DNA文库的构建和目的基因的筛选

第八章DNA文库的构建和

目的基因的筛选

§1

基因组DNA文库的构建§2cDNA文库的构建§3基因克隆的筛选策略外源基因：插入到载体内的那个特定的片段基因。目的基因：那些已被或者准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段。对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增，而只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因文库，然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。1基因文库(genelibrary)概念又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。2构建基因文库的基本程序1)提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA；2)DNA片段或cDNA片段与经特殊处理的载体连接形成重组DNA；3)重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌；4)阳性重组菌落或噬菌斑的选择。目的基因：已知基因：未知基因：构建基因文库特定探针的制备文库的筛选（筛库）含目的基因的克隆3基因文库的分类

按照外源DNA片段的来源：

从特定组织提取的染色体基因组DNA---基因组DNA文库

mRNA反转录成的cDNA拷贝----cDNA文库

用于基因克隆的DNA材料的选择：如果研究的目标是弄清一种蛋白质的氨基酸顺序，可以根据克隆的cDNA分子的核苷酸序列的结构直接推导出来；如果要研究的是控制基因表达活动的调控序列，或是在mRNA中不存在的某种特定序列，有关这类的信息就只能从染色体基因组DNA中获得。限制性内切酶……克隆、转化、培养、鉴定基因组DNA基因文库结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA1)基因组文库(Genomiclibrary)：

是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。2)cDNA文库(cDNAlibrary)：是指将某种生物体基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库。cDNA(complementaryDNA，互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。第一节基因组DNA文库的构建一、基因组DNA文库的类型根据所选用的载体可以分为：质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库）。二、基因组DNA文库的质量标准一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选三、基因组DNA文库构建的程序

①载体DNA的制备；②高纯度大相对分子质量基因组DNA的提取和大片段的制备；③高纯度大相对分子质量基因组DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离；④载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；⑤重组克隆的挑选和保存。基因组DNA文库限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装四、原核生物基因组DNA文库的构建（一）原核生物基因组DNA的提取染色体DNA

质粒DNA

要求：制备的DNA的长度为100-200kb，防止在制备过程中的机械断裂（二）基因组DNA的不完全酶切1、根据实验需要选择合适的限制性内切酶

a)四个识别位点的限制酶出现的几率:1/256b)六个识别位点的限制酶出现的几率:1/10242、分离目的酶切片段大小的确定

a)克隆单个基因：<10kbb)克隆基因族：<20kb3、DNA不完全酶切条件的确定

a)确定限制酶用量，改变酶切时间

b)固定酶切时间，改变限制酶的用量DNA的不完全酶切（三）酶切片段与克隆载体连接１、酶切片段的分离与纯化１）低熔点琼脂糖回收目的片段２）试剂盒回收目的片段2、酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择

a）质粒载体可承载15kbDNA左右片段(有效的范围为<10kb)b）载体可承载25kbDNA左右片段(有效的范围为15kb)c）Cosmid

载体可承载45kbDNA左右片段(有效的范围为<40kb)（四）重组ＤＮＡ转化受体细胞１、根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞常见的宿主细胞：DH5:

用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷型的抑制型菌株，可与pUC编码的－半乳糖苷酶氨基端实现互补。HB101:用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效率高JM101:可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌JM109:支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌MZ-1:温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌体ＰＬ启动子质粒载体的宿主菌２、重组质粒转化受体细胞1）转化法(transformation)

2）转导法(transduction)3）转染法(transfection)（五）基因组DNA文库克隆子的保存与筛选

1、基因组DNA文库的保存

1)影印膜滤保存法2）文库在液体培养基中扩增保存方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-70

oC储存（加终浓度为25%的甘油）。缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少。3)保存单个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%

的甘油，于-70oC或-25oC下保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大2、基因组文库的筛选表型筛选法：表达性状易于鉴别，如互补筛选抗性筛选法：如二氢叶酸还原酶可以使三甲苄二氨嘧啶降解，而该化学物可抑制大肠杆菌生长分子杂交法：利用分子探针对文库进行筛选免疫筛选法：利用多肽等作为抗原进行原位杂交筛选PCR筛选法：根据保守序列合成引物，扩增特异性片段？真核生物基因组文库的构建与原核生物基因组文库的构建有何不同第二节cDNA文库构建真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，都尽有15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。一、cDNA基因文库构建的步骤细胞总RNA的提取和mRNA的分离第一条cDNA合成第二条cDNA合成双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖cDNA文库的构建：基因重组反转录酶mRNAcDNA1细胞总RNA的提取和mRNA的分离通常用于构建cDNA的是真核细胞的mRNA，由于cDNA从mRNA合成而来，代表了基因组的可转录部分，不含内含子序列，因此可被用于在大肠杆菌中表达编码蛋白。由于每类细胞和组织只表达一套特定的基因，因此从特定组织中制备的mRNA通常会富集某些特异序列。所以起始材料的选择十分重要。1、mRNA的制备:

动物细胞或植物细胞mRNA的制备2、mRNA的来源:

选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等方法提高mRNA的含量。3、mRNA完整性的检测

1)mRNA分子的大小：哺乳动物mRNA长度为500-8000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间.2)总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力4、mRNA在细胞中的丰度1)高丰度mRNA

目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA

量的50-90%,该类mRNA在合成和克隆cDNA之前不需进一步纯化特定mRNA。2)低丰度mRNA

目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA

量的0.5%以下。5、mRNA的富集方法

典型的哺乳动物细胞含有10,000-30,000种不同的mRNA分子,某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至只有一个拷贝。1)按大小对mRNA进行分级分离*通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分子，该方法的分离效果最好，但从凝胶中回收的得率较低.*蔗糖梯度离心：加入破坏RNA二级结构的变性剂如氢氧化甲基汞等，再进行蔗糖梯度离心以分离不同分子量的mRNA.2)cDNA的分级分离*mRNA通过反转录形成cDNA，在插入到克隆载体前，通过琼脂糖凝胶电泳，将不同大小的cDNA分子分离开来。*优点：

a）避免了分离过程中mRNA被污染的

RNA酶降解

b）增加了获得全长cDNA克隆的概率

c）获得更准确的分级分离效果（分子量）3）多聚核糖体免疫学纯化法*

使用抗体来纯化合成目的多肽的多聚核糖体。将正在合成的新生多肽链的多聚核糖体结合到免疫亲和柱（A蛋白-Sepharose柱）上，随后用EDTA将多聚核糖体解离下来，并通过Oligo(dT)层析分离mRNA,利用该方法可将目的mRNA纯化数千倍.目的mRNA在细胞中的含量可为数十拷贝.mRNA的提取全长mRNA具有一个polyA的3’末端，可以被用于mRNA的分离；可以用寡聚纤维素柱，选择性地吸附mRNA纯化2第一链cDNA的合成

oligo(dT)引导的DNA合成法：利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。缺陷：因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5’－末端，必须从3’－末端开始合成cDNA。对于大分子量的较长的mRNA分子而言，特别麻烦。随机引物引导的cDNA合成法

(randomlyprimedcDNAsynthesis)：

根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始。3第二链cDNA的合成cDNA第二链的合成就是将上一步形成的mRNA-cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过程。cDNA第二链的合成的方法大致4种：自身引导合成法、置换合成法、引导合成法、引物－衔接头合成法。1）自身引导合成法：

获得的单链cDNA3’端会形成发夹结构的能力，以此作为第二链合成的引物，在大肠杆菌聚合酶IKlenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链。缺点：在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时，会导致对应于mRNA5’端的地方的序列出现缺失和重排。S1核酸酶的纯度不够时，会偶尔破坏合成的双链cDNA分子。2）置换合成法：获得的双链cDNA5’端也会有几对碱基缺失原理：以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链。优点：a）合成cDNA的效率高

b）直接利用第一链的反应产物，不需纯化

c）避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA3）引导合成法：获得的双链cDNA

能保留完整的5’端序列4）引物-衔接头法4双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖cDNA末端的处理由于大片段的平末端连接效率非常低，因此为了避免用平末端与载体连接，对双链cDNA的末端进行加工是十分必要的方法：添加特异性核酸接头以形成适合于克隆的黏性末端末端转移酶—可以向cDNA末端加上与克隆载体末端互补的尾部双链cDNA的克隆：

双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：1>平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收2>平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段3>加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收二、全长cDNA文库基因组DNA文库cDNA文库二、基因组DNA文库与cDNA文库的比较基因组DNA文库cDNA文库1基因组DNA文库的优点相对于cDNA文库，基因组文库的优点：cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列，

cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难；从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA中的非转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。2cDNA文库的主要优点①cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。②cDNA文库的筛选比较简单易行。③每一个cDNA文库都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。④cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。⑤cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究。3

cDNA克隆的主要的缺点cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。cDNA文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息。在cDNA文库中，相应于高丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难。

第三节基因文库的筛选与鉴定

◆重组体(recombinant，转化子transformant)：就是掺入或导入外源DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。1表型筛选法(1)抗药性筛选:这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法。一、基因文库的筛选

(2)插入失活筛选法经过上述抗药性筛选获得的大量转化子中既包括需要的重组子，也含有不需要的非重组子。为了进一步筛选出重组子，可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选。

抗药性标记选择(插入失活法)

(3)显色反应选择法(α-互补法)

将含有β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列的质粒转化至可编码β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主细胞中，可使各自无活性的片段实现互补，融为一体，产生具有酶学活性的蛋白，从而使转化的宿主菌在含有IPTG/X-gal(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-硫代半乳糖苷)的培养基上产生蓝色菌落，这种现象就称为α-互补。α互补的检测或ß-半乳糖苷酶法PCR筛选法利用合适的引物，以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR，通过对PCR产物的电泳分析，确定目的基因是否插入到载体中。3菌落原位杂交法

（colonyinsituhybridization）●1975年，M.Grunste