膜片钳常见问题汇总（人人都会膜片钳）

人人都会膜片钳膜片钳常见问题汇总目录膜片钳系统 4做膜片钳之前 4什么是膜片钳？Patchclamp 4信号流 4重要概念： 4膜电位： 4参考电极： 5记录电极： 5电极参数： 5电极参数对patch的影响： 5怎样得到需要的电极参数？ 6膜被动反应参数： 6细胞外液的配置要注意什么？ 6电极内液配置有什么要求？ 7没有渗透压仪，怎么计算渗透压？ 7封接时需要给正压吗？ 7为什么封接维持不了很长时间？ 7膜片钳放大器到底记录哪些参数？ 8快电容与慢电容 8Mode： 8Membranetest测试脉冲怎样设置？ 9钳制电位是什么？如何设置？ 10达不到G欧封接的原因 10脑片细胞破膜困难怎么办？ 10什么是protocol?什么是Ramp?什么是step? 10记录时发现Overload信号灯闪，为什么？ 10解决噪音与基线问题的通用招数： 10基线怎么老是上下跳动？ 11滤波频率，采样频率的应该如何设置？ 11Whole-cell问题及解答 12全细胞记录一般使用什么样的电极内液？ 12如何确定已经破膜？ 12是否每次一定要做电容消除、串连电阻补偿、漏减、和液接电位矫正？ 12什么是尾电流，他主要反映通道的什么特性及用在那些方面？ 13实验记录应该保留那些参数？ 13记录到的电流幅度差异大怎么办？ 13为什么我记录到的电流越来越小？ 13什么是漏电流，为什么要做Leaksubtraction？ 13Cell-attached单通道记录问题及解答 14其他记录模式常见问题及解答 14数据分析 14如何分析突触放电活动数据？ 14如何选用数码滤波类型？ 14细胞类型 15急性脑切片 15要保证细胞活性需要注意什么问题？ 15脑切片一般切多厚合适？ 15如何判断脑片细胞的好坏？ 15ACSF的配方中的Mg离子，有的用的MgSO4，有的用的MgCl2，他们有什么区别？ 15培养脑切片 15急性分离神经元 15分离大鼠海马神经元的方法 15培养神经元 16为什么我们用培养的大鼠海马神经元记录NMDA电流，总是会出现电流的衰减? 16急性分离细胞 16怎样用离体灌流的方法急性分离大鼠心肌细胞？ 16如何对心肌细胞悬液进行复钙？ 17心肌细胞急性分离液体一般配方： 17分大鼠心肌细胞，液体充氧是用的是纯氧、还是95％O2和5％CO2的混合气？ 17心肌细胞急性分离是用什么酶，消化多少分钟比较好？ 17如何通过观察细胞状态调整酶浓度？ 17如何判断心肌细胞的状态？实验室需要持续灌流吗？ 18用消化酶灌流心脏后整个心脏迅速变白,不知道是什么原因？ 18分离平滑肌细胞需要注意什么？ 18如何分离动脉平滑肌细胞？ 18分离动脉平滑肌细胞用什么酶？怎么判断消化时间是否合适？ 18平滑肌细胞patch要注意什么？ 18急性分离的DRG要消化到什么程度才合适，进行全细胞膜片钳？ 19细胞系 19HeK293细胞转染多长时间合适？ 19为什么我记录的细胞没有Ca电流呢？ 19我记录的细胞非常扁平，不好patch怎么办？ 19离子通道问题 20离子通道的种类： 20什么是离子通道的激活，失活，去激活？ 20如何绘制离子通道的激活曲线？ 20如何绘制离子通道的I-V曲线？ 20什么叫整流？内向整流、外向整流的区别有什么区别？ 20如何绘制离子通道的失活曲线？ 21钾离子通道 21神经元钾通道电流的电极内液和细胞外液配方 21如何记录及确认KATP电流？ 21记录KATP电流内液加不加Na2ATP的问题？ 21钠离子通道 21钙离子通道 21外液中用Ba2+取代Ca2+对不同的钙电流会有什么不同的影响？ 21全细胞记录不到Ca2+电流,好像还是K+电流,都是正向电流 22电极内液和细胞外液都用了TEA-Cl，仍然没有记到Ca电流，是什么原因？ 22记录L型Ca电流，阻断Na电流应该加TTX吧? 22记录钙离子通道电流的时候，怎样判断记录的就是钙电流，而不是其它通道电流？ 22电极液中已加过TTX和TEA-Cl，用不用再判断记录电流为钙电流？ 22氯离子通道 22水通道 22膜片钳配套设备问题 23刺激器与刺激电极 23隔离器 23微操 23那个牌子的微操比较好？ 23微操一动就有噪音怎么办？ 23为什么patch上细胞以后，电极一会儿就不在原来的位置了？ 23电极拉制仪 23我应该选垂直拉制仪还是水平拉制仪？ 23换了新的铂金片，如何重新设置拉制仪参数？ 23我用的水平拉制仪，两根电极参数差很多怎么办？ 24电极抛光仪 24我做脑片细胞，电极要不要抛光？ 24显微镜 24灌流给药系统 24震动切片机 24膜片钳相关设备\软件的具体操作 25怎样连接放大器和Digitizer？ 25MultiClamp700A中，在放大器和信号器的连接中，放大器的rawoutput是否需要连接信号器的ANALOGIN接口?scaledoutput，rawoutput有什么区别? 25AxonCNS中如何消除膜电容？ 25使用Clampex

8.0记录配体门控离子通道电流，protocol

如何设置 25膜片钳采集软件Clampex的Acquisition

Mode中Fixed-Length

Events

Mode和Variable-Length

Events

Mode是如何采样的？ 26附录膜片钳系统设备与参考价格 26附录国内著名电生理实验室目录 28附录国外著名电生理实验室目录 28附录国内外电生理设备供应商 29附录名词目录 30

膜片钳系统（不包括细胞）：做膜片钳之前对于实验所用样本一定要有足够的了解，不同的细胞系，不同的动物种属，甚至不同的制备方法，离子通道的表达都有巨大的差异，最好是采用前人使用过的模型。千万不要白白浪费时间。什么是膜片钳？Patchclamp采用尖端经过处理的微电极与细胞膜发生紧密接触，是尖端下的细胞膜在电学上与其他细胞膜分离，从而降低背景噪声，记录到细胞的微弱电流。该技术的核心就是降低背景噪声：1，G欧封接2低噪声放大器3噪音过滤膜片钳电路可以简单的理解为一个电流表，一个电压表，一个电阻，一个命令中心施加电压和电流刺激。信号流Amplifier命令电压或刺激电流（数字信号）AD/DA转换（转换成模拟信号）细胞AD/DA转换（转换成数字信号）Amplifier重要概念：膜电位membranepotential，静息膜电位restmembranepotential，电极电阻PipetteResistence；电极电容PipetteCapacitance；液接电位LJP；串联电阻Rs；膜电阻Rm；膜电容；快电容C；慢电容；钳制电位Vh；去极化depolarization；超极化Hyperpolarization；membranetest；protocol；ramp；step；电容充电反应；膜电位，静息电位，超极化，去极化，反转电位：细胞膜内外两侧的电位差称为膜电位（membranepotentialVm）。离子顺浓度梯度进行移动，但细胞膜在静息状态下仅离子的通过具有选择性，主要为K离子，因此，K离子的由内向外的单向流动造成膜内外电位差，从而产生静息电位（RestmembranepotentialRMP），一般为-70mV左右。如果膜内电位变的更负，称为超极化Hyperpolarization，反之，称为去极化depolarization。当细胞受到刺激，膜上部分Na通道打开，产生去极化，当刺激足够大，膜电位达到一个临界值，大量Na通道打开，造成动作电位(ActionpotentialAP)，这个临界值称为阈电位thresholdpotential。反转电位是针对某种离子来说的，即离子的平衡电位。参考电极：氯化银电极通过氯化银电解导电，具有消耗性，发白了就要重镀。镀之前用砂纸或刀片打磨干净。泡到84或者饱和KCl溶液里。84要快一些，一个小时就够了。也可以电镀，可以使用专门的电镀仪，或者将使用刺激器电镀：正极氯化银电极，负极连接金属丝，同时放入饱和84或者饱和KCl溶液里，然后设定刺激器的刺激电压，数秒完成。常见问题：基线不稳，氯化银消耗太多了，需要重镀。直流漂移：基线不断向一个方向移动。内外液氯离子差太太，需要重新考虑配方或者使用盐桥参考电极。记录电极：氯化银电极：同上，注意镀的时候不要整个镀黑，上端连接电路的部分要露出银丝，不然断路了。玻璃电极：分为有芯和无芯。不同细胞，不同记录需要的电极参数不尽相同，参考群文《pipettecookbook》。电极保存不好很容易变脏，会增加封接难道和噪音，一般用无水乙醇浸泡数小时，用超声清洗10min，然后放到烤箱烤干。电极抛光，对于记录脑片尤其需要，如果记录单通道还可能要对电极进行涂胶。电极参数：电极电位：固体电极与液体内液之间产生的电位差。电极电阻：玻璃微电极本身的电阻，主要有电极开口大小决定，为串联电阻的主要成分。电极电容：快电容的主要成分，是浸液部分电极内外液之间形成的跨壁电容和非浸液部分与临近地表形成的漂浮电容。电极参数对patch的影响：小开口，高电阻有利于封接，但难以破膜，而且破膜以后开口容易被重新堵上（reseal）.适合记录小细胞，或者细胞状态不太好的时候。短时间记录大开口，低电阻不利于封接，但容易破膜，不容易reseal.适合细胞状态好的时候，能够长时间记录比较稳定的电流。一般细胞，电极电阻4M-5M左右比较容易封接，破膜。小细胞适当提高阻抗。怎样得到需要的电极参数？1-1-1膜被动反应参数：膜电阻membraneresistance：一般指膜上离子通道未开发是的膜输入电阻，一般为数百兆到数G。也称被动膜电阻或者漏电阻。膜电容membranecapacitance：指细胞膜内外液之间的电容，为慢电容的主要成分。膜漏电流leakcurrent：也称被动发应电流，包括膜电容电流和膜稳态电流。膜电容电流发生在脉冲起始部位和结束部位，是膜电容充放电反应，电流较大，持续时间很短。膜稳态电流发生在脉冲持续期间，电流小，持续时间长，电流大小与脉冲电压成正比。细胞外液的配置要注意什么？根据细胞类型和记录电流不同，配方会有变化。PH值，7.4左右。有时需要通CO2调节。渗透压300-310Osm。一边搅拌一边加试剂，避免生成Ca沉淀。存储液一般配4X，不加葡萄糖。最好现用现配。电极内液配置有什么要求？根据记录的方式，电流的不同，电极内液有所不同。一般为等张液，也有用低渗液，比外液渗透压低-10mOsm（据说利于封接）.PH值一般为7.3左右。配置后2μm滤网过滤，分装，-80可保存一年左右。电极内液一般会加入EGTA，酸性环境难溶，需要在碱性环境下首先融掉。没有渗透压仪，怎么计算渗透压？根据离子浓度可以计算渗透压，比如120mMNaCl,产生240mMOsM渗透压。外液渗透压在300左右。内液可以稍低。封接时需要给正压吗？单细胞不需要，或者给很小的正压。单细胞比较脆弱，很容易被吸到电极里。脑片细胞一般需要给正压，细胞周围比较脏，给适当正压更利于封接。为什么封接维持不了很长时间？好的封接单细胞可以维持30分钟以上，脑片细胞可以维持的时间更长。如果不能维持到理想的时间需要检查一下几个方面：细胞状态。内外液。所有细胞状态开始很好，然后迅速变差，一般为外液问题。每个细胞都很好封接，但维持不了很长时间，一般为内液问题。电极开口过大，很快就掉。过小，很快reseal。物理原因，比如震动。膜片钳放大器到底记录哪些参数？放大器直接记录的有电流，电压，时间，其他参数都是通过这三个参数计算得来。膜片钳系统的计算方式：1-1-2Rm,Rs的计算见axonguide或刘振伟实用膜片钳技术。快电容与慢电容快电容Cfast:主要指电极电容，形成G欧封接之后补偿，必须补偿，原因如下：细胞对命令电压的反应延迟Tau=RsCm影响钳制电位Vm=Vcmd*Rm/(Rm+Rp)限制摄取电信号的频带宽。（-3dB）f=1/2πRsCm慢电容Cslow:主要指形成全细胞记录后的细胞膜电容，破膜之后补偿。Mode：电极未入水，电路是断路状态，理想电阻无限大，理想电流为0.Bath:记录电极入水，电路接通。基线调零（LJP调零），正常电极电阻为3-6M左右，可根据细胞类型自己调整。一般此时给一个方波刺激（Membranetest），此时电路主要电阻为电极电阻（其实还有各种其他电阻，此处忽略），电流≈方波电压/电极电阻。系统显示电极电阻Ra。Patch:电极接触细胞，细胞膜片电阻接入电路，电流开始变小，直到形成G欧封接，电流≈方波电压/（串联电阻Rs+封接电阻Rm）。同时看见电极电容的充电反应,此时补偿Cfast。Rm为G欧以上，可能高达十几G。此时理想电流接近零。Wholecell:打破细胞膜，整个细胞被接入电路。电流≈方波电压/（串联电阻Rs+细胞膜电阻Rm）。理想Rm为数百兆到数G，因此电流也不大，可以见到很强的电容充放电。如需要，此时补偿Cslow。（）1-1-3Membranetest测试脉冲怎样设置？Membranetest是检测细胞膜输入电阻，即离子通道未打开时的电阻，因此不应将测试脉冲设置太大，否则离子通道开放，导致误差。也不应该太小，太小也会导致误差，因为系统的精确度有限。测试脉冲越小，误差越大。所以一般测试脉冲设置在5-6mV,最大不超过10mV.另外，测试脉冲的时间不能太短，必须要等到膜电容充电反应结束，形成稳态电流，一般需要设置为数个ms。电极入液后，测试脉冲变小或者消失是怎么回事？说明电路阻抗增大或断路：电极尖端是否有气泡？参考电极是否入液？有大的直流漂移，需要重镀氯化银电极。检查是否有其他地方断路。比如是否将氯化银电极整根镀了，而没有留出银丝部分。放大器与数模是否连接。电极入液后，测试脉冲变的很大怎么回事？说明阻抗变小或者短路：电极尖端是否折断？电极夹持器是否被液体污染？接地不良钳制电位是什么？如何设置？电压钳模式下，系统通过放大器或者软件，将细胞跨膜电位固定在某一数值，这一数值即为钳制电位(holdingpotential)。电位一般钳制在细胞的静息电位，或者测量的离子通道的反转电位。Clampex可以在realtimecontrolpanel设置cmd，也可以在membranetest设置holding，还可以protocoleditor设置每一个输出通道的holdingpotential达不到G欧封接的原因1细胞种类和状态问题。2电极问题，清洗，抛光，调节电极参数，小开口更利于封接。3液体问题，更换内外液。外液中的Ca,内液中的ATP都有利于封接。4气路漏气或者气路不畅。脑片细胞破膜困难怎么办？增加电极开口，降低阻抗。调整负压，过大会导致电极尖端被堵，无法破膜。给予ZAP，可以同时结合ZAP和负压破膜。什么是protocol?什么是Ramp?什么是step?Protocol是膜片钳系统通过软件给细胞施加的一组电压或电流刺激，可以通过软件对进行编辑。Step，步阶脉冲，连续给予细胞固定电压或电流差的数个刺激，用于制作离子通道I-V曲线，激活曲线。ramp在pClamp软件中表示施加给细胞的一种逐渐变化的电压或电流，称为“斜坡电压或电流”，可用于作通道I-V曲线。记录时发现Overload信号灯闪，为什么？检查电路是否有短路，氯化银电极是否镀好。电极没有断头、过粗现象。holder和参比电极的银丝要镀得均匀，时间过久则需要重新镀银。有可能探测到极大的瞬变电流或电压，更改滤波设置，降低瞬变值。说明信号饱和，应降低输出增益gain值，如果仍然闪烁，查看一下反馈电阻设置，看能否选择。解决噪音与基线问题的通用招数：1重镀氯化银电极，包括参考电极和记录电极。2使用cellmodel确定是系统噪音还是干扰。（使用cellmode正常可以排除一切软硬件问题，是排除系统故障的利器！！！）3逐个关掉周围的仪器，排除噪音来源。4检查地线。一点接地，将所有仪器地线接到铜板，然后铜板接地。5更换内外液。灌流时产生噪音怎么去除？1接地。2避免液体一直连续，可参考输液装置。3在管道中加入一根金属管，然后将金属管接地。4将管道用锡纸包起来。5更换低噪音的灌流泵。6使用重力灌流。基线怎么老是上下跳动？如果基线总是围绕0点上限做幅度有限的跳动，一般是因为holding的电压不对导致离子通道开放。尤其是Na离子通道开放更容易有这类情况的发生。如果将Holding的电压设为更负的情况比如-90，情况会好转，就更能确定是因为Na离子通道开放的原因。滤波频率，采样频率的应该如何设置？在进行模拟/数字信号的转换过程中，当采样频率fs.max大于信号中，最高频率fmax的2倍时，即：fs.max>=2fmax,则采样之后的数字信号完整地保留了原始信号中的信息，一般实际应用中保证采样频率为信号最高频率的5～10倍，称为过频采样；采样定理又称奈奎斯特定理。采样频率设置为低通滤波的2倍为最低要求，否则系统会有提示。膜片钳一般设置为低通滤波的5-10倍。采样频率直接决定信号频宽，采样频率越高，越接近真实信号（时间分辨率越高），但缺点是数据量变大，同时膜片钳系统对信号带宽也有限制，比如axon200B全细胞模式的信号带宽为50K。低通滤波必须高于记录的信号频率，因为一般滤波器都会对通带信号有衰减。但一般不超过10K因为信号宽会被电极电阻与细胞电容形成的RC滤波器限制。Whole-cell问题及解答全细胞记录一般使用什么样的电极内液？2-1-1根据所记录的电流不同，内液成分会有变化。如何确定已经破膜？高阻封接形成后，转到全细胞模式，轻轻给予负压吸引破膜，细胞状态好或者破膜困难时还可尝试ZAP破膜。看Cm值，cellattached模式下，Cm一般为数个pF,破膜后为十几个pF到数十个pF甚至更大。细胞越大，Cm越大。Rm值，高阻封接时，Rt为数个G到十几个G，破膜后，会有明显下降。一般为数百M到数个G。破膜后，有明显的细胞膜充放电反应。是否每次一定要做电容消除、串连电阻补偿、漏减、和液接电位矫正？在电压钳实验中，如果需要给予细胞电刺激来改变细胞膜电位（如超极化或去极化），则会出现膜的被动反应，产生电容电流与电阻电流，此时，前者需要用电容补偿消除，后者需要用漏减功能消除。全细胞记录中，串联电阻是必须要补偿的（至少要补偿80%），除非它很小而忽略不计。液接电位（一般在10mV左右）也需要校正，除非它很小。你可采用Clampex软件中的菜单Tools/JunctionPotential功能对其测算，然后决定是否需要校正。什么是尾电流，他主要反映通道的什么特性及用在那些方面？答：在离子通道的激活因素（去极化或超级化）结束时通道的关闭过程叫做去激活(Deactivation)，所记录到的电流称为尾电流（Tailcurrent），主要反映通道的关闭特征。延迟整流性K+离子通道以及一些不同类型的Ca2+离子通道，它们的尾电流均具有电压依赖性，关闭过程呈指数分布，可用指数方程拟合而获得通道关闭过程的时间常数。尾电流的分析对研究电压门控性离子通道的激活、关闭、失活等动力学过程很有帮助。如研究尾电流幅度与脉冲电压的关系、脉冲电压的不同持续时间或尾电流不同的钳制电压对尾电流幅度、衰减时间常数的影响等等。通过这些研究可了解通道关闭过程中出现的不同关闭状态。药物可影响通道的关闭过程，表现为尾电流的衰减过程变快或变缓慢。如何知道静息电位的数值？将细胞钳制模式改为电流钳，不施加任何刺激情况下，所显示的电压即为静息电位。实验记录应该保留那些参数？Cm,Rm,Ra为最基本的参数，必须保留。同时根据自己的要求保留其它参数。（）记录到的电流幅度差异大怎么办？因为细胞大小不均匀，或者通道表达量的问题，电流幅度可能差异比较大，此时可以计算电流密度pA/pF。如果不需要电流的绝对值，还可以将电流进行标准化。为什么我记录到的电流越来越小？全细胞记录所记录到的电流具有rundown的现象，随着记录时间的延长，细胞电流越来越小，对于Ca电流尤其明显。造成rundown现象的原因有：1）细胞内液与电极内液交换，细胞内大分子，信号分子减少。2）细胞内ATP被稀释，但Ca离子排出却是一个耗能的过程。防止或延迟rundown现象的方法：1）电极内液加ATP和GTP;或者采用ATPregeneratingsystem2）采用穿孔膜片钳来记录电流。什么是漏电流，为什么要做Leaksubtraction？漏电流的概念比较混乱，可以指封接电流（封接时从封接处“漏掉”的电流），也可指放大器的系统偏差，还可指膜漏电流。一般来讲，膜漏电流是细胞膜的被动反应电流，是非离子通道电流，因此在记录离子通道电流时要将它去除。膜片钳放大器与采样分析软件都具有将其去除的漏减功能。Cell-attached单通道记录问题及解答其他记录模式常见问题及解答数据分析如何分析突触放电活动数据？Minianalysis可以通过设置参数，分析自发放电的频率，幅度，动力学参数。Clampfit可以通过选取模板分析突触点活动的频率，幅度，动力学参数。如何选用数码滤波类型？如果经过设置膜片钳系统的滤波参数以后，数据仍噪音过大，可以进行数码滤波。一般采用Bessel滤波或者RC滤波方法，信号不失真。如果只是频率分析，则可以选择其他如Butterworth滤波。

细胞类型急性脑切片急性脑切片的步骤：准备所需动物，麻醉。一般采用小于三周的动物，较大的动物细胞活性稍差，可在切片液中加入氯化胆碱。断头取脑（1-3min），要避免损伤。浸入冷的氧饱和的ASCF中1min，取出切片。在冷的ASCF中进行切片，同时通氧，切片厚度约为一般为200uM—400uM，如有条件使用震动切片机。震动频率要快，但不要出现垂直震动。切割速度要慢，每次切割大概1min左右，具体需要根据自己试验条件微调，要注意避免脑片上下翻滚。将脑片转移到孵育槽中孵育待用，转移脑片用吸管或者柔软的毛笔。一般孵育1小时后可以使用。要保证细胞活性需要注意什么问题？1）速度快2）全程氧饱和3）低温脑切片一般切多厚合适？一般为200uM—400uM。如何判断脑片细胞的好坏？健康脑片呈淡黄色，发白说明状态较差边缘清晰，立体感强，尽量避免第一层细胞。如见空泡或者清晰的细胞核，说明细胞已经死亡。电流钳模式下，看静息膜电位，一般为-40mv70mv，根据细胞类型有所变化。是否有自发放电，给予电流刺激，看能否诱发动作电位。（）ACSF的配方中的Mg离子，有的用的MgSO4，有的用的MgCl2，他们有什么区别？有关渗透压，有的配方是295

mOsm，有的300多mOsm，他们又有什么区别？如何调整ACSF的渗透压？

答：用MgSO4和用MgCl2没多大区别，但如果要记录Cl电流，就要有所考虑；另外若所需要的Mg浓度有大的变化，也要考虑到Cl和SO4离子所可能带来的问题。渗透压有个范围，一般在290－320之间都没有问题，精确地测量与调节渗透压需要特殊的渗透压仪，但一般都是通过离子强度进行计算，只要大体在上述范围就行。培养脑切片培养海马切片，急性分离神经元分离大鼠海马神经元的方法成年Wistar大鼠(200~250g)麻醉后(水合氯醛40mg/100g)迅速断头取脑,置于0~4℃的高浓度蔗糖溶液中冷冻约2min,再用振动切片机(WorldPrecisionInstrumentsMA752-045)切成400μm厚的脑片。高浓度蔗糖溶液的成分为(mmol/L):蔗糖234、KCl2.5、Na2HPO41、MgSO44、CaCl20.1、HEPES15、葡萄糖11、用1mol/L的NaOH调pH值至7.3。将切好的脑片置于通以95%O2+5%CO2混合气的EBSS液中孵育1~6h(室温),然后将脑片移入低Ca2+的羟乙基磺酸钠缓冲液中,并在解剖显微镜下用细解剖针按Paxinos图谱所示,将海马CA1区含锥体细胞层的一小块组织从脑片上分割下来将组织块放入用100%O2饱和的HBSS液中(33℃)用链白蛋白酶(proteaseXIV,1.1~1.4mg/ml)消化30~45min后取出置于低Ca2+的羟乙基磺酸钠缓冲液中清洗3次,用尖端经火抛光处理的吸管(口径依次为500、300和150μm)将之吹打成细胞悬液,并移数滴至盖玻片上。待细胞贴壁后,先将盖玻片用浴槽液清洗两遍,再移至浴槽内进行实验。实验仅选用形态为锥形或梭形、有顶树突和基树突特征的锥体细胞进行记录。培养神经元为什么我们用培养的大鼠海马神经元记录NMDA电流，总是会出现电流的衰减?而且我们记录是选择的培养第10-14天的大鼠，可是电流大小不等，具体在100-1500pA间波动，这让我们很疑惑，注明一下，电极内液中我们用了CsCl和ATP、GTP。电流大小不等与细胞大小、细胞状态等都有关，另外更重要的可能与你的给药方法有关，不知你采用的是哪种给药方法？正常情况下，连续诱发受体电流会存在失敏，表现为电流的衰减（幅度减小），但如果在记录过程中细胞状态逐渐不好，也会出现这种情况。我们认为你所选用的细胞培龄没有问题，内液也没问题.急性分离细胞怎样用离体灌流的方法急性分离大鼠心肌细胞？分离大鼠心脏，取用4℃的冰台式液淋在心脏上降低其代谢；将心脏挂上Langendorff装置，用无钙台式液经主动脉逆向灌流，清理心腔内积血，直至心肌停跳，同时剪去多余的组织

。心脏内如有微血栓形成，会导致灌流不充分，这是不能分解出好细胞的重要原因，必要时可在取心脏前，先心腔内给些肝素以防血栓的形成。灌流过程要通氧，保持恒温，灌流速度要稳定。消化液灌流（含胶原酶II~0.2mg/ml)，灌流到流出液变浑浊为止。将酶液冲洗干净！至少50ml台式液。等心脏变得透明，流出液体呈拉丝状，剪下心肌。也可以根据情况先剪一些右心房或右心室的组织，看能否吹打开。在含有100umol/Lca2+和1%牛血清白蛋白的MOPS液中剪碎，吹打，温孵10分钟。KB液中保存待用PATCH前必须进行复钙，然后再使用，否则难以封接。如何对心肌细胞悬液进行复钙？细胞悬液滴在灌流槽中静置，待细胞贴壁后，然后用含钙的细胞外液（一般就是台式液）灌流几分钟。或者将细胞悬液在试管中静置，细胞下沉于管底时，把上清夜用吸管吸掉，再加入含钙的细胞外液。心肌细胞急性分离液体一般配方：（1）无钙台氏液(mmol-1)：NaCl

130，KCl

5.4，KH2PO4

1.2，MgSO4

0.5，HEPES

6.0，Glucose

10.0，PH=7.4

with

NaOH

（2）有钙台氏液(mmol-1)：NaCl

137，KCl

5.4，CaCl2

1.8，MgCl2

0.5，HEPES

6.0，Glucose

5.0，PH=7.4

with

NaOH

（3）酶溶液：无钙台氏液+0.4mg/ml

collagenase+0.1mg/ml

protease

（4）贮存液(mmol-1)：KOH

70，L-glutamine

acid50，KCl

40，Taurine

20，KH2PO4

20，MgCl2

3，Glucose

10，HEPES

10，EGTA

0.5，PH=7.4

with

KOH

KB

solution

(in

mM):

KOH

85,

L-glutamic

acid

50,

KCl

30,

Taurine

20,

MgCl2

1.0,

KH2PO4

30,

HEPES

10,

EGTA

0.5,

Glucose

10

(pH

adjusted

to

7.4

with

KOH)分大鼠心肌细胞，液体充氧是用的是纯氧、还是95％O2和5％CO2的混合气？这取决于你的ＰＨ缓冲剂是什么．如果用ＮaＨＣＯ３做缓冲就需要通95％O2和5％CO2的混合气，如果只通纯氧，ＰＨ会上升，ＮaＨＣＯ３变为ＣＯ３根和溶液中的钙形成沉淀。如果用ＨＥＰＥＳ，则仅需要通纯氧，通95％O2和5％CO2的混合气，则CO2变为Ｈ２ＣＯ３，ＰＨ会下降。

心肌细胞急性分离是用什么酶，消化多少分钟比较好？一般使用胶原酶I或者消化时间也受很多因素影响，没毒浓度、温度、豚鼠状态、个人习惯都影响很大，需要即时观察，到豚鼠心肌消化变大变软变色、酶成浑浊，方可剪下。至于消化时间要根据老鼠大小，和灌流速度来定，没有固定的时间。在心脏膨大变软后，从心室内吸少量液体在显微镜下找单个心肌细胞，见单个细胞后再延长半分钟到一分钟。如何通过观察细胞状态调整酶浓度？如果细胞的量很多，而且碎片多，细胞横纹不清，表明酶解过头；如果细胞量不大，且圆球形的细胞较多，细胞悬液较清，表明酶解不够。如何判断心肌细胞的状态？实验室需要持续灌流吗？在显微镜下如果看到清晰横纹，那是好的细胞。如果横纹不清，那一定是状态不好的细胞。整个实验过程中要持续灌流，否则死亡的细胞释放出多种酶，及钙，死细胞的碎片也会影响封接，细胞也会缺乏养分，导致细胞状态不好。用消化酶灌流心脏后整个心脏迅速变白,不知道是什么原因？可能原因：1.冠脉中有微血栓形成，导致灌流不均匀而致。处死动物之前，先腹腔注射肝素1000u/kg.2.大鼠的状态也是非常重要的。分离平滑肌细胞需要注意什么？1去离子水配置溶液，分离液体最好是新配的，超过一周就不要再用了2.明确溶液PH值7.4，不要偏酸3.调整一下消化酶的剂量,消化酶需要根据气候温度等情况不同随时加减

4.消化的时间也是根据具体情况适当的缩短或延长.

5.动物的状态也会影响平滑肌细胞的活性质量的,假如动物挨饿,受冻,受热等使动物处于应急状态,细胞的质量也会下降.如何分离动脉平滑肌细胞？分离动脉平滑肌细胞用什么酶？怎么判断消化时间是否合适？1）albumin2.5mg/ml，DTT1.5mg/ml，papin1.5mg/ml，collagenase2.5mg/ml，hyaluronidase2.5mg/ml.分离的细胞镜下成梭形或香蕉状。2）酶量不是关键，酶量少一些可以适当延长一些时间3）第一步剪成的血管块酶解成接近浓胶状，迅速转移进行第二步酶解平滑肌细胞patch要注意什么？1由于平滑肌细胞比较小（一般只有20pF左右），封接时，首先应该用灌流液多冲洗几遍，以去除BSA的影响；2注意测试脉冲电流的变化，电极尖端压细胞时不能太狠，以免刺破细胞；3灌流液为高渗液体相对容易封接。4分离得到的平滑肌细胞膜都比较脆，给负压时要轻；5zap功能对血管平滑肌而言，太大了细胞容易掉，小了不起作用，具体的参数要多次摸索，结合负压吸引。急性分离的DRG要消化到什么程度才合适，进行全细胞膜片钳？镜下观察细胞圆或椭圆，胞质均匀，胞壁干净完整透亮有光圈感。封接难可能是消化不足，消化不均匀，细胞表面不干净等原因。消化时应在摇床上或消化过程中轻轻摇动离心管细胞系HeK293细胞转染多长时间合适？取决于转染的基因表达产物(蛋白质)的半衰期，一般表达时间为24小时-72小时。为什么我记录的细胞没有Ca电流呢？不同的细胞系表达的离子通道有很大不同，如果采用细胞系记录某种离子通道电流，一定要确定该细胞系是否表达所需离子通道。如果没有表达，则需要通过转染，使细胞系表达所需通道，然后再进行记录。我记录的细胞非常扁平，不好patch怎么办？有些培养细胞系形状扁平，不利于patch,这时最好稍微消化做成细胞悬浮液，将悬浮液滴在小玻片上，再过半个小时细胞稍微贴壁就容易patch了。如果细胞贴壁不利，还可以先将玻片上铺上多聚赖氨酸（polylysine）然后再使用。

离子通道问题离子通道的种类：电压门控离子通道；受体门控离子通道；机械敏感型离子通道；缝隙连接；细胞内膜离子通道；质子门控离子通道；水通道；什么是离子通道的激活，失活，去激活？

C<>O<>I

C:

关闭

O：开放

I：失活

激活(activation：从C到O的过程。

失活(inavtivation)：从O到I的过程。

去激活(deactivation)：I

回到C的过程。如何绘制离子通道的激活曲线？1根据离子通道的电流特点设定离子通道的脉冲电压，一般包括从通道激活时的电压到最大电流时的电压。2测量不同脉冲电压下的全细胞电流峰值。3计算全细胞电导，g=I/(Vm-Vrev).Vm为脉冲电压，Vrev为离子通道反转电位。4以g/gmax为纵坐标，以Vm为横坐标，作出激活曲线。5用Boltzmann方程g/gmax={1+exp[(V1/2-Vm)/K]}-1，对激活曲线进行拟合求得斜率因子K和V1/2。如何绘制离子通道的I-V曲线？1根据离子通道的电流特点设定离子通道的脉冲电压，一般包括从通道激活时的电压到最大电流时的电压，一般要跨越反转电位，比激活曲线的设定的脉冲电压还要宽。2以I(电流峰值)为纵坐标，V(脉冲电压)为横坐标绘制I-V曲线。Clampfit自带I-V曲线绘制功能。什么叫整流？内向整流、外向整流的区别有什么区别？

如果膜只是一个单纯的电阻的话，那么通过它的电流就应该和电压是线性的关系。但由于通道的存在，这种线性关系就会被改变。随电压的升高，离子通道电流低于线性关系电流值，称为内向整流，I-V曲线位于相对偏向下；外向整流指离子通道电流随电压的升高而更高超过电压依赖性的线性关系电流值，I-V曲线位于相对偏向上。

只要有离子通道，必然会有整流现象。如何绘制离子通道的失活曲线？钾离子通道神经元钾通道电流的电极内液和细胞外液配方同细胞因为所处环境以及通道分布的差异,记录钾电流时的内外液会有一些不同,但大体上是类似的,具体要参照相关文献。细胞外液：（mmol/l）NaCl144,KCl4.0,CaCl21.8,MgCl20.53,Na2HPO40.33,HEPES5,Glucose5.5,用NaOH调PH值为7.3。细胞外液加入TTX1umol/l阻滞钠通道，CdCl20.2mmol/l阻滞钙通道。电极内液：KCl130,Na2ATP5.0,creatinephosphate5.0,HEPES5.0,用KOH调PH至7.4。如何记录及确认KATP电流？先用开放及剂100uMpinacidil先使其开放，用特异性阻断剂10uMglibenclamide完全阻断，证实我所记录到的是KATP电流外液配方是(mM)140NaCl,5KCl,1MgCl2,1CaCl2,10Hepes电极内液配方是(mM)140KCl，5EGTA，5Hepes，10KOH，1MgCl2,1Na2ATP,0.1GTP记录KATP电流内液加不加Na2ATP的问题？

记录KATP电流内液是要加Na2ATP的，KATP通道在无ATP溶液中表现衰减现象，即先开放，随后逐渐丧失活性，ATP可恢复衰减的通道活性。钠离子通道钙离子通道外液中用Ba2+取代Ca2+对不同的钙电流会有什么不同的影响？1）为了避免Ca2+升高加速钙通道得衰减，细胞内的钙离子可以加速钙通道的失活，而钡离子却没有该作用，因此用钡离子做出来的通道电流失活较慢，就是通道关闭速率慢，表现在I-V曲线上就是电流达到峰值后上升的比较平坦。2）而且大多数的钙通道亚型对Ba2+的通透性要大于Ca2+，用Ba电流替代钙电流可将电信号适当放大，便于分析通道的特性。全细胞记录不到Ca2+电流,好像还是K+电流,都是正向电流1Ca的通道电流很小，所以封接质量要好；2Carundown明显，所以破膜后立即记录，可把protocal的刺激间隔时间设为最小，快速记录；电极内液和细胞外液都用了TEA-Cl，仍然没有记到Ca电流，是什么原因？1确定细胞状态，是否可以记录其他电流。2查看protocol，是否应用了正确的protocol。记录L型Ca电流，阻断Na电流应该加TTX吧?

不一定要加TTX，只要protocal在钳制在-40mv达200ms以使钠通道失活，再以+10mv诱导出L型钙电流，这样就肯定不会出现钠电流。记录钙离子通道电流的时候，怎样判断记录的就是钙电流，而不是其它通道电流？1）把外液换为无钙液（其他离子浓度不变）2)加氯化镉看能否完全阻断钙电流3）加维拉帕米看能否基本阻断电极液中已加过TTX和TEA-Cl，用不用再判断记录电流为钙电流？氯离子通道水通道

膜片钳配套设备问题刺激器与刺激电极隔离器微操那个牌子的微操比较好？Scientifica,Burleigh,LuigsandNeumann微操一动就有噪音怎么办？一般不影响记录，查看微操接地。为什么patch上细胞以后，电极一会儿就不在原来的位置了？1）查看防震台。2）微操问题，看看是不是有螺丝松了，或者连线太紧3）如果不能马上解决，而且必须做实验的话只能一直观察电极，发现有移动就移回原来的位置。4）如果是微操控制器的问题，可以关掉控制器。暂时使用手动调节微操。电极拉制仪我应该选垂直拉制仪还是水平拉制仪？水平拉制仪总体来说要好于垂直拉制仪，控制比较精确，拉出的电极参数比较稳定，而且两根形状区别较小。比较经典的水平拉制仪是美国sutterinstrument的P-97,现在更好的产品是P-2000.换了新的铂金片，如何重新设置拉制仪参数？Ramptest,测试基础的拉制温度。上下微调，找出两步拉制或者三步拉制的临界温度。继续微调（不要设置在临界温度），主要是设定拉力（对于P-97拉制仪，只需要设置Velocity，可不用设定Pull）与温度。一般第一步拉制电极颈部，温度要比第二步高（对于P-97拉制仪，温度的设定需要先测量Ramp值），拉力不要过大，以保证颈部较短；第二步拉制尖端，一般要使温度低些，拉力大些。一般都是通过显微镜查看电极尖端，这很简单，并不复杂！最好是抛光，这样就在抛光仪显微镜下查看。注意抛光后的电极尖端开口会变小，故在拉制电极时，尖端开口要大些。检查电极还有其它方法，如“气泡数法”，也可用放大器通过测量电阻来查看。4)我用的水平拉制仪，两根电极参数差很多怎么办？调整铂金片的位置，努力保证其再两根电极正中央。电极抛光仪我做脑片细胞，电极要不要抛光？对于脑片记录来说，最好给电极抛光。单细胞记录则根据自身情况决定。显微镜NikonOlympusZeissLeica灌流给药系统震动切片机leica

膜片钳相关设备\软件的具体操作怎样连接放大器和Digitizer？信号线是使用BNC线。将放大器的scaled

output连接Digitizer的

ANALOG

IN

任意接口，这是采集信号。将

放大器的

COMMAND

INPUT（任意,分别对应于面板上两个旋钮，根据需要连接）连接Digitizer的

ANALOG

OUT

1或2

。HEADSTAGE

接电极HEAD。MultiClamp700A中，在放大器和信号器的连接中，放大器的rawoutput是否需要连接信号器的ANALOGIN接口?scaledoutput，rawoutput有什么区别?Rawoutput为原始信号输出，放大器输出的信