微生物絮凝剂

微生物絮凝剂研究摘要：从土壤中分离得到一株能产高效絮凝剂的菌株，经鉴定为硅酸盐芽孢杆菌，该菌产生的絮凝剂命名为MBFA9，本研究首次发现芽孢杆菌能够产生絮凝剂。该菌产生的絮凝剂MBFA9具有用量少，絮凝效果好等特点。

关键字：絮凝微生物絮凝剂絮凝剂MBFA9黄浆废水摘要从土壤中分离得到一株能产高效絮凝剂的菌株，经鉴定为硅酸盐芽孢杆菌，该菌产生的絮凝剂命名为MBFA9，本研究首次发现芽孢杆菌能够产生絮凝剂。该菌产生的絮凝剂MBFA9具有用量少，絮凝效果好等特点。该絮凝剂絮凝5000mg/L的高岭土悬浮液时，不需添加CaCl2、Al2(SO4)3等助凝剂，絮凝率高达99.6%，絮凝剂（培养液）用量仅为0.1ml/L，约为一般生物絮凝剂用量的1/10–1/200。通过提纯分析得知絮凝剂MBFA9为多糖，由糖醛酸、中性糖和氨基糖组成，其中糖醛酸的含量高达19.1%。粘度法测得絮凝剂MBFA9的平均分子量为2.594×106。动物急毒试验表明该絮凝剂无急毒反应，可以安全使用。絮凝剂MBFA9絮凝河水的用量为0.05ml/L，河水浊度由106.1mg/L降为0.8mg/L，而药剂成本仅为0.04元/吨。絮凝剂MBFA9处理淀粉厂的黄浆废水效果良好，SS和COD的去除率分别达到85.5%和68.5%，优于常用的化学絮凝剂。因此，絮凝剂MBFA9在食品废水中回收有价物质和给水中具有很好的应用潜力。微生物絮凝剂因为具有可生物降解、无二次污染等独特性质，近些年来受到人们的广泛关注。目前已发现多种微生物能够产生絮凝剂，如酱油曲霉[1]、红平红球菌[2]、拟青霉[3]产碱菌属[4]等，但普遍存在絮凝剂用量大、成本高、对实际废水絮凝性差等问题。因此，寻找高效微生物絮凝剂产生菌，提高絮凝活性，降低絮凝剂用量，是微生物絮凝剂能能否在工业上推广的关键所在。本文研究筛选得到的一株高效絮凝剂产生菌，经培养、絮凝实验表明，该菌产生的絮凝剂的絮凝率高、用量低，展示了良好的应用前景。1.材料和方法1.1菌种来源从树丛中的肥沃土壤中分离得到。1.2菌种鉴定按《一般细菌常用鉴定方法》和《Bergey’sMannualofSystematicBacteriology》进行鉴定。1.3培养基(%)及培养条件可溶淀粉1.5，K2HPO40.6，酵母膏0.3，MgSO4·7H2O0.02，NaCl0.01，pH=8.0，在30℃、140r/min的摇床中培养72h。1.4絮凝剂的提纯培养液稀释10倍6000r/min离心10min去除菌体，然后浓缩、乙醇沉淀、氯仿正丁醇去除游离蛋白，透析后真空冷冻干燥得到絮凝剂MBFA9精品。1.5絮凝剂的成分分析通过糖的Molish反应、蒽酮反应以及紫外光谱，定性判断絮凝剂MBFA9样品中是否含有糖类成分[5]。多糖经水解，可以测出中性糖、酸性糖和氨基糖的含量[5、6]。中性糖的测定采用酚硫法，己糖醛酸的测定采用咔唑－硫酸法；氨基糖的测定方法见“糖复合物生化技术研究”[6]。红外光谱测定絮凝剂中所含基团。1.6絮凝剂分子量测定(粘度法)试验所用毛细管的直径为0.5mm，水浴温度为30℃，以1％NaOH10ml溶解0.01g絮凝剂MBFA9精品，即初始浓度C0为0.001g/ml，分别测得絮凝剂溶液和纯溶液流出时间，则可求出絮凝剂的分子量[7]。1.7絮凝剂的毒性试验（急性毒性试验测LD50）试验按“国家食品卫生法则”要求进行急性毒性试验[8]。取60只小白鼠（由中国医科大学动物部提供），体重为20±2g，雌雄随机分为两组，一组为试验组，另一组为对照组。将絮凝剂MBFA9溶于水中，以1g/kg的剂量均匀配给各鼠，24小时内喝完，饲养15天，观察小白鼠的体态、饮食、运动有无异常反应。1.8实际废水的性质废水一：淀粉厂黄浆废水废水取自沈阳市南塔淀粉厂的沉淀池溢流废水。黄浆水经沉淀池沉淀，大部分黄浆沉淀下来，溢流水排放。废水中仍含有一些细小的悬浮物，主要成分是淀粉和蛋白质。废水指标见表1。Table1IndexofyellowslurrywastewaterpHSS(mg/L))COD(mg/LL)OD660remak4.30214562223.38milkwhiite，turbiidity废水二：沈阳南湖湖水浊度为106.1ppm，pH=7.06，COD=79.03mg/L，悬浮物主要为微小的泥土颗粒及少量有机物。2结果和讨论2.1菌种鉴定从土壤中分离筛选得到A-9菌株，该菌株的培养液对高岭土悬浮液的絮凝率高达99.6%。该菌的菌体形状为两端圆形的长杆菌，周生鞭毛，菌体大小为4.16-4.83×0.5-0.83mm（见图1）；该菌好氧，革兰氏染色为阳性，适宜培养温度为25-30℃，用复红或结晶紫染色时可以见到很大的荚膜，荚膜内含有1-3个菌体。该菌能水解淀粉，不水解酪素，在含淀粉的PDA平板培养基上能形成大量的椭圆形芽孢（见图2）。经鉴定该菌为硅酸盐芽孢杆菌新变种（Bacillusmucilgnonsn.var），由该菌产生的絮凝剂命名为MBFA9。图1A-9菌株形态的电镜照片(6000倍)图2A-9菌株产生的芽孢(1500倍)Fig.1electronmicroscopephotoofstrainA-9’sshape.(6000times)Fig..2GemmaproducebystrainA-9(1500times)2.2絮凝剂MBFA9的絮凝特性絮凝剂MBFA9突出的特点是絮凝效果好、絮凝剂用量少[9]。当絮凝5000mg/L的高岭土悬浮液时，絮凝剂（培养液）的用量仅为0.05ml/L，为一般微生物絮凝剂用量的1/10–1/100，而絮凝率高达99.6%，且不需添加Ca2+及Al3+等助凝剂。尽管絮凝剂MBFA9絮凝高岭土悬浮液时不需添加CaCl2，但絮凝其它对象时，CaCl2的作用非常重要，结果见表2。Table2TheinfluenceofCa2+toMBFA9’sflocculatingactivitydealingwithdifferentobjects从表2可见，添加CaCl2对墨汁配水的影响较小，而对印染废水、黄浆废水和泥水的影响较大，絮凝率明显提高。泥水、黄浆废水和印染废水中即有微小的悬浮物又有稳定的胶体，不加CaCl2时，MBFA9只能絮凝其中的悬浮物，因而絮凝率低；加入CaCl2后，Ca2+能使水中的胶体脱稳，生成小絮团，加入的MBFA9为高分子絮凝剂，能起吸附架桥的作用，使微小颗粒絮凝成大絮团。墨汁配水为典型的胶体溶液，不加CaCl2时絮凝率为0%，加入CaCl2絮凝率为31.2%。可见，絮凝剂MBFA9对水中的悬浮物有较好的絮凝效果，对于较稳定的胶体，需要有CaCl2的协同作用才会有较好的絮凝效果。2.3絮凝剂MBFA9的分析为了深入研究絮凝剂MBFA9的絮凝机理，对提纯后得到的絮凝剂精品进行糖、蛋白质的呈色反应。结果表明絮凝剂MBFA9有明显的糖类颜色反应：Molish反应在浓硫酸和样品液分界面上有清晰的紫环生成，蒽酮反应呈现为蓝绿色，而没有蛋白质/氨基酸的特征反应。因而，可以定性地判断出该絮凝剂的有效成分为多糖。多糖是由多种单糖构成的，而单糖又分为中性、酸性和碱性糖。不同多糖组成的絮凝剂分子的结构和性能会有很大差异，测定絮凝剂的多糖组成，可以解释絮凝剂的性能，为研究MBFA9的絮凝机理奠定基础。为此对其进行浓硫酸水解，分别测定絮凝剂中己糖醛酸、氨基糖和中性糖的含量。另外，采用乌氏粘度计对MBFA9的分子量进行测定。结果见表3。用IR-470红外光谱分析仪，对絮凝剂MBFA9精品进行分析，光谱图见图3。Table3SpecialitiesofflocculantMBFA9nameconstituutesoofpollysacccharidde\%moleculaarweiightneutralsugarruronicaacidaminosuugarcontent47.419.12.742.594×1006Fig.3IRspectrumofflocculantMBFA9图3为一个典型的多糖红外光谱图，具有多糖的特征吸收峰3420、2926、1615、1025、810cm-1，这些特征峰进一步证实絮凝剂MBFA9是多糖。光谱图在1733、1615和1415cm-1处有特征吸收峰。1733cm-1为—COOH中的C=O伸缩振动所致；而1615cm-1处的宽吸收峰为—COO—中的C=O非对称伸缩振动的结果；1415cm-1为—COO—中的C—O伸缩振动所致。因此可以断定絮凝剂MBFA9中含有羧基，为阴离子絮凝剂。2.4絮凝剂MBFA9的急毒试验(急毒LD50)微生物絮凝剂是微生物分泌的代谢产物，作为水处理药剂，要求无毒无害。因此，对絮凝剂MBFA9进行急毒试验，结果表明，小白鼠一次性吞食1g/kg的絮凝剂MBFA9后，无一死亡，体态、饮食、运动均无异常反应，LD50>1g/kg，初步证明絮凝剂MBFA9无急毒反应。2.5絮凝剂MBFA9处理实际废水絮凝剂MBFA9是一种絮凝性能优异的无毒絮凝剂，在对人类或动物直接相关的食品、给水等领域具有广阔的应用前景。本研究以淀粉厂的黄浆废水和河水作为絮凝对象，研究絮凝剂MBFA9的实际应用效果。黄浆废水的处理结果在废水中加入0.5g/L的CaCl2，再加0.2ml/LMBFA9，后调pH至10.0，絮凝效果最佳，试验结果见表4。试验中发现加入CaCl2后，生成小絮团，沉降缓慢，加入絮凝剂MBFA9后絮团大且结实，沉降速度快。可见絮凝剂MBFA9絮凝黄浆废水时，CaCl2有助凝作用。经絮凝处理，SS和COD的去除率分别达到85.5%和68.5%。Table4Indexesofyellowslurrywastewaterbefore/afterdisposalindexespHOD660SS(mg/L))COD(mg/LL)indexesoforriginaalwatter4.33.3821456222indexesofdiisposeedwatter10.000.463101962removerrate\\%/86.485.568.5分别用聚合氯化铝、阴离子聚丙烯酰胺（320万）和非离子聚丙烯酰胺（580万）絮凝处理黄浆废水，结果见表5。从表中可以看出聚合氯化铝和非离子聚丙烯酰胺几乎没有絮凝效果；阴离子聚丙烯酰胺效果较明显，悬浮物絮团大，沉降快，最终SS和COD分别为520mg/L和2330mg/L，比絮凝剂MBFA9的处理效果略差。可见絮凝剂MBFA9的絮凝效果明显优于常用的化学絮凝剂。处理1吨废水可以回收2kg沉淀物。沉淀物中含有高蛋白物质，可以作为动物饲料的添加剂加以利用。Table5Comparingthedisposaleffectsofyellowslurrywastewaterwithdifferentflocculantsindexesdosage\\mg/LLpHOD660SS(mg/L))CODphenomennaPAC100.07.03.2220906196Flocssmmall,settiingsllow.non-ionPAM10.09.03.2021006270Flocssmmall,settiingsllow.anionPAAM10.09.00.965202330Flocsbiig,seettinggfastt.flocculaantMBBFA90.2ml/LL9.00.884702154Flocsbiig，tighhtnesss絮凝剂MBFA9处理河水用Al2(SO4)3作凝聚剂，分别以絮凝剂MBFA9、阴离子PAM、海藻酸钠、明胶作絮凝剂，絮凝处理湖水，结果见表6。从试验结果可以看出，用絮凝剂MBFA9作助凝剂，不仅絮团大，沉降快，上清液清澈，而且处理后COD最小；阴离子PAM、海藻酸钠、明胶处理后的浊度依次增大，COD也随之增加。絮凝剂MBFA9（培养液）的产品价格约为800元/吨，处理湖水的成本约为0.04元/吨。可见，MBFA9完全可以作为高分子絮凝剂应用于给水处理中。Table6ThedisposalresultsoflakewaterwithMBFA9andcommonflocculantsflocculaantMBFA9anionPAAMsodiumaalgaglutinDosage\\mg/L50(cultuuremeedium))21020turbiditty\mgg/L0.82.8016.936.5COD49.0652.5670.1489.72phe