地边搅拌边加入等体积硫酸镂饱和溶液（4℃下操作）；.随硫酸镂加入量的增加，溶液逐渐变混浊，加完后再搅拌10min左右，4℃过夜；.将放置过夜的悬浊液4℃,7000rpm离心20min,弃上清，得到乳白色沉淀;.用适量50%硫酸镂重悬沉淀，重复以上操作一次，沉淀-30℃保存备用。亲和层析.将经20mMPBS,pH7.4透析过夜的腹水与ProteinA混合过夜；.将混合过夜的样品上柱，收集流出液；.用20mMPBS，pH7.4buffer洗柱子，约10个柱体积；.用0.1M甘氨酸pH3.0洗脱，洗脱前预先在每个EP管中加入50ul中和溶液（2MTris）。.OD280读数；.亲和力好的，将流出液与ProteinA重新混合，4℃过夜，准备第二次、第三次纯化；亲和力不理想的，将流出液再与ProteinG混合，4℃过夜；.电泳鉴定。IgG的Fab片段的获得木瓜蛋白酶酶切方法.酶切体系如下：0.5MEDTA1ulMcystine100ulmg/mlpapain6ul酶切缓冲液1767ul（0.1MNaAc,1mMEDTA,用醋酸调pH值至5.5）37℃激活10min；.在上述酶切反应体系中加入16mg/ml的mAb共126ul,反应总体积为2ml,将反应液于37℃酶切5hrs；.封闭：避光加入92mg/mllodoacetamide（IIA）（碘乙酰酶）326ul,避光反应40min；.透析：对20mMTris-HCl,pH8.9,更换2次。.3.4.2.阴离子交换柱（5mlQFF柱）纯化Fab片段阴离子交接缓冲液：BufferA：20mMTris-HCl，pH8.9；BufferB：20mMTris-HCl，pH8.9，1MNacl(含0.02%NaN3)o以50min时间梯度达至100%bufferB；约4分钟后开始出现蛋白峰，其中峰1为Fab，如下图所示。.凝胶过滤ColumntypeFractionationrange(Da)VC(ml)AlarmPressure(MPa)flowrate(ml/min)Recommendedsamplevolume(Ml)Superdex7510/300GL3to70241.50.7100Superdex20010/300GL10to600241.20.5100HiLoad16/60Superdex75pg3to701200.31500HiLoad16/60Superdex200pg10to6001200.31500操作流程（配合AKTA操作）.在使用分子筛之前，请先确定目的蛋白质在过分子筛的buffer中是稳定的。如果目的蛋白质所处的buffer和过分子筛的buffer有所不同时，请确定在溶液改变过程中目的蛋白质不会发生沉淀。否则，不可以进行凝胶过滤操作。.根据蛋白质的分子量大小、总量、总体积和实验目的，选择合适的分子筛进行实验。24ml分子筛价格较高且使用寿命较短，所以它仅用于定性分析或蛋白质提取困难且总量较少时的纯化，不可以用于大规模纯化。.使用者用自己的账户登录，将分子筛分子筛连接到AKTA上，先后用新鲜配置并除气的ddHO和buffer平衡柱子（至少1.5CV），至基线走平。2.蛋白质样品上样前必须高速离心13000rpmx10min，取上清上样。.在出峰时进行样品的收集。收集前要注意收集臂的摆放位置，收集时也要注意是否发生跳管等现象，如果发生，请跟管理员联系。.蛋白质样品流出后，请继续用buffer走到1.5CV，然后再用ddHO和20%乙醇清洗柱子。 2.请随时注意所用溶液是否足够。建议设置pausetime或endtime，以防溶液使用光，空气进入分子筛。.在清洗结束后，将分子筛柱从AKTA上卸下来，然后退出账户，收拾好仪器和台面，并进行登记。注意事项.使用分子筛柱子前，务必看清分子筛使用条例和各参数设置，尤其是Alarmpressure和flowrate。（为保证分子筛重复性和使用寿命，使用时不得大于下表规定的flowrate）.每次使用后，除非当天有人接着使用，否则必须先后用ddHO和20%乙醇清洗柱子（至少1.5CV），二者均为新鲜配制，并过滤、除气（24小、时以内配的）。.每一根柱子，每使用10次之后，由第10次的使用者进行处理：在用ddHO2洗后，用胰酶（最高浓度为5%）清洗1CV后，浸泡过夜，然后再先后用ddHO2和20%乙醇清洗至少1.5CV。.每个使用者必须在该分子筛柱所属的组以及AKTA所属的组的登记本上分别登记。登记时，请记录分子筛柱最后的流速、压力值和所处的溶液。实验中如果遇到任何不正常的现象，也请清楚地记录下来或告知管理员。.原则上24ml分子筛每使用20次需更换筛内顶部过滤膜。如果发现24ml分子筛顶部出现水柱，必须立即告知管理员更换筛内顶部过滤膜。Q&A.如何用分子筛测定蛋白质的分子量？24ml分子筛可以用于分子量大小的测定。如果仅用于参考，可以根据自己蛋白质出峰的峰尖位置在《080807体积排阻法.xls》中查询。如果需要精确的测定，必须在对目的蛋白质操作前，自己进行蛋白markers的标定。标定的方法请参考《080807体积排阻法.xls》。.蛋白质上样后没有蛋白质流出？确定蛋白质样品和所有操作是否正确;检查管道连接是否正确，接头是否漏液等。.蛋白质没有有效分离？可能蛋白质状态不佳，形成多种聚集状态火和杂蛋白非特异结合。可以尝试更换不同的buffer，让蛋白质状态更加稳定。.离子交换填料的选择阴离子交换剂阳离子交换剂离子强度pH范围QS或SP强广DEAE或ANXCM弱窄分辨率由低到高：SepharosefSepharoseFastFlowfSource30fSource15fMonobead选择方法：.在纯化的不同阶段（粗中精）选择不同分辨率的填料（低到高）；.如果目的蛋白质pI未知：使用强离子交换剂检测其选择性；.如果目的蛋白质pI已知：buffer的pH值高于pI时选阴离子，反之选阳离子交换剂。操作流程（配合AKTA操作）.准备缓冲液：bufferA，bufferB（Acontaining1MNaCl），分别放入A，B泵头；.上样前，用5-10CV的bufferA平衡柱子；.上样：用不高于0.2ml/min的流速上样；.上样后清洗：用5-10CV的bufferA清洗柱子；.梯度洗脱：初次实验时，线性梯度0-100%Bin10-20CV；根据目的蛋白质出峰位置以及各峰的分布情况，可台阶式拉梯度，优化纯化效果；.高盐清洗：用100%B清洗5CV，以除去紧密结合的蛋白质；.最后用bufferA清洗10CV，再分别用ddHJ和20%乙醇清洗，竹子保存在20%乙醇中。注意事项.离子交换是结合技术，样品体积无关。样品可采用低浓度、慢流速的方法上样，也可以反复多次上样，以便目的蛋白质能充分结合；.选择合适的pH值buffer,如果纯化效果不理想，可尝试改变pH值；.选择得到可接受分辨率的最陡梯度，和最快流速，以减少分离时间；Q&A.蛋白质在上样过程中流出？可能原因有：填料选择不合适，尝试其他填料的交换柱；上样流速过快，可降低流速或多次重复上样；样品浓度太高，可增大样品体积以减小浓度。.目的蛋白质形成多个峰流出？可能是蛋白质状态不均一所致。高分辨率的离子交换技术可以用于不同修饰状态如磷酸化的蛋白质。目的蛋白质形成多个峰，可能是分离出不同修饰状态的蛋白质。二.变复性.在柱复性.细胞裂解液18,000rpm于4℃离心15min，收集沉淀。.在破菌buffer中补加低浓度的尿素(300-400mM)或盐酸胍(200-300mM)，将沉淀重悬混匀，18,000rpm于4℃离心15min，收集沉淀。重复操作一次。.用8M尿素或者6M盐酸胍溶液溶解沉淀(其中加入适当的缓冲液，保持pH8.0)，还可其中补加适量DTT和NaCl等(不可含EDTA)。沉淀完全溶解后，18,000rpm于4℃离心15min，收集上清。.下面的步骤在AKTA上进行，复性溶液的具体成分每个蛋白需要进行摸索：利用HiTrapChelatingHP柱子。先0.1MNi2sO43CV上镍，用变性溶液平衡好柱子。.上样：收集的上清0.3ml/min上柱。.洗涤：分别用不含咪唑和含低浓度咪唑的变性溶液洗柱子，去除杂蛋白。.复性：梯度加入不含变性剂的溶液。AKTA拉线性梯度，40-50min到达100%不含变性剂的溶液。.洗脱：加入高浓度咪唑的不含变性剂的溶液洗脱复性好的蛋白。处理柱子：用6M盐酸胍，0.5MEDTA溶液洗脱沉淀在柱子上的未复性蛋白。2.透析复性与稀释复性透析复性主要操作步骤如下:.细胞裂解液18,000rpm于4℃离心15min,收集沉淀。.在破菌buffer中补加低浓度的尿素(300-400mM)或盐酸胍(200-300mM)，将沉淀重悬混匀，18,000rpm于4℃离心15min，收集沉淀。重复操作一次。.用8M尿素或者6M盐酸胍溶解沉淀，还可其中补加适量DTT、EDTA和NaCl等。沉淀完全溶解后，18,000rpm于4℃离心15min，收集上清。.将变性蛋白于4℃透析至不含有变性剂的缓冲液中，每3hr以上更换一次透析液，直至变性剂完全透析除去。.将复性好的蛋白18,000rpm于4℃离心15min，收集上清，检测目的蛋白的浓度与纯度，并利用离子交换、凝胶过滤层析等方法进一步纯化。稀释复性主要操作步骤如下：.包涵体的洗涤和溶解与透析复性相同，最终获得变性的包涵体。并检测变性蛋白溶液的浓度，稀释到5mg/ml以下。.于4。。将变性蛋白溶液逐滴加入复性缓冲液中，变性蛋白溶液与复性缓冲液的体积比最好能达到1:30-1:50，甚至1:100。加入变性蛋白溶液时速度不可太快，最好边加边用磁力搅拌器搅拌复性缓冲液，防止蛋白迅速聚集沉淀。多数情况下，复性缓冲液中都含有0.5M精氨酸，适量的氧化-还原剂(如GSH-GSSG，半胱氨酸-胱氨酸)，EDTA，pH值一般是9左右。.将复性蛋白在4。。混合过夜，将上清浓缩至小体积后进行下一步的纯化。Q&A.目的蛋白在复性的过程沉淀，上清中没有目的蛋白？这是在变复性中最常遇到的问题。如果是透析，可以尝试用小体积含有一定浓度变性剂的缓冲液进行透析，梯度降低变性剂的浓度，以减少因缓冲液变化过大导致蛋白迅速沉淀。同样的，在稀释复性时，也可以复性缓冲液中加入一定量的变性剂(如0.6M盐酸胍)，当浓缩至较小体积时再透析或者利用中空膜系统更换至没有变性剂的缓冲液中。三.蛋白质修饰.还原性甲基化方法原理：将蛋白中表面的赖氨酸进行甲基化修饰，有利于稳定蛋白构象，更有利于蛋白晶体生长。适用情况：蛋白状态很好，进行结晶条件筛选时大部分为分相或澄清的情况。方法：.将纯化好的蛋白(纯度比较高，最好是亲和纯化以后用分子筛等其他方法进一步纯化好的蛋白)采取透析的方法用甲基化反应缓冲液(50mMHEPESatpH7.5,250mMNaCl)稀释成1mg/ml(或者是更低的浓度)..每毫升蛋白溶液中加入20pl1M新鲜配置的dimethylamine-boranecomplex(ABC;Fluka)和40pl1M新鲜配置的formaldehyde(Fluka),放置°Cvotex反应2hr..再向每毫升蛋白溶液中加入20pl1M新鲜配置的dimethylamine-boranecomplex(ABC;Fluka)和40pl1M新鲜配置的formaldehyde(Fluka),放置°Cvotex反应2hr..最后向每毫升蛋白溶液中加入10pl1M新鲜配置的dimethylamine-boranecomplex(ABC;Fluka)，放置4°Cvotex反应过夜..将可溶的甲基化蛋白用分子筛的方法进行纯化，分子筛平衡用的缓冲液(20mMTris-HClatpH7.5,200mMNaCl)可以终止甲基化反应的发生，收集蛋白样品，浓缩筛板。.烷基化巯基具有很强的亲核性，是酶分子中最容易反应的侧链基团。在许多酶中是活性中心的催化基团。烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂，特别是碘乙酸(lodoaceticacid,IAA)、碘乙酰胺(IAM)。碘乙酸可使巯基竣甲基化，防止游离的半胱氨酸降解或形成链间二硫键。具体操作步骤如下：蛋白先透析至1XPBS或性质接近的缓冲液中，加入10mM半胱氨酸还原硫基，室温反应约半小时。直接在反应液中加入20mM碘乙酸，避光室温反应半小时进行烷基化，之后可透析至下步实验所需buffer。在进行烷基化的过程中，要注意蛋白浓度不可过高(本人使用时为＜1mg/ml)，否则在加碘乙酸进行烷基化时很容易发生沉淀。如果发现加入碘乙酸后，出现大量沉淀，可以尝试降低蛋白浓度，或者尝试其他方法。.磷酸化假设蛋白A需要进行磷酸化修饰，并且鉴定磷酸化A的激酶B，如果需要在体外用B磷酸化A,需要先将两个蛋白分别纯化出来，将A和B按照一定的比例(比如10:1)混合，同时加入ATP和Mg2+，孵育一定的时间，再利用A和B理化性质的差异，将B除去，得到磷酸化的A，通过WesternBlotting和质谱鉴定磷酸化的特异性。以PDK1磷酸化S6K1为例，先分别纯化PDK1-KD和S6K1-KD，PDK1-KD带有HisTag，而S6K1-KD切掉HisTag，将S6K1-KD和PDK1-KD按照10：1的比例混合，同时加入5mMATP和2mMMgCl2，4℃孵育72小时后，过Ni柱，S6K1-KD在穿流液中。通过WesternBlotting和质谱鉴定S6K1-KD是否发生特异位点的磷酸化修饰。.仪器的使用AKTAAKTA使用权限.每位进行AKTA操作的同学必须先受过培训，而且经管理员认可并为其设立帐户后，才可以独立操作AKTA。.每个使用者在操作AKTA时，请登录自己的账户，并在实验完成后退出。.每个使用者在实验结束后请收拾台面，并在登记本上登记。.如果使其他小组的仪器，必须先获得该组管理员的许可。.在AKTA使用过程中遇到任何问题或故障，请跟管理员联系。AKTA操作说明.AKTA仪器开机：先开AKTA电源，等待AKTA完全启动后，再开电脑。关机：先退出union软件，再关闭电脑，最后关闭AKTA电源。在AKTA关开电源之间，请至少等待15秒钟。.使用者登录账户后，仪器连接纯化柱前，请先用高流速如5或10ml/min冲洗，以便除去管道系统的气泡、残留溶液或盐分等。如果系统压力过高，可能是在线过滤膜堵了，请进行更换。.先设定Alarmpressure和flowrate，等各项指标稳定（基线走平）后，再连接纯化柱。.接连纯化柱前，先确定管道内有液体滴出。先将管道与上端接口连接，但不要拧紧，再将下端接口拧松，然后将上端拧紧，最后将下端与管道连接并拧紧。同样，卸纯化柱时，先将盖帽与下端接口连接，不要拧紧，再将上端接口拧松，然后将下端拧紧，最后将上端与盖帽连接并拧紧。.上样前loop的清洗：小体积的loop在线清洗，大的如10ml，50ml的loop可以拆开清洗。如果不会使用，请跟管理员联系。.上样的针头末端为平头，不同于普通医用针头，决不能混用。上样后，不可以将针头悬挂在上样口，以免损坏上样接头。如果针头堵塞，可用细金属丝（与针头一起配置的）进行疏通。.收集器的转盘不能强行转动。请先将止动阀（一个2cm高，黑色橡胶外套的圆柱体，