PCR实验室防污染措施及应急处理方法

PCR实验室防污染措施及应急处理方法一、 PCR实验室的污染来源1、 样本间交叉污染：收集样本的容器被污染或样本密封不严外溢；不同样本移液时忘记更换枪尖或未使用带滤芯枪尖；移液器等实验器具及耗材未及时消毒灭菌；不同样本同时开盖或样本剧烈震荡、反复吹吸导致气溶胶形成扩散，相互交叉污染。2、 实验试剂污染：主要是在PCR组分试剂加样过程中，由于移液器、容器、阴性对照及其它试剂被核酸模板或阳性对照污染。加样过程中，因为PCR试剂对温度十分敏感，需要通过冰浴使得PCR试剂和PCR板/管处于0°C，但这个过程也是充满了污染的风险的。3、 扩增产物污染：大量拷贝的产物泄漏或扩增后的PCR反应管意外开盖，这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。4、 克隆质粒污染：作为阳性质控品的克隆质粒外溢。二、 PCR实验室的防污染方法按照实验室的安全工作制度或安全标准操作程序，所有操作符合《实验室生物安全通用要求》(GB19489-2008)。1、严格执行各区功能划分：试剂储存和准备区：贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备，以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。标本制备区：核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管。对于涉及临床样本的操作，应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。扩增区：cDNA合成、DNA扩增及检测。扩增产物分析区：扩增片段的进一步分析测定，如杂交、酶切电泳、变性高效液相分析、测序等。试剂准备区、样本制备区和扩增区内的实验用品，包括移液器等器具应专用，空气、物品流向依次为：试剂准备区、样本制备区、扩增区、产物分析区，不可逆行。2、 清洁的实验用品：实验室自配试剂（去离子水、缓冲液等）和所有使用器具在使用之前均应高压灭菌或紫外杀菌。枪尖、反应管等实验耗材应一次性使用。3、 正确的实验操作：实验应在超净工作台内进行，工作台内应放置PCR专用的微量离心机、各量程的移液器和其他必须物品。实验的过程中选择最合适尺寸的手套并能及时更换，在进出不同实验区域或进行模板操作后都应更换实验服、口罩、帽子及手套，以避免不同实验区交叉污染。装有PCR试剂的反应管在打开之前应先瞬时离心，将管壁及管盖上的液体离至管底，降低污染手套或加样器的风险；谨慎开启反应管，防止管内液体溅出或形成气溶胶导致污染。吸加试剂和模板的操作应严格按照规范要求进行，遵守“慢吸快打”原则，尽量一次性完成，忌多次抽吸，以避免气溶胶产生的交叉污染。PCR试剂建议小量分装，以减少反复冻融、重复取样次数；多样本PCR反应时，先配制反应混合液分装至反应管中，最后加入样本核酸，请勿同时开盖，尽量保证单人单管，实现完全闭管操作。实验试剂应与样品和PCR产物分开保存，不应放于同处。PCR扩增实验完成后及时将反应管取出，用一次性手套将产物反应管包裹丢弃，保证管盖紧闭。4、 规范的实验设计：应遵循实验室内部质量控制的相关规定，实验中设立阳性对照、阴性对照和空白对照，全程质控实验过程，验证PCR反应的可靠性，并协助判断扩增系统的可信性。三、PCR实验室的污染应急处理方法1、若核酸样本溢出：立即用布或纸巾覆盖，由外围向中心倾倒10%的次氯酸消毒剂，约30分钟后，清除污染物品，再用次氯酸消毒剂擦拭，并用75%酒精喷洒，移动紫外车定点照射1小时。2、其他不明情况污染：1、 暂停所有实验操作；2、 清理实验室内所有物品，寻找污染来源；3、 加大实验室的通风；4、 对实验室内所有表面（台面、地面及墙面）进行消毒；5、 75%酒精空中喷雾；6、 开启紫外消毒装置，延长紫外照射时间（4小时以上）；7、 以上措施每日进行，直至污染消除；用新试剂及确认无污染的器材进行原污染项目的试剂空白检测，连续3次均阴性后方可进行常规检测。新生儿病房（室）医院感染控制制度1、 新生儿病房（室）应独立设置，布局合理，内设新生儿病室、新生儿重症监护室、隔离室、配奶间、沐浴室、治疗室等，各区划分明确，严格管理；病房（室）入口处设置缓冲区，内设洗手设施和更衣室，工作人员入室前应严格洗手、更衣、换鞋。2、 工作人员如患上呼吸道感染应戴口罩，患肠炎、痢疾、肝炎或皮肤感染应暂离新生儿室，防止交叉感染。皮肤有伤口的工作人员暂时停止与新生儿接触。3、 新生儿视病情洗澡，所用朴粉、油膏、沐浴液、浴布、治疗用品等，应专人专用，避免交叉使用。尿布宜柔软、清洁、消毒、勤洗勤换，保持臀部干燥。4、外来物品，包括尿片等，应严格清洁消毒，方能带入病房。5、 连续使用的氧气湿化瓶、雾化器、早产儿暖箱等器材必须每日清洁、通风、或消毒，水槽每日更换无菌水。温箱停用时，排气孔要定期擦拭、海绵干式保存。6、 配奶用具必须保持清洁，配奶时应实施无菌操作，哺乳用具一婴一用一消毒。7、 新生儿病房（室）室温应保持在22-24°C，相对湿度为55-65%；保持室内空气清新，按II类环境要求配备空气消毒装置，坚持每日清洁消毒制度，定时开窗通风，保持桌面、床台、地面等处的清洁整齐，地面湿式清