第十章 病毒类疫苗

第十章病毒类疫苗第一节概述1一.病毒类疫苗定义：用病毒、衣原体、立克次体或其衍生物制成，进入人体后使机体产生抵抗相应细病毒能力的生物制品2种类1.按用途分类：脊髓灰质炎、麻疹等疫苗2.按病毒培养的组织来源和制造方法分类：动物培养疫苗、鸡胚培养疫苗、细胞培养疫苗、基因工程疫苗3.按理化性状分类：①是否被灭活②是否被裂解③有无佐剂④物理状态3二.病毒培养方法1.细胞培养法生物制品生产用细胞的分类：①原代细胞和二倍体细胞：用于疫苗的制备和分离及建立毒株②传代细胞：用于检定③杂交瘤细胞：用于制备单克隆抗体4生产用细胞库的原始细胞库、主细胞库、工作细胞的三级管理模式原始细胞库（PCB）

主细胞库（MCB）

工作细胞库（WCB）

52.鸡胚培养法细胞培养技术发明之前被广泛使用，鸡胚来源容易，操作简单，至今仍用于痘类病毒、黏液病毒等的研究，黄热病疫苗、流感等疫苗仍用鸡胚培养法生产63.动物培养法动物是最早用于病毒的分离、鉴定、和疫苗制备的材料，具有对人类病毒敏感、易饲养、繁殖快、显性指标明确等优点，但动物携带的外源因子以及疫苗中残留的动物组织均影响疫苗的安全性，必将被其他技术代替7三.疫苗生产用毒株和细胞的要求1.毒种要求1）来源必须建立毒株的完整资料，包括病毒分离、全面质控、临川研究等资料2）管理由SFDA批准，国家指定机构保存，三级管理模式管理，规定传代水平内使用83）质控项目①鉴别试验②病毒外源因子检查③猴体神经毒力试验④免疫原性检查⑤其他试验92.细胞要求①原代细胞。小动物清洁级，鸡群SPF级②二倍体细胞。由SFDA批准，国家指定机构保存，三级管理模式管理，规定传代水平内使用③传代细胞。④细胞质控。按药典要求进行检定10第二节肝炎疫苗肝炎病毒是一组以肝脏为主要宿主细胞的病毒，主要有甲、乙、丙、丁、戊、己、庚型7中肝炎病毒，其中能引起临床疾病的主要是前五种11

12一.乙型肝炎病毒及乙肝疫苗1.乙肝的流行病学13

1）地区分布

WorldHealthOrganization.HepatitisB.Availableat:/emc-documents/hepatitis/docs/whocdscsrlyo20022/disease/world_distribution.html.AccessedJune1,2004.142）流行特点HBV感染转成慢性感染的可能性与初始感染年龄呈负相关，如果患者没能在6个月内清除HBV，那么HBV将由急性转为慢性，如果患者没有临床症状，肝功能检验正常，这些慢性感染者就是慢性携带者153）传染源及传播途径乙肝的传染源是乙肝患者和HBV携带者，其传播途径主要有两条：①母婴传播，又叫垂直传播②水平传播，包括密切接触、医源性传播、及性传播等162.HBV的病原学1）在血液中存在的三种形态乙型肝炎病毒（Brooks

etal,2004）A.

多形性小球颗粒（20～22nm）

B.

杆状颗粒

C.Dane颗粒（42nm）17①Dane颗粒（Murry

etal,1998）18②22nm小圆球颗粒，不含核酸，主要成分是乙肝表面抗原（Murry

etal,1998）19③杆状颗粒，不含核酸，可能成为完整HBV的外壳（Murry

etal,1998）202）病毒的复制1．HBV吸附并进入肝细胞后，脱去衣壳，病毒的DNA进入肝细胞核内。2．在DNA聚合酶的催化下，以负链DNA为模板，延长修补正链DNA裂隙区，使形成完整的环状双链DNA（convalentlyclosedcirculardouble-strandedDNA,cccDNA）。3．双链DNA继而形成超螺旋环状DNA，在细胞RNA聚合酶的作用下，以负链DNA为模板，转录形成长度分别为2.1kb、2.4kb、0.8kb和3.5kbRNA。2.1kb和2.4kb

RNA作为mRNA翻译表面蛋白；3.5kb

RNA除翻译核心蛋白和DNA聚合酶外，还作为HBVDNA复制的模板，故亦称其为前基因组（pregenome）。4．病毒的前基因组、蛋白引物及DNA聚合酶共同进入组装好的病毒内衣壳中。5．在病毒DNA聚合酶的逆转录酶活性作用下，自DR区开始，以前基因组RNA为模板，逆转录出全长的HBVDNA负链。在负链DNA合成过程中，前基因组被RNA酶降解。6．

病毒以新合成的负链DNA为模板，也自DR区开始复制互补的正链DNA。7．复制中的正链DNA（长短不等）与完整的负链DNA结合并包装于内衣壳中，再包上外衣壳成为病毒体，从细胞质释放至细胞外。21HBV复制周期示意图（Brooks

etal,2004）223）HBV的抗原结构（1）HBsAgPrange,R.andM.Werr(1999)23

HBsAg大量存在于感染者血中，是HBV感染的主要标志。HBsAg具有抗原性，可引起机体产生特异保护性的抗-HBs，也是制备疫苗的最主要成分。HBsAg存在不同的血清亚型，各亚型均含有一共同抗原表位（称为a抗原），此外，还有二组互相排斥的亚型抗原表位（d/y和w/r）。按不同的组合形式，构成HBsAg四个基本亚型，即adr、adw、ayr、ayw。HBsAg血清型分布有明显的地区差异，并与种族有关24（2）HBcAg

是从C基因的第2个起始子开始翻译产生的核心蛋白，是Dane颗粒中核心结构的组成成分，其外被HBsAg所覆盖，故不易在血循环中检出。HBcAg的抗原性强，能刺激机体产生强而持久的抗-HBc。抗-HBcIgG在血中持续时间较长，为非保护性抗体；抗-HBcIgM的存在提示近期发生过HBV的活跃复制。HBcAg可在感染的肝细胞表面存在，能被杀伤性T细胞识别，在清除HBV感染细胞中有重要作用25（3）HBeAg

是从C基因的第1个起始子开始翻译产生包含PreC及C序列的蛋白，该蛋白经细胞内蛋白酶切除其N端19个氨基酸及C端34个氨基酸后成为可分泌的e抗原。HBeAg为可溶性蛋白质，产生后分泌入血，通常在病毒大量复制时产生，故为HBV复制及具有强感染性的一个指标。HBeAg可刺激机体产生抗-HBe，抗-HBe能与受染肝细胞表面的HBeAg结合，通过补体介导破坏受染的肝细胞，对清除HBV感染有一定的作用。抗-HBe的出现有利于机体对病毒活跃复制的抑制。近年发现在一部分感染者中，HBV发生在PreC区出现终止密码子的突变，而不能合成HBeAg，从而有利于病毒逃避被抗-HBe及相应的细胞免疫所识别而清除，出现抗-HBe阴性而病毒大量增殖的情况。因此，对抗-HBe阴性的患者也应注意检测其血中的病毒DNA，以全面了解病情判断预后264）乙肝病毒的感染和致病机制①肝细胞损伤主要是细胞介导的免疫病理损伤，CTL起主要作用，也可造成肝细胞损伤②损伤之后，暴露出肝细胞膜上的LSP，可作为自身抗原诱导机体产生对肝细胞的自身免疫③感染后可形成多对抗原抗体复合物，沉积于肝内或肝外的多种组织，引起Ⅲ型变态反应④感染后可使靶细胞膜上的MHC-Ⅰ表达低下影响CTL对靶细胞的作用273.乙肝疫苗1）第一代疫苗—血源疫苗利用生化方法从乙肝携带者的血浆中沉淀和纯化HBV表面抗原，化学或加热方法使残留病毒灭活而制成，但是安全性得不到绝对保证，血浆来源受限，我国1998年停止了生产282）第二代疫苗—基因工程疫苗（1）表达系统酵母系统哺乳动物细胞系统（CHO细胞）痘苗病毒载体系统29（2）质控鉴别试验理化试验效力试验异常毒性试验剂型及效期30（3）临床使用效果三针免疫后的抗-HBs阳转率达85%~100%，30μg阻断母婴传播的保护效果为80%以上，接种6年后，抗-HBs阳转率72%~74%313）新型乙肝疫苗的研制（1）乙型肝炎DNA疫苗主要是将HBsAg的基因重组到真核表达载体上，然后将质粒（裸露DNA）直接注射动物，引起一系列的免疫效应32DNA疫苗的构建流程及作用机制33附：最近乙肝基因疫苗研究的文献报道（感兴趣的阅读）1.BreakingBandTcelltoleranceusingcationiclipid--DNAcomplexes(CLDC)asavaccineadjuvantwithhepatitisBvirus(HBV)surfaceantigenintransgenicmiceexpressingHBV.AntiviralRes.2011Jun;90(3):227-30.2.GPC3fusedtoanalphaepitopeofHBsAgactsasanimmunetargetagainsthepatocellularcarcinomaassociatedwithhepatitisBvirus.HepatobiliaryPancreatDisInt.2011Apr;10(2):164-70.3.Comparisonofabacteriophage-deliveredDNAvaccineandacommerciallyavailablerecombinantproteinvaccineagainsthepatitisB.FEMSImmunolMedMicrobiol.2011Mar;61(2):197-2044.ProfilesofBandTcellimmuneresponseselicitedbydifferentformsofthehepatitisBvirussurfaceantigen.Vaccine.2010Oct21;28(45):7288-96.Epub2010Sep85.[EffectofpolyethyleneglycolasadjuvantonhepatitisBvirusDNAvaccineinvitro].WeiShengWuXueBao.2010Jul4;50(7):949-5434（2）多种分子质量HBsAg亚单位疫苗将s、pres2、pres1同时重组到载体上制备能同时表达三种蛋白质的亚单位疫苗，可进一步提高疫苗的免疫原性和效果（3）新型佐剂疫苗（4）转基因植物疫苗（5）载体活疫苗35二.甲型肝炎疫苗1.概述甲型肝炎是由一种肠道传染的病毒即HAV感染肝细胞而引起的急性传染病，主要经过粪－口途径传播，可造成暴发或散发流行，潜伏期短，发病较急，一般不转为慢性，亦无慢性携带者，预后良好。362.甲肝病毒的病原学及其致病机制

球形颗粒，无包膜基因组:线状+ssRNA，衣壳:20面体立体对称，由VP1～VP4等4种多肽组成，其中VP1是主要的衣壳蛋白，其抗体能中和HAV。至今，世界各地HAV只发现一个血清型。

37HAV主要侵犯儿童和青年，且多为隐性感染:HAV口小肠淋巴结内增殖血（病毒血症）肝细胞内增殖致病（出现临床症状）急性期排毒量Ab383.甲肝疫苗1）甲肝病毒灭活疫苗用人二倍体成纤维细胞系复制扩增，经富集纯化后，甲醛变性，用氢氧化铝吸附制得，优点是安全保护作用较持久，缺点是价格比较高392）甲肝病毒减毒活疫苗（1）毒株H2株、L-A-1株（2）生产用细胞及培养方法KMB-17和2BS细胞株静止或转瓶培养（3）质控理化试验、鉴别试验、无菌试验、异常毒性试验（4）剂型及有效期403）新型甲肝疫苗的研究（1）联合疫苗HAV-HBV二联灭活疫苗、甲肝-乙脑二联活疫苗等（2）基因工程疫苗①基因重组载体活疫苗②基因工程亚单位疫苗（3）新型佐剂或口服疫苗41三.丙型肝炎病毒及丙肝疫苗1.概述丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus，HCV）引起丙型肝炎。HCV主要经血或血制品传播，目前占输血后肝炎的80%～90%。在我国丙型肝炎流行率为2.1%。其临床和流行病学特点类似乙型肝炎，但症状较轻，演变为慢性者多见，部分患者可发展为肝硬化或肝癌。422.丙肝病毒的病原学血清中病毒含量少，直到1991年日本学者阿部贤治才在免疫电镜下观察到HCV颗粒。病毒直径36--62nm，球形，与黄病毒相似。HCV基因组结构HCVRNA全长约10kb含三个编码区C区（高度保守）核心蛋白（C）E1区膜蛋白1（E1）E2区（易变）膜蛋白2（E2）433.丙肝病毒的感染和机体的免疫反应①HCV能引起长期感染，即使体内产生有针对HCV的特异B、T淋巴细胞，仍能出现长期感染②HCV如同HIV一样具有很高的变异性③没有足够证据表明在清除了HCV的患者体内，产生了长期的针对HCV的免疫力，相反HCV再度感染并导致肝脏病变的可能性很高444.丙肝疫苗的研制1）基因工程亚单位疫苗在Hela细胞中表达E1、E2蛋白，或者用昆虫细胞表达结构蛋白并形成病毒样颗粒，免疫动物均能产生免疫保护作用2）丙肝病毒的DNA疫苗研究最多的是HCV核心蛋白，因为这一蛋白具有高度的同源性，同时加用细胞因子作为免疫佐剂可增强体液和细胞免疫45四.戊型肝炎病毒及其疫苗的研究戊型肝炎病毒（HEV）为单股正链RNA病毒，现认为属杯状病毒属。应用免疫电镜（IEM）技术观察到的病毒样颗粒，各地报告不完全相同，存在着HEV序列的差异，但这些病毒颗粒间有明显的交叉反应，提示HEV可能只有一个血清型。46HEV尚不能体外培养，尚无灭活病毒疫苗和减毒活疫苗的报道，基因工程疫苗的研究侧重于下面两个方面①用重组DNA技术表达HEV第二个读码框编码的蛋白，作为亚单位疫苗②用表达HEV第三个读码框蛋白的质粒作DNA疫苗47第三节艾滋病疫苗AIDS由反转录病毒—人免疫缺陷病毒（HIV）引起，对人类T淋巴细胞的T4亚群有嗜性48一.艾滋病的流行病学截至2010年10月底，累计报告艾滋病病毒感染者和病人37万余例，其中死亡6.8万余例。但是根据早前卫生部和联合国艾滋病规划署、世界卫生组织联合评估结果表明：截至2009年底，我国现存活艾滋病病毒感染者和病人约74万人，其中病人约10.5万人；2009年新发感染者约4.8万人，因艾滋病相关死亡约2.6万人。局部地区和特定人群疫情严重，云南、广西、河南、四川、新疆和广东6省区累计报告感染者和病人数占全国77.2%。49艾滋病的三大传播途径性途径传播血液途径传播母婴途径传播50二.HIV的病原学1.病原体—HIVHIV属于反转录病毒科慢病毒属，存在两种型别：HIV-1：AIDS感染的主要毒株，全球范围内流行，一旦感染便终身带毒HIV-2：局限于西非，生物学特性与HIV-1相似，但其毒力较弱，致病性较低512.HIV的形态结构HIV呈球形，直径为100～120nm。典型的HIV-1颗粒由核心和包膜两部分组成，核心包括病毒RNA、核心结构蛋白和病毒复制所必须的酶类。HIV的RNA为两条相同拷贝的正股RNA链。与RNA连在一起的是病毒的酶类，包括：①逆转录酶（RT）；②整合酶（INT，P32）③蛋白酶。核酸外面为病毒衣壳蛋白（P24，P17）。病毒的最外层为包膜，其中嵌有gp120和gp41两种特异性糖蛋白，前者构成病毒表面刺突为外膜糖蛋白，后者为跨膜糖蛋白52HIV结构模式图533.HIV的基因组结构和蛋白组成

HIV基因组两条正股RNA链在5’端通过部分碱基互补配对而成双聚体。病毒基因全长约9.7kb，含有gag、pol、env3个结构基因、2个调节基因和4个辅助基因，分别称为tat（反式激活因子）、rev（毒粒蛋白表达调节子）；nef（负调控因子）、vpr（病毒r蛋白）、vpu（病毒u蛋白）和vif（毒粒感染性因子）。由于HIV基因结构复杂而被称为复杂逆转录病毒。54①结构基因HIV-1结构基因包括编码病毒核心蛋白的gag基因，编码病毒包膜蛋白的env基因，以及编码病毒复制关键酶类的pol基因3个基因。②调节基因HIV-1病毒的非结构基因包括两个调节基因tat和rev，其编码的蛋白对HIV复制均具有反式激活作用。③功能辅助基因包括Vif蛋白、Vpr蛋白、Ne蛋白、vpu基因、LTR等，各有其结构、功能和意义。55564.HIV的复制和潜伏病毒识别宿主细胞后，与宿主细胞结合，释放其内容物到宿主细胞内。在细胞内宿主蛋白酶等作用下，首先清除病毒包膜蛋白。然后利用宿主酶进行宿主基因组复制。主要过程包括以下主要分子生物学步骤：571．病毒与靶细胞膜的融合2．病毒外膜的裂解3．裂解后释放的病毒RNA利用自身逆转录酶进行逆转录，合成病毒基因组cDNA。4．病毒的潜伏5．病毒基因的表达6．病毒的组装和成熟585.HIV基因和蛋白的变异HIV是一种高度变异的病毒，但其各基因变异或保守的程度不一样，其变异率依次为pal（3%）、gag（6%）、env（22%）。核心抗原和各种蛋白酶很保守596.HIV感染的免疫应答机体的免疫系统对HIV的初期感染起一定的抑制作用，但随着免疫系统的损害及HIV的变异，机体的免疫系统最终对HIV的感染无能为力。HIV感染能激发机体产生特异的细胞免疫反应和对各种病毒抗原产生相应抗体。机体产生T淋巴细胞介导的细胞毒作用，HIV感染者脑部有T淋巴细胞浸润。CD8+T淋巴细胞对HIV病毒的抑制，溶解感染HIV的靶细胞，说明T细胞在HIV感染中发挥抑制HIV复制作用。60机体产生的抗体可以中和游离HIV病毒及已和细胞结合的而尚未进入细胞内的HIV颗粒。自然杀伤细胞（NK）和杀伤细胞（K细胞）通过抗体依赖性细胞毒性作用能杀伤和溶解HIV感染的细胞。机体的细胞免疫和体液免疫作用可在一段时间内控制HIV的复制及扩散。但是，由于病毒的变异和重组，可以逃脱免疫监视，不能被机体的免疫系统彻底清除。当机体的免疫系统被进一步破坏时，在某些触发因素的作用下，使HIV大量复制和播散，最终导致AIDS的发生。617.HIV的发病机制①HIV侵入T4细胞，引起免疫缺陷，导致机会感染和肿瘤②HIV感染单核细胞，进入中枢神经系统，引起脑损伤，出现痴呆和慢性脑病62三.AIDS疫苗的研究1.目前研制AIDS疫苗的困难和对策1）HIV的基因变异率极高2）HIV能建立潜伏感染并能在细胞间传播3）HIV可直接侵犯免疫系统和中枢神经系统4）尚缺乏能如实产生人类AIDS的HIV动物模型632.研制AIDS疫苗的可行性①人体免疫系统在某些情况下能够控制HIV感染②有些实验性HIV疫苗可以保护非人灵长类动物免患艾滋病或艾滋病样疾病③感染HIV-2可降低HIV-1感染的可能性643.目前研究和开发的AIDS疫苗种类和现状1）基因工程亚单位疫苗是HIV疫苗研究的重点，研究最多的是膜蛋白，是免疫系统很强的免疫原，生产和纯化工艺较简单、安全性好，缺点是不能引起细胞免疫652）病毒样颗粒研究病毒样颗粒疫苗（VLP）是以HIV核心蛋白Gag为基础的复合疫苗，动物试验中已观察到VLP疫苗可诱生很强的CTL及抗体反应，缺点是纯化和保存较困难663）核酸疫苗HIV核酸疫苗主要以env、gag、pol、基因为目的基因4）合成肽疫苗运用肽合成技术制备的一种高纯度制品，曾经是HIV疫苗研究的一个十分活跃的领域675）灭活疫苗主要存在的问题第一，灭活程度很难掌握第二，灭活后的核酸仍完整，有可能整合到人体细胞染色体上第三，需要培养大量病毒，且必须高度纯化，花费太高686）减毒活疫苗将HIV在体外或动物体内长期传代，或用人工方法使一些重要基因发生丧失功能性突变或缺失，使其在保留生长和免疫原性的基础上失去致病能力，但是安全性要求非常高，尚未进入临床试验69第四节脊髓灰质炎疫苗70一.概述脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒（PV）引起的急性传染病，引起脊髓前角灰白区尤其是灰质区的神经细胞病变71二.发病机制72三.脊髓灰质炎疫苗脊髓灰质炎病毒可分为I、II、III3个血清型，型间无交叉免疫目前国内外发病与流行多以I型居多。近年来服疫苗地区多见II、III型感染

731.灭活疫苗1952~1954年，研制成功注射用脊髓灰质炎灭活疫苗（IPV），但是不能阻止病毒在肠道的繁殖或作用小，目前大部分国家不再用IPV，而采用减毒活疫苗（OPV）742.减毒活疫苗1）我国现用的疫苗①脊髓灰质炎减毒活疫苗糖丸：用脊髓灰质炎病毒I、II、III型减毒株分别接种人二倍体细胞，经培养、收获制成的糖丸②口服脊髓灰质炎病毒活疫苗（猴肾细胞）：用三个型的减毒株分别接种与原代猴肾细胞，经培养收获病毒液制成的疫苗③脊髓灰质炎病毒活疫苗糖丸（猴肾细胞）：用三个型的减毒株分别接种与原代猴肾细胞，经培养收获病毒液制成的糖丸752）生产用毒种、细胞和培养方法生产用毒种可用I、II、III型Sabin株，也可用I、II、III型Sabin纯化株，中III-2株或其他批准的毒株生产用细胞为原代猴肾细胞和2BS株人二倍体细胞种毒后静止或转瓶培养40~96h763）质控（1）毒种专项检定：家兔试验、Rct特征试验d特征试验、SV40序列测定（2）病毒原液的专项检定：MAPREC试验、猴体神经毒力试验（3）成品疫苗检定：病毒滴度、热稳定性试验（4）有效期：2~8℃五个月，-20℃2年77第五节麻疹疫苗78一.概述●麻疹是由麻疹病毒引起的急性发疹性呼吸道传染病。●临床上以发热、上呼吸道炎症、颊粘膜出现麻疹粘膜斑（又称柯氏斑）及全身斑丘疹为主要特征。79二.麻疹病毒的生物学性状及理化特性麻疹病毒是单股螺旋RNA病毒，属副粘液病毒科,麻疹病毒只有一个血清型。接近圆形或卵圆形的颗粒，直径约为120－250nm。它的特性是耐低温，对热和一般消毒剂敏感，在流通空气或日光下半小时灭活，含有病毒的飞沫在室内空气中保持传染性一般不超过2小时，但在低温及干燥条件下有较好的耐受力。80三.麻疹减毒活疫苗1.生产用毒种及细胞毒种：沪191株，长47株或其他批准减毒株细胞：原代鸡胚细胞812.质控（1）理化试验（2）鉴别试验（3）无菌试验（4）病毒滴度及热稳定性试验（5）异常毒性试验823.剂型及有效期人用剂量0.5ml，含麻疹活病毒不低于3.01gCCID50，有效期：1年6个月4.临床使用效果8月龄婴儿一次免疫的抗体阳转率≥95%，80%以上初免者抗体持久性可维持16年以上835.存在问题1）原发性免疫失败2）继发性免疫失败3）发病年龄后移和小年龄发病4）麻疹接种后的神经系统反应84第六节流行性腮腺炎疫苗85一.概述简称腮腺炎或流腮腮腺炎病毒引起急性自限性呼吸道传染病主要发生在儿童和青少年一种系统的、多器官受累的疾病丙类传染病

86二.腮腺炎病毒的生物学性状及理化特性单股RNA病毒含2种抗原：核壳蛋白（NP）具有S抗原。起病1周出现S抗体，无保护性，可用于诊断。血凝素和神经氨酸酶糖蛋白（HN）具有V抗原。起病2~3周出现V抗体，具有保护作用。只有一种血清型，很少变异87三.流行性腮腺炎疫苗1.现用疫苗①腮腺炎减毒活疫苗②麻疹腮腺炎联合减毒活疫苗882.质量控制1）理化试验2）鉴别试验3）无菌试验4）病毒滴度及热稳定性试验5）异常毒性893.剂型及有效期人用剂量0.5ml，含麻疹活病毒不低于3.71gCCID50，有效期：1年6个月4.临床使用和效果8月龄婴儿一次免疫的抗体阳转率80%～88%，75%以上初免者抗体持久性可维持10年以上90第七节风疹疫苗风疹病毒91一.概述风疹（rubella,Germanmeasles）又称“风痧”，痧子等。是儿童常见的一种呼吸道传染病。由于风疹的疹子来得快，去得也快，如一阵风似的，“风疹”也因此得名92二.风疹病毒的生物学性状及理化特性风疹病毒是一种囊膜病毒，直径约60～70nm，呈粗糙球状，由一单股RNA基因组及脂质外壳组成，内含一个电子稠密核心，覆盖两层疏松外衣，病毒型别只有一个，病毒不耐热，在37℃和室温中风疹很快灭活，-20℃可保存9个月，-60℃可保存一年以上93三.风疹疫苗我国现用的疫苗有两种：①风疹减毒活疫苗（人二倍体细胞）：用BRDII或经批准的其他经二倍体细胞适应的减毒株接种人2BS株、MRC-5株或经批准的其他细胞株，经培养制成②风疹减毒活疫苗（兔肾细胞）：用松叶株接种原代兔肾细胞，经培养制成941.国内外毒株1）国外①HPV-77株②Cendehill株③RA27/3株④TO-336株2）国内①BRD-II株②松叶株952.质量控制1）理化试验2）鉴别试验3）无菌试验4）病毒滴度及热稳定性试验5）异常毒性试验96第八节水痘和带状疱疹疫苗97一.概述水痘是由水痘带状疱疹病毒初次感染引起的急性传染病。传染率很高。主要发生在婴幼儿，以发热及成批出现周身性红色斑丘疹、疱疹、痂疹为特征。带状疱疹属于成年及老年疾病，其特征为神经疼痛及随神经支单侧分布的皮肤发疹。水痘和带状疱疹为临床表现不同的疾病，却为同一种病毒引起，因此将此病毒命名为水痘带状疱疹病毒。98二.水痘带状疱疹病毒的病原学及理化特性VZV现已命名为人疱疹病毒3型（HHV-3），此病毒呈砖形，有立体对称的衣壳，内含双链DNA分子。VZV对体外环境的抵抗力较弱，在干燥的痂内很快失去活性。99三.水痘疫苗1.现用疫苗1）疫苗毒株①国外：Oka株②国内：北京株（84-7）2）生产用细胞及培养方法MRC-5和2BS细胞株静止或转瓶培养，病毒不易从胞内释放，需超声破碎1003）质量控制①理化试验②鉴别试验③无菌试验④病毒滴度及热稳定性试验⑤异常毒性试验4）剂型及有效期每人份含活病毒不低于2000CCID50，有效期：一年1012.疫苗的应用和效果①临床使用：一岁以上易感儿童接种1剂②接种效果：国内免疫后平均抗体阳转率为88.9%，发热率约3.7%，皮疹率0.5%1023.现有疫苗存在的问题①保护率不理想②疫苗病毒对高危人群的传播性③接种疫苗后带疱的发生问题1034.疫苗发展趋势①分离或改造现有疫苗株，获得对免疫缺陷人群更安全有效的疫苗②改进疫苗保护剂，开发耐热性好，有效期长的疫苗③发展腮腺炎、麻疹、风疹、水痘（NMRV）四联疫苗④研究更安全的基因缺失减毒活疫苗或载体表达的基因重组亚单位疫苗104第九节流行性乙型脑炎疫苗乙脑是一种发生在夏秋季、由乙脑病毒引起、经蚊子叮咬传播、人畜共患的中枢神经系统传染病105一.乙脑病毒的结构和理化特性乙脑病毒病原体属披膜病毒科黄病毒属第1亚群，呈球形，直径20～40nm，为单股RNA病毒，外有类脂囊膜，表面有血凝素，能凝集鸡红细胞，病毒在胞浆内增殖，对紫外线、温度、乙醚、酸等都很敏感，能在乳鼠脑组织内传代，亦能在鸡胚、猴肾细胞、鸡胚细胞和Hela等细胞内生长，其抗原性较稳定。106二.乙脑病毒的生物学特性1.感染性和致病性多数人感染乙脑后不产生临床症状，称隐性感染，只有少数人发病2.抗原性和免疫原性乙脑病毒的抗原性由3种结构蛋白（C、M、E）和大约7种非结构蛋白构成，但在病毒分类和致病机制上起重要作用的是E蛋白。人或动物感染病毒后血中可出现补结抗体、血抑抗体、和中和抗体。感染乙脑病毒后除产生体液免疫还产生细胞免疫107三.乙脑疫苗1.乙脑减毒活疫苗1）毒株中国药品生物制品检定所研制的SA14-14-2株2）生产用细胞及培养方法地鼠肾细胞转瓶培养法1083）质量控制①理化试验②鉴别试验③无菌试验④疫苗滴度及热稳定性试验⑤异常毒性试验⑥安全试验1094）剂型和有效期每份含活病毒量不少于5.41gPFU，有效期1年6个月5）临床使用和效果初免一针抗体阳转率可达85%～100%1102.乙脑灭活疫苗1）毒株P3强毒株2）生产用细胞及培养方法地鼠肾细胞和Vero细胞转瓶培养法1113）质量控制①理化试验②鉴别试验③无菌试验④效力及热稳定性试验⑤异常毒性试验1124）剂型和有效期液体剂型，每人份儿童0.5ml，成人1ml，有效期2年5）临床使用和效果需加入亚硫酸氢钠溶液中和甲醛后再进行接种，初次免疫两针后的抗体阳转率可达70%～85%，加强注射后阳转率可达95%以上113第十节狂犬病疫苗狂犬病又称恐水病，是由狂犬病病毒感染所致的急性传染病。114狂犬病毒形态（28万倍）1151.狂犬病毒的生物学特性动物或人被咬伤后，病毒随犬唾液经伤口进入人体，在局部肌肉细胞中增殖，后通过神经肌肉接头侵入周围神经，以细胞－细胞间传播方式上行至神经节和CNS。在脑组织中迅速增殖，沿传出神经下行至唾液腺和其他组织116二.狂犬病毒的形态结构与理化特性完整的狂犬病病毒呈子弹形，长度大约为180纳米左右直径为80纳米左右。整个病毒由最外层的脂质双分子层外膜、结构蛋白外壳和负载遗传信息的RNA分子构成。目前普遍认为狂犬病病毒有四个不同的血清型。狂犬病病毒对不利环境的抵抗力非常弱，在表面活性剂、消毒剂如甲醛、升汞、碘酒还有酸碱环境下会很快失去活性，并且对热和紫外线极其敏感。117狂犬病毒结构示意图118三.狂犬病疫苗1.现有疫苗类型WHO推荐四种疫苗：①人二倍体细胞疫苗②Vero细胞疫苗③原代地鼠肾细胞疫苗④原代鸡胚细胞疫苗119我国目前生产和使用的狂犬疫苗主要有三种：①人用狂犬疫苗（Vero细胞）②冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）③人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）1202.质量控制1）理化试验2）鉴别试验3）无菌试验4）效力及热稳定性试验5）异常毒性试验1213.剂型及有效期人用剂量1ml，含量≥2.5IU，有效期：液体疫苗1年，冻干疫苗1年6个月4.临床使用和效果接种对象为被狂犬或其他疯动物咬伤、抓伤者。不分年龄、性别均应立即用肥皂水仿佛冲洗后再用碘酊消毒数次，并及时按暴露后程序注射本疫苗。122暴露后注射程序：被咬伤者应分别在第0、3、7、14、28天各肌肉注射狂犬疫苗1针，共注射5针。暴露前注射程序：即对健康者的预防接种。可按0、7、21天接种程序注射3针。123第十一节流行性感冒疫苗流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，病毒传染性强、传播快、潜伏期短、发病率高。124一.流感病毒的生物学及理化特性

核心：负单股RNA、7~8个节段（易变异原因）内层：核衣壳

核蛋白（NP）

RNA多聚酶

中层：内膜蛋白（M蛋白）外层：包膜，双层脂质

其上有刺突：血凝素HA

神经氨酸酶NA1251261、内部抗原（核蛋白和内膜蛋白）

抗原性稳定，分甲A、乙B、丙C三型2、表面抗原：HA、NA

分亚型(subtype)依据

易变异127二.流感疫苗1.现用疫苗①流感全病毒灭活疫苗②裂解型流感病毒灭活疫苗③亚单位流感疫苗我国生产和使用的是主要为流感全病毒灭活疫苗1282.质量控制①理化试验②鉴别试验③无菌试验④异常毒性试验1293.剂型和有效期3岁以下儿童0.25ml，3岁以上0.5ml，有效期暂定为1年4.临床使用及效果6月龄以上所有希望预防流感感染的人接种，我国从日本引进生产的裂解疫苗，接种6周后HI抗体阳转率81.1%～94.9%130第十二节流行性出血热疫苗流行性出血热是肾综合征出血热的一种，临床表现有发热、出血、肾脏损害、三大症状，病情严重，病死率高。我国主要有两种血清型野鼠型和家属型131一.病毒的病原学及理化特性流行性出血热病毒布尼亚病毒科，汉坦病毒属负性单链RNA病毒形态：圆形或卵圆形包括外膜和核心132病毒结构示意图133对外界抵抗力不强对乙醚、氯仿和去氧胆酸盐敏感不耐热、不耐酸对紫外线、酒精和碘酒敏感134二.现用疫苗1.疫苗类型我国生产的出血热疫苗主要有三种：①Ⅰ型肾综合征出血热灭活疫苗②Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗③双价肾综合征出血热灭活疫苗1352.质量控制1）理化试验2）鉴别试验3）无菌试验4）效力及热稳定性试验5）异常毒性试验1363.剂型及有效期人用剂量每次1ml，有效期1年6个月4.临床使用和效果16～60岁高危人群接种，于0、14、28d各注射一针，我国细胞培养疫苗抗体阳转率，Ⅰ型为90.3%~93.3%，Ⅰ型为97.4%~100%137第十三节其他正在研制的病毒类疫苗138一.轮状病毒疫苗1.轮状病毒的生物学球形，直径70nm，无包膜，双层衣壳，二十面体对称。内衣壳的壳微粒沿着病毒体边缘呈放射状排列，形同车轮辐条，故称为轮状病毒轮状病毒有两种形态，即双壳颗粒与单壳颗粒：

前者为一种成熟的或完整的病毒颗粒，具有外层多肽衣壳，又称L毒粒（lightVirion），具有传染性；后者因在自然条件下失去其外壳，形成粗糙单壳颗粒，又称D毒粒（densevirion），无传染性。139人类轮状病毒属呼肠病毒科轮状病毒属。根据病毒蛋白VP6抗原分为A～G7个组，每组分为若干血清型。人类轮状病毒属A、B、C三组，既可感染人也可感染动物

A组轮状最为常见，病毒主要引起婴幼儿腹泻；

B组主要发现在中国引起成人轮状病毒腹泻，故也称成人腹泻轮状病毒（adultdiarrhearotavirus，ADRV）；C组引起散发腹泻，偶有小规模爆发流行的报道。

D～G组目前仅在动物体内发现。1402.轮状病毒疫苗1）现用疫苗我国兰州生物制品研究所利用羊RVLLR-85（G10P12）株构建的口服疫苗于1998年在中国获得批准使用1412）目前正在研究的疫苗①病毒样颗粒疫苗（VLP）：用重组杆状病毒传染的昆虫细胞，表达不同轮状病毒结构蛋白制成②RV核酸疫苗：将编码鼠VP4、VP6、和VP7基因的cDNA插入表达质粒作为DNA疫苗，对同型RV有一定保护作用142二.呼吸道合胞病毒疫苗1.呼吸道合胞病毒的生物学特点①形态结构不分节段的单股负链RNA。包膜上有2种糖蛋白刺突：F蛋白和G蛋白。F蛋白能引起病毒包膜与宿主及培养细胞之间的细胞膜的融合，G蛋白具有对宿主细胞的吸附作用。二者均为保护性免疫应答的作用位点，但都无NA和HA的活性，也无溶血素活性。

②培养特性

可在HeLa、Hep-2等多种细胞中缓慢增殖并引起明显的CPE，形成含有多个胞核的融合细胞，及胞内嗜酸性包涵体。猩猩、狒狒、大鼠、小鼠、雪貂等多种对RSV敏感。③抵抗力

弱，不耐酸、热1432.呼吸道合胞病毒疫苗的研究①使用痘苗病毒和腺病毒研制的表达RSVF，和RSVG的重组活疫苗有一定的免疫保护效果，但其很难在婴幼儿早期使用，而且在免疫低下的婴幼儿中安全性难以得到保证，目前研制的高病毒的非复制型载体可能是研制该疫苗的重要途径②负链RNA病毒cDNA转染技术的成功给使用现代分子生物学技术制备RSV的分子减毒活疫苗带来了希望144三.人类乳头瘤病毒疫苗1.人类乳头瘤病毒的生物学性状HPV是一种小的DNA病毒，直径50～55nm，衣壳呈二十面体立体对称，含72个壳微粒，没有囊膜，完整的病毒颗粒在氯化铯中浮密度为1.34g/ml，在密度梯度离心时易与无DNA的空壳（密度1.29g/ml)分开。HPV基因组是一闭环双股DNA，约7.8~8.0KB。按功能可分为早期区（E区）、晚期区（L区）和非编码区（NCR）三个区域。E区分为E1～E7开放阅读框架，主要编码与病毒复制、转录、调控和细胞转化有关的蛋白。L区分L1和L2，分别编码主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白。NCR是E区与L区间-6.4～1.0bp的DNA片段，可负责转录和复制的调控。145HPV分型低危型（非癌相关型）：HPV1、5、6、11、40、42、43等。高危型（癌相关型）：①疣状表皮发育不良（EV）-HPV相关型：HPV5、8、9、12、14、15、17、19-25等。②生殖道癌前病变/癌-HPV型：HPV16、18、31、33、35-39、45、51-52、56、58、59等。1462.人类乳头瘤病毒疫苗的研究目前的研制方向主要集中在以L1和L2及E6和E7为靶抗原的各类基因工程疫苗147四.单纯疱疹病毒疫苗HSV具有典型的疱疹病毒科病毒的形态特征

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