医药卫生杜平华制药用水的制备与质量保证

医药卫生杜平华制药用水的制备与质量保证

前言药品生产用水的质量直接影响药品的质量。因此，制药用水的质量控制，特别是其微生物学指标的控制是极其重要的。合理的操作规程、水系统的日常监测策略以进一步降低系统的风险指数。2制药用水的分类、定义及用途定义制药用水是药物生产用量大，使用广的一种辅料用于生产过程及药物制剂的制备。分类

2010版药典收载的制药用水，根据使用的范围不同分为饮用水、纯化水、注射用水及灭菌注射用水。制药用水的原水通常为饮用水。3

制药用水的用途制药用水的选择

应根据生产工序或使用目的与要求选用适宜的制药用水。药品生产企业应确保制药用水的质量符合预期用途的要求。4制药用水的用途饮用水

为天然水经净化处理所得的水，其质量必须符合现行中华人民共和国国家标准《生活饮用水》。用途⒈制备纯化水的水源。⒉药材净制时的漂洗、制药用具的粗洗用水。除另有规定外，也可作为药材的提取溶剂。⒊设备、容器的初洗。5制药用水的用途纯化水为饮用水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其他适宜的方法制备的制药用水。不含任何附加剂，其质量应符合二部纯化水项下的规定。用途⒈制备注射用水的水源。⒉配制普通药物制剂用的溶剂或试验用水。⒊中药注射剂、滴眼剂等灭菌制剂所用药材的提取溶剂。⒋口服外用制剂配制用溶剂或稀释剂。⒌非灭菌制剂用器具的精洗。⒍非灭菌制剂所用药材的提取溶剂。⒎纯化水不得用于注射剂的配制与稀释。6制药用水的用途

注射用水

为纯化水经蒸馏所得的水，应符合细菌内毒素试验的要求。注射用水必须在防止细菌内毒素产生的设计条件下生产、储藏及分装。其质量应符合注射用水项下规定。用途⒈无菌产品直接接触药品的包装材料最后一次精洗。⒉配制注射剂、滴眼剂等的溶剂和稀释剂。

7制药用水的用途灭菌注射用水

为注射用水按照注射剂生产工艺制备所得。

不含任何添加剂。其质量应符合灭菌注射用水项下

规定。用途

主要用于注射用的灭菌粉末的溶剂或注射剂的稀释

剂。8

新版GMP对制药企业水系统的验证与监控

条款规定第九十四条药品生产用水应适合其用途，应至少采用饮用水。各类药品生产选用的制药用水应符合《中国药典的相关要求》。第九十五条饮用水应符合国家有关的质量标准，纯化水、注射用水应符合中国药典的质量标准。第九十六条水处理设备及其输送系统的设计，安装和维护应能确保制药用水达到设定的质量标准。水处理设备的运行不得超出其设计性能。第九十七条纯化水、注射用水储罐和输送管道所用材料应无毒、耐腐蚀，储罐的通气口应安装不脱落纤维的疏水性除菌滤器；管道的设计和安装避免死角、盲管。9

新版GMP对制药企业水系统的验证与监控第九十八条

应对制药用水及原水水质进行定期检测，并有相应的记录。第九十九条纯化水、注射用水的制备，储存和分配应能防止微生物的滋生，如注射用水可采用70℃以上保温循环。第一百条应按照书面规程定期消毒纯化水、注射用水管道、储罐以及其它必要的辅助管道（如清洁、消毒用的管道，生产用临时连接管道），并有相关的记录，书面规程还应详细规定制药用水微生物污染的警戒限度，纠偏限度和采取的措施。10GMP对制药用水制备装置的要求⒈结构设计应简单、可靠、拆装简便。⒉为便于拆装、更换、清洗零件,执行机构的设计尽量采用标准化、通用化、系统化零部件。⒊设备内外壁表面,要求光滑平整、无死角,易清洗、灭菌。零件表面应做镀铬等表面处理,以耐腐蚀,防止生锈,设备外表面避免用油漆,以防剥落。⒋制备纯化水设备应采用低碳不锈钢或其他经验证不污染水质的的材料,制备纯化水的设备应定期清洗,并对清洗效果进行验证。11

GMP对制药用水制备装置的要求⒌注射用水接触的材料必须是优质低碳不锈钢(例如316L不锈钢)或其他经验证不对水质产生污染的材料。制备注射用水的设备应定期清洗,并对清洗效果进行验证。⒍纯化水储备周期不易大于24h,储罐易采用不锈钢材料或经验证无毒耐腐蚀,不渗出污染粒子的其他材料制作。保护其通气口应按装不脱落纤维的疏水性除菌滤器。储罐内壁应光滑,接管和焊缝不应有死角和沙眼。应采用不会形成滞水污染的显示液面、温度压力等参数的传感器。对储罐定期清洗、消毒灭菌,并对清洗、灭菌效果进行验证。12

GMP对制药用水输送的要求⒈纯化水和制药用水宜采用易拆卸、易清洗消毒的不锈钢泵输送。在需用压缩空气或氮气压送的纯化水和制药用水的场合,压缩空气和氮气需净化处理。⒉纯化水宜采用循环管路输送。管路设计应简洁,应避免盲管和死角。管路应采用不锈钢管或经验证无毒、无腐蚀、不渗出污染粒子的其他管材。阀门宜采用无死角的卫生级阀门,输送纯化水应表明流向。⒊输送纯化水和注射用水的管道和输送泵应定期清洗、消毒灭菌,并对清洗、灭菌效果进行验证,验证合格后方可使用。13

GMP对制药用水设备清洗的要求设备清洗的规程应遵循以下原则⒈有明确的清洗方法和清洗周期。⒉明确关键设备的清洗验证方法。⒊清洗过程和清洗后检查的数据记录并存档保存。⒋无菌设备的清洗,尤其是直接接触药品的部位和部件必须灭菌,并表明灭菌日期,必要时进行无菌验证。经灭菌的设备在3天内使用。⒌某些可移动的设备可移到清洁区进行清洗、消毒和灭菌。⒍同一设备连续加工同一无菌产品时,每批之间要清洗灭菌,同一设备加工同一非灭菌产品时,至少每周或每生产三批后进行全面的清洗。14

我国GMP对制药企业制水系统微生物污染的要求

《药品生产质量管理规范》对生产企业工艺用水系统的要求,如制药企业水系统的要求

可以看到，新版GMP强调了水系统的“制备、储存和分配应能防止微生物的滋生，这就对整个系统设备和管道的材料构成、管道回路的布局和设备性能提出了特别的要求。并加强了微生物限度的检测。15工艺用水系统的验证

我国1998版《药品生产质量管理规范》（GMP）的第十四章第八十五条将“验证”定义为“证明任何程序、生产过程、设备、物料、活动或系统确实能导致预期结果的有文件证明的一系列活动”。验证是药品生产及质量管理中一个全方位的质量活动，它是实施GMP的基础。工艺用水系统同样也存在验证工作。16工艺用水验证的基本思路

⑴证明水系统在已有的或未来的操作情况下，工艺用水的质量与预期设计的一致。⑵验证必须用文件证明，当根据设计的操作方法和规程，管理工艺用水系统时，系统能稳定地生产出一定数量和质量的水。⑶虽然验证通常需要进行适当的挑战性实验，但验证方法需认真考虑；如给水系统人为接种微生物或加入内毒素以考察其去除污染的能力是不切实际的。17

一般都是按照FDA的观点进行验证，采用以下两类方法验证系统的可靠性：⑴定期检测微生物学指标。⑵在特定的监控部位安装监控装置，对水系统的有关部位取样检测，以确保整个系统始终达标运行。18

FDA在1993年的《高纯水检查指南》中论述，工艺用水系统的验证一般可分为3个阶段。⑴初始验证阶段当确认所有设备和管路均已正确安装并能按要求运行，则可以进入水系统的初始验证阶段。

19

⑵运行阶段也称同步验证阶段。通过系统验证的第二阶段应能证明，按SOP运行，系统始终能稳定地产出符合质量标准的水。⑶长期考察阶段通过系统验证的第三阶段证明，按SOP运行，系统能在相当长的时间内始终产生符合质量要求的水。20制药工艺用水的污染

水是一种良好的溶剂，能溶解各种固态、液态和气态的物质;⑴含有各种盐类和化合物，溶有CO2。⑵胶体和大量的非溶解性物质如腐殖质胶体、黏土、沙石、微生物、浮游生物等。⑶排放的废水、废气和废渣等有害物质。21制药用水系统的污染

大体上可分为外源性污染和内源性污染两种。

外源性污染主要指原水及系统外部原因所致的污染。

内源性污染指制药用水系统运行过程中所致的污染。

22

原水的污染是制药用水最主要的外源性污染源。美国药典、欧洲药典及中国药典均明确要求制药用水的原水至少要达到饮用水的质量标准。⑴饮用的水质与其水源的污染相关。水系统的外源性污染23

水系统的外源性污染

⑵贮罐的排气口无保护措施或使用了劣质气体过滤器、用于混和混床中阴阳离子树脂的压缩空气中存在污染菌。⑶水从污染了的出口倒流。⑷地漏的缺陷以及更换活性炭和去离子树脂来的外源性污染等。24

水系统的内源性污染

内源性污染的影响因素⑴制水系统的设计⑵选材⑶运行⑷维护⑸贮存⑹使用25

水系统的内源性污染

水系统的组成单元均可能成为微生物内源性污染源。原水中的微生物被吸附于活性炭、去离子树脂、过滤膜或其它设备的表面上，可形成生物膜。生物膜中的微生物受到生物膜的保护，增强了抵抗力如对消毒剂有一定的抵抗力。26

细菌内毒素

热原药学上通常是指那些能致热的微生物代谢产物。大多数细菌和许多霉菌都能产生热原。革兰阴性杆菌的代谢产物，致热能力强是造成热原反应的最主要因素。内毒素除了引起高烧外，还有凝血、致代谢紊乱、血小板积聚、骨髓坏死等毒副作用，这是各国重视控制细菌内毒素污染的重要原因。27

制药用水的质量标准

1、纯化水ChP2005BP2008/EP6.2USP2009ChP2010酸碱度酸碱度氯化物

硫酸盐

钙盐

硝酸盐(60ppb)硝酸盐(2ppm)硝酸盐(60ppb)亚硝酸盐(20ppb)亚硝酸盐(20ppb)氨(0.3ppm)氨(0.3ppm)电导率电导率

电导率易氧化物TOC或易氧化物TOCTOC或易氧化物不挥发物(1mg/100ml)不挥发物(1mg/100ml)重金属(0.3ppm)重金属(0.1ppm)重金属(0.1ppm)铝盐(10ppb)微生物总数不得过100个/1ml微生物总数不得过100个/1ml微生物总数不得过100个/1ml28

制药用水的质量标准

2、注射用水

ChP2005BP2008/EP6.2USP2009ChP2010pH5.0-7.0pH5.0-7.0(加KCL)

氨(0.2ppm)氯化物、硫酸盐、钙盐、硝酸盐、亚硝酸盐、二氧化碳、易氧化物、不挥发物与重金属均同纯化水、电导率硝酸盐(2ppm)

铝盐(10ppb)、电导率硝酸盐，亚硝酸盐，总有机碳、电导率、不挥发物与重金属均同纯化水。细菌内毒素(0.25Eu/ml)细菌内毒素(0.25Eu/ml)细菌内毒素(0.25Eu/ml)微生物总数不得过10个/1ml微生物总数不得过10个/1ml微生物总数不得过10个/1ml29

制药用水的质量标准

3、灭菌注射用水ChP2005BP2008/EP6.2USP2009ChP2010pH5.0-7.0酸碱度pH5.0-7.0(加KCL)pH5.0-7.0(加KCL)氯化物氯化物氯化物氯化物硫酸盐硫酸盐硫酸盐硫酸盐钙盐钙盐和镁盐钙盐钙盐硝酸盐(60ppb)硝酸盐(2ppm)硝酸盐(60ppb)亚硝酸盐(20ppb)亚硝酸盐(20ppb)氨(0.2ppm)氨(0.2ppm)氨(0.2ppm)氨(0.2ppm)二氧化碳二氧化碳二氧化碳易氧化物易氧化物易氧化物易氧化物不挥发物(1mg/100ml)不挥发物(1mg/100ml)不挥发物(1mg/100ml)重金属(0.3ppm)重金属(0.1ppm)重金属(0.1ppm)细菌内毒素(0.25Eu/ml)细菌内毒素(0.25Eu/ml)细菌内毒素(0.25Eu/ml)细菌内毒素(0.25Eu/ml)

电导率电导率无菌，可见异物，

不溶性微粒无菌，可见异物无菌，可见异物无菌，可见异物，

不溶性微粒30

制药用水的质量标准

2010版《中国药典》关于制药用水的质量标准，除适当减少了某些化学检查项外，主要是增加了两项检查：⑴电导率检查：用于控制各种阴阳离子的污染程度。⑵总有机碳检查：控制有机污染（有机小分子）。31我国制药用水质量标准概况1980年电子工业的高纯水试行标准。1994年电子机械工业部制定了高纯水JB/T7621-1994行业标准。制药行业参照电子机械工业部行业标准的个别项目。2000版《中国药典》收载了纯化水和注射用水的标准并规定了使用范围。2005版《中国药典》在纯化水和注射用水项下增加了微生物限度标准和检验方法。以上发展可以看出我国对制药用水的质量规定在不断加强,GMP对制药企业制水系统的要求也逐渐加强。2010版《中国药典》32我国现行制药用水微生物质量标准及检验方法

饮用水

GB5749-2006替代了GB5749-1985标准,微生物检查指标由2项增至6项;增加了大肠埃希菌、耐热大肠菌群、贾第鞭毛虫和隐孢子虫检查,修订了大肠菌群的检验方法。

标准指标限值大肠菌群／MPN／100ml或cfu／100ml不得检出耐热大肠菌群／MPN／100ml或cfu／100ml不得检出大肠埃希菌／MPN／100ml或cfu／100ml不得检出菌落总数／cfu／ml100贾第鞭毛虫／10L＜1个隐孢子虫／10L＜1个注①大肠菌群MPN表示最可能数。当水样检出总大肠菌群时,应进一步检验大肠埃希菌或耐热大肠菌群。②CFU表示菌落形成单位。33我国现行制药用水微生物质量标准及检验方法纯化水

标准微生物限度细菌、霉菌和酵母菌总数每1ml不得过100个。

检验方法取本品，采用薄膜过滤法处理后，依法检查。注射用水

标准细菌、霉菌和酵母菌总数每100ml不得过10个。

检验方法取本品至少200ml，采用薄膜过滤法处理后,依法检查。灭菌注射用水

标准无菌应符合规定。

检验方法照2010版《中国药典》附录无菌检查法检查。34

检验方法总大肠菌群检验意义大肠菌群作为水质污染的指示菌有近90年的历史。大肠菌群是指一群在35~37℃培养能发酵乳糖,24h能产酸产气,需氧和兼性厌氧、氧化酶阴性的革兰阴性无芽孢杆菌。除包括埃希菌属(Escherichia)还包括肠杆菌科的肠杆菌属、枸橼酸菌属、克雷伯菌属(Klebsiella)。肠杆菌属中以产气肠杆菌(E.aerogenens)和阴沟杆菌(E.cloacae)多见，克雷伯菌属中以肺炎克雷伯菌(K.pneumonlae)多见。35大肠菌群分类生化试验大肠埃希菌属枸橼酸菌属克雷伯菌属肠杆菌属ⅠⅡⅢⅣⅠⅡⅠⅡⅢⅣⅠⅡ靛基质试验（I）+-+--+-+---+甲基红试验（M)++++++------V–P------++++++枸橼酸盐利)----++++-+++用试验(CH2S----（+）（+）------乳糖（44.5℃）+--+-----+--36

大肠菌群检验方法

国际上对大肠菌群检验有3中不同体系⒈直接检查大肠埃希菌,一步到位。⒉检查大肠菌群。⒊只要是发酵型细菌便可认为是大肠菌群。采用了葡萄糖发酵试验,包括了肠杆菌科所有细菌。

1964年我国食品卫生是直接检查大肠埃希菌,一步到位,为了与国际接轨。1974年开始采用国际上通用的检查大肠菌群。因为药品、食品及饮水等样品中检查大肠菌群比大肠埃希菌检出率高对卫生质量更严格,因此世界各国均以大肠菌群作为药品、食品及饮水等的卫生生指示菌。37

大肠菌群检验方法

我国GB／T5749-2006收载的检验方法有三种;多管发酵法、滤膜法(薄膜过滤法)及酶底物法,检验步骤如下;

一、多管发酵法⒈乳糖发酵试验接种乳糖胆盐培养基。⒉分离培养伊红美兰培养基典型菌落深紫黑色、具金属光泽，紫黑色、不带或略带金属光泽，淡紫红色、中心较深。革兰染色革兰阴性无芽孢杆菌。⒊证实试验取上述典型菌落接种乳糖胆盐培养基,发酵乳糖并产酸、产气。⒋结果判断发酵乳糖;产酸、产气,判总大肠菌群存在。⒌报告查总大肠菌群检索表报告每100ml水样中总大肠菌群最可能数(MPN)值或总大肠菌群阴性。

38

二、滤膜法(薄膜过滤法)

将水样置过滤器中抽滤,水样全部通过孔径0.45um的滤膜,将污染微生物全部截留在滤膜上。⒈滤膜及滤器灭菌⒉过滤取水样100ml全部过滤。⒊培养取出滤膜贴在制备好的培养基上培养(品红亚硫酸钠培养基)。⒋挑选典型菌落紫红色、具金属光泽，深红色不带或略带金属光泽,深红色、中心较深。⒌确认试验接种乳糖胆盐培养基。⒍结果判断发酵乳糖;产酸、产气,判总大肠菌群存在。⒎报告总大肠菌群菌落数(cfu／100ml)＝滤膜菌落数×100／水样体积。39三、酶底物法在选择性培养基上能产生β-半乳糖苷酶(β-Dgalactosidse)的细菌群组分解色原底物释放出色原体,使培养基ONPG-MUG(MMO-MUG)的颜色改变来检测大肠菌群。⒈检验程序⑴水样稀释⑵定性反应

100ml水样加入2.7gMMO-MUG培养基,完全溶解,培养。⑶10管法①100ml水样加入2.7gMMO-MUG培养基,完全溶解。②分别取10ml加入无菌试管中,培养。⑷定量盘(51孔)法①100ml水样加入2.7gMMO-MUG培养基,完全溶解。②将上述溶解的水样全部倒入无菌51孔定量盘内,培养。40⒉结果判断及报告

培养24h后判断结果,必要时可延长至28h报告。⑴定性反应结果判断培养后呈现黄色为阳性反应,表示水样中含总大肠菌群。报告检出或未检出总大肠菌群。⑵10管法

结果判断培养后呈现黄色为阳性反应,表示该试管中含总大肠菌群。报告计算阳性管数从表中查出总大肠菌群最可能数(MPN)

,结果以MPN／100ml表示。41⑶定量盘(51孔)法结果判断培养后孔内培养物呈现黄色为阳性反应,表示该孔含总大肠菌群。报告计算阳性孔数从表中查出总大肠菌群最可能数(MPN)

,结果以MPN／100ml表示。42耐热大肠菌群检验方法

是一群不仅能在35~37℃生长,在44.5℃仍能生长的大肠菌群称为耐热大肠菌群,多是直接来自近期人和动物粪便中的大肠菌群亦称为粪大肠菌群。检验方法采用多管发酵法和滤膜法(薄膜过滤法)检验方法步骤同总大肠菌群检验方法。

43

大肠埃希菌检验方法

GB5749-2006收载三种检验方法；多管发酵法、滤膜法、酶底物法

1、多管发酵法是指总大肠菌群检验阳性培养物，在含有荧光底物培养基上，44.5℃培养24h产生β-葡萄糖醛酸酶分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外灯下产生特征性荧光的细菌，以此来检测水中大肠埃希菌的方法。44检验步骤⑴接种取大肠菌群阳性培养物接种至EC-MUG培养基（该培养基含有β-半乳糖苷酶(β-Dgalactosidse)）。⑵培养

44.5℃±0.5培养24±2h。⑶结果判断与报告培养物在366nm灯光下有兰色荧光，判检出有大肠埃希菌。根据阳性管数查表（MPN）以MPN/100ml报告。45

2、滤膜法范围本标准规定了用滤膜法测定生活饮用水及其水源水中的大肠埃希氏菌。本法适用于生活饮用水及其水源水中大肠埃希氏菌的测定。

将大肠菌群检验阳性培养物经滤膜过滤后取出滤膜贴在含有荧光底物的培养基上（NA-MUG平板琼脂培养基），在规定温度培养，菌落在366nm紫外灯光下呈亮兰灰色荧光。463、酶底物法

原理试验证明97%的大肠埃希菌和约10％的沙门菌属，部分志贺菌含有β-葡萄糖醛酸酶（p-glucuronidase，GUD），利用目标菌限定酶可以直接分解作用的底物的水解产物4-甲基伞形酮葡萄糖苷酸（4-Methytumbelliferyl-β-D-glucuronide．MUG）产生荧光。该法易于观察，快速，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。

漏检率其漏检率达6％．需将增菌培养物进行分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。

检验方法同大肠菌群检查。47酶底物法试验注意事项1．MUG法除大肠埃希菌外，尚有部分志贺菌属、沙门菌属的菌株；以及少数革兰阳性球菌、杆菌和芽孢菌，其MUG为阳性。因此．在MUG培养基成分中增加了去氧胆酸钠的量，可排除革兰阳性菌的干扰。至于志贺菌、沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难生长。2．配制MUG培养基时，务必校正pH值，灭菌后pH不得过7.4。否则pH值偏高．MUG分解。本身则显荧光：分装MUG培养基的试管应挑选，试管、蛋白胨不得显荧光。483．MUG一般培养4h和24h要观察是否产生荧光，如荧光很微弱，不能准确判断时．可延长培养至48h再观察结果。①由于大肠埃希菌各菌株间的GUD（β-葡萄糖醛酸酶）的活性不完全相同．对底物和底物的浓度反应的差异。②培养基中选择因子的影响。③培养时间、温度。④pH值的改变。⑤大量竞争菌和样品本身物质成分的干扰等，对结果的判断亦有影响。494.

MUG试验阳性对照、阴性对照同时在366nm紫外灯下观察，阳性对照应有较强的蓝白色荧光，阴性对照无荧光。供试品MUG是否有荧光，应仔细观察比较。5.供试品中污染的大肠埃希菌，易受外来因素影响。在曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂平板上的菌落形态特征时有变化，挑取可疑菌落往往凭经验，主观性较大，务必挑选2～3个以上菌落分别进行试验鉴别．检出阳性菌的机率越高．避免漏检。50国际药典收载的大肠埃希菌检验方法的比较

ChPBP