质粒DNA提取及纯化

质粒DNA提取纯化、DNA电泳检测一、 实验目的•掌握质粒DNA的制备的原理和方法.了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离二、 实验原理•质粒DNA的制备方法质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。细菌质粒大小介于1~200Kb之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。质粒DNA的制备包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。主要方法包括：碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS;煮沸裂解法：沸水煮沸40秒；SDS裂解法：10%SDS,—般用于质粒大量提取。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验选择碱裂解法提取质粒DNA。.碱裂解法质粒DNA具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性，去除变性条件又可以使DNA复性。碱裂解法根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来。细菌环状基因组DNA在操作过程中会断裂成线状DNA分子，在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾缓冲液时，pH恢复至中性，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，就可去除染色体DNA和蛋白质-SDS复合物等物质，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA，乙醇或异丙醇沉淀就可得到纯的质粒DNA,之后可再用超离心、电泳、离子交换柱层析等方法进一步纯化质粒。.质粒琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳技术(agarosegelelectrophoresis)是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。琼脂糖凝胶可分辩0.1~6.0kb的双链DNA片段。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子的高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA,也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，如pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)；开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂(opencircularDNA,OCDNA)和线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂(linearDNA,LDNA)。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。三、仪器及试剂仪器及耗材：冷冻离心机、微量移液器、1.5mlEP管、枪头、凝胶槽、电泳仪等。试剂及配制：溶液1(GET缓冲液)：25mmol/LTris-HC(pH8.0),10mmol/LEDTA,50mmol/L葡萄糖，pH8.0溶液II(变性液)：200mmol/LNaOH,1%SDS配制：1ml 10%SDS50|jl、1NNaOH200pl取以上溶液，用灭菌去离子水定容至1ml,充分混匀，现用现配。溶液III(醋酸钾液):3mol/L醋酸钾(KAc)缓冲液，pH5.6。5mol/L冰醋酸配制：100ml 醋酸钾29.4g、冰醋酸11.5ml加入60ml去离子水后搅拌溶解。待醋酸钾溶解后，再加去离子水将溶液定容至100ml。高温高压灭菌后，4°C保存。其它试剂：TE(pH8.0)、饱和酚、酚/氯仿(25:24)、无水乙醇、70%乙醇、电泳缓冲液、6x上样缓冲液四、实验步骤接种细菌于LB液体培养基中，37C培养过夜（Ecoli.o]T10,pUC19质粒）；取细菌悬液1mL于1.5mLEP管中，4000rpm/min,离心2min;.弃上清，加入100页溶液I;加入200页溶液II,颠倒混匀，静置2min;加入150页溶液II，I颠倒混匀，静置5min;4C， 12000rpm/min，离心10min;取400Ml上清移入另一EP管，加等体积饱和酚，振荡混匀，12000rpm/min，离心10min;取约300Ml上层水相移入另一EP管，加等体积酚/氯仿，振荡混匀，12000rpm/min，离心10min;取200页上层水相移入另一EP管，加2倍体积无水乙醇，混匀置-201.5C小时，沉淀DNA;.12000rpm/min，离心10min，弃上清，加入1mL70%乙醇洗涤DNA沉淀，小心吸弃乙醇；.开盖放置5min干燥DNA，加入15页TE溶解DNA;.加入3页X上样缓冲液，混匀，18页分两次上样于1%琼脂糖凝胶电泳;.上样9〃lDNAmarker。.150V,60min,紫外灯下观察结果。五、结果与讨论.质粒电泳结果质粒DNA在含有漠化乙锭的琼脂糖凝胶电泳中，被染成橘黄色。如下图所示，质粒DNA可以观察到3条带，电泳速度最慢的条带显色最浅。质粒DNA有3种构型，即共价闭合环状质粒(cccDNA)、开环质粒(OCDNA)和线状质粒DNA(LDNA)。在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。本次实验的结果中的三条带，也可推测为：超螺旋质粒DNA、线状DNA和开环质粒.细菌基因组DNA与质粒DNA分离注意事项在加入细菌裂解液后，需要颠倒混匀，细菌环状基因组DNA在操作过程中会断裂成线状DNA分子。这时应当上下颠倒轻轻混匀，以避免产生小分子量的基因组DNA片断，最后污染提取的质粒DNA。.漠酚蓝指示剂上样缓冲液中含有漠酚蓝（Bromophenolblue,别名四漠苯酚磺