中国农业大学本科生“URP”立项申请书

中国农业大学本科生〃URP〃立项申请书项目名称M0RC1参与植物逆境胁迫的分子机制探究申请人徐光远工作单位植物保护学院联系电话电子信箱填表日期中国农业大学教务处制项目名称M0RC1参与植物逆境胁迫的分子机制探究项目起止时间2019.12-2020.12项目申请人情况姓名徐光远性别男出生日期1987.02.11最后学历与学位研究生/博士专业技术职务副教授从事专业植物病理一.项目概况植物在病原体攻击时会迅速激活防御信号传导途径并进一步激发免疫反应。位于植物细胞表面的PRRs(模式识别受体)识别PAMPs(病原菌相关分子模式)的存在，触发植物的PTI反应(DempseyandKiessig,2017)oPTI虽然能部分阻止病原体的入侵，但是病原菌进化出抑制PTI的效应蛋白，植物相对进化出识别这些效应蛋白的R蛋白，R蛋白识别相应的效应因子之后，触发ETI。而ETI和PTI被触发之后，植物发生防御基因表达、SA积累以及更广谱、持久的抗性，称为SAR(系统性免疫)(MysoreandRyu,2004)o拟南芥MORC家族中一共有7个同源蛋白，AiMORCl基因最初发现参与了植物的ETI,4MORC7Z4/MORC2突变体显示出对效应蛋白引发的ETI降低(KangetaL,2008),进一步的研究表明AtMORCl/AtMORC2在其他的植物免疫层面上都发挥着重要作用，AtMORCl/AtMORC2突变体中的PTI受到了部分损伤，其感染疫霉之后发现AtMORCl和4MoRC2参与非宿主抗性。AtMORCl蛋白与多种免疫受体结合，并作为重要的表观调控因子来调控基因沉默，这些结果都说明MORC!参与了植物中多个水平的免疫反应(Kangetal.,2010)。本课题组通过IP-MS技术经筛选得到MORC1的互作蛋白CPK6(钙离子依赖性蛋白激酶)，CPK6可以通过磷酸化AREB/ABF(脱落酸应答元件结合蛋白)来调节植物对ABA的信号响应和对干旱的抗性(Zhangetal,2019),由此我们想要进一步利用Co-IP、BiFC等蛋白互作方法确定MORC1是否与CPK6直接互作，并使用盐胁迫、渗透胁迫等处理探索MORC1除了参与免疫反应之外，还能参与植物的非生物胁迫反应，以便更好地阐述MORC1在植物生命过程中的调控机制。二、实施计划及方案（明确各个环节对培养学生创新能力的具体思路及考核办法）1、CPK6的克隆及构建提取拟南芥RNA,反转录得到cDNA,以此为模板得到CPK6基因，将其构入载体中得到pCABIA1300-CPK6-FLAG载体，在该阶段主要掌握提取RNA技术，反转录技术，PCR技术以及构建载体技术等；2、Co-IP验证MORC1与CPK6的互作使用免疫共沉淀技术验证MORC1与CPK6的直接互作，在该阶段应掌握的技术包括WesternBlot技术，以及免疫共沉淀技术；3、BiFC验证MORC1与CPK6的互作分别构建M0RC1与CPK6的BiFC重组载体，并将载体在烟草中瞬时表达，利用激光共聚焦显微镜观察，该阶段掌握烟草瞬时表达技术，以及激光共聚焦显微镜的使用方法；4、生长抑制实验验证对逆境胁迫的影响考察学生怎样去创新性的模拟干旱条件，并考虑使用哪些参数去衡量突变体和野生型之间在抵抗非生物胁迫中的差异。三、项目实施的基础和条件此次项目所有材料与器材都依托于窦道龙教授实验室，该实验室于2018年建立，实验设备完善,PCR仪、低温冰箱、PCR酶、限制性内切酶、22℃16h/8h光箱、超净台、MS培养基以及各种必需的试剂等完全可以支撑该项目的开展。实验室已经获得实验所需的植物材料morchnorc2.木实验室积累了大量科学可靠的实验方法，为遗传学和生物化学的相关实验提供了宝贵的技术支持。完善的实验条件，强大的科研团队和科学可靠的实验方法满足本项目绝大多数实验的要求。四、学牛.提交的成果1、详细的实验记录、图片以及数据：2、Co-IP以及BiFC验证蛋白互作结果的图片；3.morchnorc2是否对非生物胁迫有响应的数据和图片以及结果报告。五、经费预算1、克隆构建以及测序费用：800RMB；Co-IP实验相关费用：3000RMB；激光共聚焦显微镜使用费（公共平台）：1080RMB；