酶的生产培训知识

EnzymeEngineering

酶工程第三章酶的生产制备

酶的生产方式1.提取法:植物、动物、微生物2.化学合成法生物合成法：利用植物、动物、微生物细胞合成。上个世纪50年代起利用微生物生产酶。1949年细菌发酵生产淀粉酶上个世纪70年代以来利用植物细胞和动物细胞培养技术生产酶。

木瓜细胞培养生产木瓜蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶人黑色素瘤细胞培养生产血纤维蛋白溶酶原激活剂动植物细胞培养的特殊性：

1、细胞比微生物细胞大得多，体积大几千倍，2、对剪切力敏感，动物细胞没有细胞壁更甚3、生长速率比微生物低，生长倍增时间和发酵周期均更长，4、对营养的要求较微生物复杂，动物细胞往往需要添加血清和其他营养成分3、酶的发酵生产经过预先设计，通过人工操作控制，利用细胞的生命活动，产生人们所需要的酶的过程，称为酶的发酵生产。

第一节酶的生产菌种一、生产菌种1.细菌芽孢杆菌（蜡状、枯草、地衣）、大肠杆菌2.霉菌黑曲霉、米曲霉、木酶3.酵母菌啤酒酵母、假丝酵母4.放线菌链霉菌二、产酶菌种的要求（1）不是致病菌及产生有毒物质或其他生理活生物质的微生物，确保酶生产和应用的安全。（2）能在便宜的底物上生长良好，繁殖快，产酶量高，有利于缩短生周期（3）产酶性能稳定，菌株不易退化，不易受噬菌体侵袭。（4）目标酶的产量要高，性能符合应用需要，产生的酶容易分离纯化，最好为胞外酶。（5）除蛋白酶生产菌种外，其他产酶菌种的产蛋白酶活力应该很低，防止目标酶的水解。三.产酶微微生物的分分离和筛选选1)样品的的采集:从从富含该酶作用底底物的场所采集集样品2)富集培培养:投投其所好，，取其所抗抗3)分离获获得微生物物的纯培养养（pureculture）。4)初筛：：选出产酶酶菌种，以以多为主。。5)复筛：：选出产酶酶水平相对对较高的菌菌株，以质质为主。-淀粉酶的的筛选蛋白酶产生生菌的获得得方法应用含酪蛋蛋白的培养养基第二节酶酶的发酵酵技术一、培养基基C/N:产酶促进剂剂:诱导物表面活性剂剂二、发酵条条件对产酶酶的影响温度、pH值、通风风量三、发酵方方法1、固体培培养发酵：：培养基以麸麸皮、米糠糠等为主要要原料加入入其它营养养成分，经经灭菌、接接产酶菌株株，在一定定条件下发发酵，目的的获得淀粉粉酶和蛋白白酶，如酒酒曲生产。。2、液体深深层发酵液体培养基基，在发酵酵容器中，，经灭菌、、冷却接入入产酶细胞胞，在一定定条件下发发酵，是目目前酶生产产的主要方方法。3、固定化化细胞发酵酵第三节提提高酶产产量的方法法一、、酶酶合合成成的的调调节节机机制制1.操操纵纵子子调节节基基因因：：阻遏遏蛋蛋白白辅阻阻遏遏物物2、、诱诱导导和和阻阻遏遏诱导导：：诱导导物物的的加加入入后后，，酶酶才才大大量量合合成成，，参与与分分解解代代谢谢的的酶酶：：淀淀粉粉酶酶、、纤纤维维素素酶酶阻遏遏：：末端端代代谢谢物物阻阻遏遏：：反馈馈阻阻遏遏，，合合成成代代谢谢中中的的关关键键酶酶分解解代代谢谢物物阻阻遏遏：：1.酶酶合合成成的的诱诱导导加进进某某种种物物质质，，使使酶酶生生物物合合成成开开始始或或加加速速进进行行。。酶合合成成诱诱导导的的现现象象：：已知知分分解解利利用用乳乳糖糖的的酶酶有有：：-半乳乳糖糖苷苷酶酶；；-半乳乳糖糖苷苷透透过过酶酶；；硫硫代代半半乳乳糖糖苷苷转转乙乙酰酰酶酶。实验验：：（1））大大肠肠杆杆菌菌生生长长在在葡葡萄萄糖糖培培养养基基上上时时，，细细胞胞内内无无上上述述三三种种酶酶合合成成；；（2））大大肠肠杆杆菌菌生生长长在在乳乳糖糖培培养养基基上上时时，，细细胞胞内内有有上上述述三三种种酶酶合合成成；；（3））表表明明菌菌体体生生物物合合成成的的经经济济原原则则：：需要要时时才才合合成成。调节节基基因因操纵纵基基因因乳糖糖结结构构基基因因PLacZLacYLacamRNA阻遏遏蛋蛋白白（（有有活活性性））基因关闭启动动子子ORPLacZLacYLaca调节基因操纵基因乳糖结构基因启动子ORmRNAZmRNAYmRNAa阻遏蛋白（无活性）基因表达mRNAA、、乳乳糖糖操操纵纵子子的的结结构构B、、乳乳糖糖酶酶的的诱诱导导乳糖阻遏遏蛋蛋白白（（有有活活性性））诱导导2.末末端端产产物物阻阻遏遏由某某代代谢谢途途径径末末端端产产物物的的过过量量累累积积引引起起的的阻阻遏遏。酶合合成成阻阻遏遏的的现现象象：：实验：（1）大肠杆菌菌生长在无机机盐和葡萄糖糖的培养基上上时，检测测到细胞内有有色氨酸合成成酶的存在；；

（2））在上述培养养基中加入色色氨酸，检测测发现细胞内内色氨酸合成成酶的活性降降低，直至消消失。（（3）表明色色氨酸的存在在阻止了色氨氨酸合成酶的的合成，体现现了菌体生长长的经济原则则:不需要就不合合成。色氨酸操纵子子——酶的阻阻遏调节基因操纵基因结构基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能能与操纵基因因结合，结构构基因表达调节基因操纵基因结构基因辅阻遏物代谢产物与阻阻遏蛋白结合合，使之构象象发生变化,与操纵基因因结合，结构构基因不能表表达酶的诱导和阻阻遏操纵子模模型B.有活性阻阻遏蛋白加诱诱导剂A.有活性阻阻遏蛋白C.无活性阻阻遏蛋白D.无活性阻阻遏蛋白加辅辅阻遏剂操纵基因启动基因调节基因结构基因阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因不表达诱导物诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操纵基因结合,结构基因可以表达阻遏蛋白(无活性)酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达代谢产物3.分解代谢谢物阻遏指细胞内同时时有两种分解解底物（碳源源或氮源）存存在时，利用用快的那种分分解底物会阻阻遏利用慢的的底物的有关关酶合成的现现象。分解代谢物的的阻遏作用，，并非由于快快速利用的甲甲碳源本身直直接作用的结结果，而是通通过甲碳源（（或氮源等））在其分解过过程中所产生生的中间代谢谢物所引起的的阻遏作用。。分解代谢物阻阻遏现象：实验：细菌在含有葡葡萄糖和乳糖糖的培养基上上生长，优先先利用葡萄糖糖。待葡萄糖糖耗尽后才开开始利用乳糖糖，产生了两两个对数生长长期中间隔开开一个生长延延滞期的“二二次生长现象象”(diauxie或或biphasicgrowth）。这一现象又称称葡萄糖效应应，产生的原原因是由于葡葡萄糖降解物物阻遏了分解解乳糖酶系的的合成。此调节基因的的产物是环腺腺苷酸受体蛋蛋白（CRP）,亦称降解物基因活活化蛋白（CAP）。分解代谢物阻阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表达CAP基因结构基因TCAPOCAP结合部部位RNA聚合酶酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代谢产物腺苷酸环化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物与cAMP的关系cAMPCAP：降解解物基因活化化蛋白（catabolicgeneactivationprotein）降低cAMP浓度使CAP呈失活状态三、提高酶产产量的策略（一）菌种选选育（一劳永永逸）1.诱变育种种(1)使诱导型变为为组成型———选育组成型型突变株(2)使阻遏遏型变为去阻阻遏型选育营养缺陷陷型突变株解除反馈阻遏遏选育结构类似似物抗性突变变株解除分解代谢谢物阻遏———选育抗分解解代谢阻遏突突变株2.基因工程育种种二、提高酶产量量的策略（一）菌种选选育（一劳永永逸）1.诱变育种种(1)使诱导型变为为组成型———选育组成型型突变株(2)使阻遏遏型变为去阻阻遏型选育营养缺陷陷型突变株解除反馈阻遏遏选育结构类似似物抗性突变变株解除分解代谢谢物阻遏———选育抗分解解代谢阻遏突突变株2.基因工程育种种（二）.通过条件控控制提高酶产产量（1）添加诱诱导物选择适宜的诱诱导物及浓度度:诱导物：酶酶的作用底物物酶作用底物的的前体酶的反应产物物酶的底物类似似物或底物修修饰物等IPTG/乳乳糖纤纤维素素/纤维二糖糖诱导纤维素素酶（2）降低阻阻遏物浓度避免使用过于于丰富的培养养基和易被利利用的碳源，，并设法阻止止效应物的形形成和浓度的的增加。流加和连续培培养（3）.其他促进分泌：添添加表面活性性剂离子型对对细胞有有毒害作用表面活性剂Tween－－80非离子型TritonX－100非离子型增加加细胞通性，添加产酶促进进剂植酸钙镁，聚聚乙烯醇等第四节酶酶发酵动动力学细胞生长速度度产物生成速度度基质消耗速度度环境因素的影影响细胞生长动力力学发酵产酶动力力学发酵动力学研研究内容：一、酶生物合合成的模式微生物细胞的的生长历程按细胞生长和和酶产生的关关系，酶生物物合成具有下下列四种模式式：1、同步合成成型2、延续合成成型3、中期合成成型4、滞后合成成型1.生长偶偶联型（又称称同步合成型型）酶的生物合成成与细胞生长长同步。特点：酶的合成可以以诱导，但不不受分解代谢谢物阻遏和反反应产物阻遏遏。当去除诱导物物、细胞进入入平衡期后，，酶的合成立立即停止，表表明这类酶所所对应的mRNA很不稳稳定。2.生长偶联型中中的特殊形式式——中期合合成型酶的合成在细细胞生长一段段时间后才开开始，而在细细胞生长进入入平衡期以后后，酶的合成成也随着停止止。特点：酶的合成受产产物的反馈阻阻遏或分解代代谢物阻遏。。所对应的mRNA是不稳稳定的。枯草杆菌碱性性磷酸酶合成成曲线3.部分生长偶偶联型（又称称延续合成型型）酶的合成在细细胞的生长阶阶段开始，在在细胞生长进进入平衡期后后，酶还可以以延续合成较较长一段时间间。特点：可受诱导，一一般不受分解解代谢物和产产物阻遏。所对应的mRNA相当稳稳定。黑曲霉聚半乳乳糖醛酸酶合合成曲线4.非生长偶偶联型（又称称滞后合成型型）只有当细胞生生长进入平衡衡期以后，酶酶才开始合成成并大量积累累。许多水解解酶的生物合合成都属于这这一类型。特点：受分解代谢谢物的阻遏作作用。所对应的mRNA稳定性性高。黑曲霉酸性蛋蛋白酶合成曲曲线总结：影响酶生物合合成模式的主主要因素1）mRNA的稳定性2）培养基中中阻遏物的存存在mRNA的稳稳定性，培养养基中诱导物物，反馈阻遏遏物，分解代代谢物的存在在是影响酶生生物合成模型型的主要因素素。mRNA稳定定性代代谢调调节产产物生成成模型同步合成型(-)诱诱导dP/dt=α·dX/dt延续合成型(+)诱诱导dP/dt=α·dX/dt＋ββ·X中期合成型(-)反反馈阻阻遏dP/dt=α·dX/dt（解除阻遏后后）滞后合成型(+)分分解代谢谢物阻遏dP/dt=β·X酶生产中最理理想的合成模模式：延续合成型（（部分偶联））：发酵过程中没没有生长期和和产酶期的明明显差别。细细胞开始生长长就有酶的产产生，直至细细胞生长进入入平衡期后，，酶还可以继继续生成一段段时间。对于：同步合成型：：提高对应的mRNA的稳稳定性，如降降低发酵温度。滞后合成型：：尽量减少甚至至解除分解代代谢物阻遏，，使酶的合成提早早开始。中期合成型：：要在提高mRNA稳定性性以及解除阻阻遏两方面努力。目的：提高产产酶率和缩短短发酵周期最理想的合成成模式：延续续合成型策略措施：①菌种选育：：提高mRNA的稳定性性，解除分解解代谢物阻遏遏和反馈阻遏遏。②发酵代谢调调节：理想诱诱导物的添加加，解除反馈馈阻遏和分解解代谢物阻遏遏（难利用的的碳氮源的使使用，补料发发酵）。③降低产酶温温度。二、细胞生长长动力学微生物细胞生生长的动力学学方程：Monod方方程：S－限制性基基质浓度；μm—最大比生长长速率；Ks—Monod常数倒数形式：三、产酶动力力学产酶动力学方方程：X——细胞浓浓度，以每升升发酵液所含含的干细胞重重量表示（gDC/L））固定化微生物物细胞发酵产产酶一、固定化细细胞发酵产酶酶的特点1、提高产酶酶率2、可以反复复使用或连续续使用较长时时间3、基因工程程菌的质粒稳稳定，不易丢丢失4、发酵稳定定性好5、缩短发酵酵周期，提高高设备利用率率6、产品容易易分离纯化7、适用于胞胞外酶等胞外外产物的生产产第三章酶酶的生产和制制备第五节酶酶的分离纯化化（酶的制备备）酶的提取和分分离纯化：将酶从细胞或或培养基中抽抽提出来，获获得与使用目目的相适应的的有一定纯度度和浓度的酶酶产品的过程程。两个基本环节节：分离和纯纯化分离：将酶从从原料中抽提提出来，并尽尽可能少引入入杂质，得到到粗酶液纯化：将酶和和杂质中分离离开来，或者者有选择地将将酶从包含杂杂质中分离出出来，得到一一定纯度的酶酶。酶的纯化过程程与一般蛋白白质纯化过程程相比的特点点：1、特定的一一种酶在细胞胞中的含量较较少，2、酶可以通通过测定活力力的方法加以以跟踪。前者给纯化带带来了困难，，而后者却迅迅速找出纯化化过程的关键键所在。理想的提取和和分离纯化方方法：在提高酶的的比活的同时时，要求酶回回收率高，提提取步骤少、、工艺简单，，成本低一、原原则1.防防止酶酶失活活这一原原则要要贯穿穿纯化化工作作的始始终，，在后后期尤尤为重重要。。建建立一一个可可靠和和快速速、易易行的的测定定酶活活方法法物理因因素、、化学学因素素和生生物因因素导导致酶酶失活活2.分分离纯纯化的的环节节的选选择（（经济济、宜宜行））：纯化倍倍数、、酶活活回收收率和和重现现性（（衡量量优劣劣）经济、、可靠靠，建建立灵灵敏、、快速速、特特异、、精确确的检检测（（酶活活和蛋蛋白质质的含含量））手段段。3、分分离步步骤、、方法法和成成本间间的关关系提取、、分离离、纯纯化、、制剂剂策略：：①酶产产品的的质量量要求求设定目目标：：（用用途：：医用用、食食品级级、工工业级级或研研究级级）目标酶酶蛋白白与主主要杂杂质的的性质质②提取取过程程的设设计应应尽可可能防防止酶酶的损损失，，减少少处理理步骤骤。③提取取方法法的经经济性性和可可分析析性尽量减减少添添加剂剂的使使用尽早使使用高高效分分离方方法，，将昂昂贵、、费时时的分分离方方法放放在最最后阶阶段。。酶活力力、蛋蛋白浓浓度、、纯度度测定定方法法可行行性④剂型型（液液体浓浓缩酶酶、粉粉状酶酶、精精制酶酶、结结晶酶酶等））二、酶活力力（一））酶酶活力力酶活力力activity：酶催化化一定定化学学反应应的能能力。。用酶酶催化化的反反应速速度来来表示示酶活活力，，即用用单位位时间间内，，单位位体积积中底底物的的减少少量或或产物物增加加量来来表示示。转换频频率：：单位时时间转转化的的底物物分子子数。。Kcat,单位位1/s（二））酶活活力单单位及及比活活力酶活力力单位位U（activeunit）：是是根据据某种种酶在在最适适条件件下，，单位位时间间内被被酶作作用的的底物物的减减少量量或产产物的的生成成量来来规定定的，，表示示酶活活力高高低。。IU：：umol/minKat：mol/s1Kat=6×107IU酶的比比活力力指每mg酶蛋白白（或或每mg蛋白氨氨）所所含的的酶活活力单单位数数即：：比活活力=活力单单位数数/酶蛋白白（氮氮）mg表示酶酶制剂剂的纯纯度，，比活活力愈愈高，，酶愈愈纯。。一、基基本过过程（一））、材料（（选择择）预预处理理及破破碎细细胞1.胞胞内酶酶和胞胞外酶酶2.破破碎细细胞（二））、固液分分离（（离心或或过滤滤）酶的溶溶解性性、稳稳定性性第六节节酶酶分离离纯化化的基基本过过程（三））、净化与与脱色色絮凝剂剂脱脱色色处理理（四））、浓缩（热量量法、、沉淀淀分离离、膜膜分离离）（五））纯化、、结晶晶（干燥燥）二、酶酶分离离纯化化方法法三、酶酶分离离纯化化中的的一些些数据据（p93）1.总总蛋白白2.总总活力力3.比比活力力4.酶酶浓度度5.纯纯化倍倍数（（提纯纯倍数数）6.产产率（（回收收率））第六节节酶酶制制剂一、定定义及及分类类1定义义：从从生物物中提提取的的具有有生物物催化化能力力的酶酶，辅辅以其其他成成分，，用于于加速速加工工过程程和提提高产产品质质量的的产品品。2.分分类（1））形态态上分分:固固体体液液体体（2））用途途：工工业酶酶制剂剂、饲饲料酶酶制剂剂、食食品酶酶制剂剂、医医药酶酶制剂剂和洗洗涤酶酶制剂剂（3））组成成：单单一酶酶制剂剂和复复合酶酶制剂剂（4））含量量：普普通酶酶制剂剂和浓浓缩酶酶制剂剂（5））来源源：（6））生产产加工工方法法：游游离酶酶制剂剂、固固定化化酶制制剂、、酶试试纸、、