分子生物学第三章DNA的复制-基于DNA复制原理的PCR技术

PCR（聚合酶链式反应）

2023/2/151Polymerasechainreaction

---AnimportanttechniquebasedonDNAPolymerase

Thepolymerasechainreaction(PCR)istousedtoamplifyasequenceofDNAinvitro,usingapairofprimerseachcomplementarytooneendofthetheDNAtargetsequence.理论技术2023/2/152Denaturation(变性):ThetargetDNA(template)isseparatedintotwostandsbyheatingto95℃Primerannealing(退火):Thetemperatureisreducedtoaround55℃toallowtheprimerstoanneal.Polymerization(elongation,extension)(延伸):Thetemperatureisincreasedto72℃foroptimalpolymerizationstepwhichusesdNTPsandrequiresMg++.TheprincipleofPCR:ThreedifferentstepsproceedineachPCRcycle.2023/2/1535’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’DenaturationAnnealingExtension(DNApolymerase)Cycle1Cycle2Cycle32023/2/154Initial

DNA

8421NumberofDNAmolecules(2n):指数扩增2023/2/155Manycycles(25-35incommon)areperformedtocompleteonePCRreaction,whichresultedinanexponentialamplification

ofthetargetDNAinwhichbothforwardandreverseprimerspair.2023/2/156DNAtemplate(模板)AnysourceofDNAthatprovidesoneormoretargetmoleculescaninprinciplebeusedasatemplateforPCR.WhateverthesourceoftemplateDNA,PCRcanonlybeappliedifsomesequenceinformationisknownsothatprimerscanbedesigned.2023/2/1572023/2/158Figure8-3SubstratesrequiredforDNAsynthesis2023/2/159PCRPrimersAnnealonoppositestrandsofthetargetsequence:forwardandreverseprimers

（正向引物和反向引物）HavesimilarG+Ccontents(Tm)sothattheyannealtotheircomplementarysequencesatsimilartemperatures

(annealtemperature:Tm-5°C)2023/2/15105’-ATTCCGATCGCTAATCGATGGC-------TCCTGTGCATTTCGCCACTAGAG-3’3’-TAAGGCTAGCGATTAGCTACCG-------AGGACACGTAAAGCGGTGATCTC-5’5’-ATTCCGATCGCTAATCGATG-3’3’-CACGTAAAGCGGTGATCTC-5’forwardprimerreverseprimer5’-CTCTAGTGGCGAAATGCAC-3’2023/2/15115’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’DenaturationAnnealingExtension(DNApolymerase)Cycle1Cycle2Cycle32023/2/1512PCREnzymes2023/2/1513Denaturation(变性):ThetargetDNA(template)isseparatedintotwostandsbyheatingto95℃Primerannealing(退火):Thetemperatureisreducedtoaround55℃toallowtheprimerstoanneal.Polymerization(elongation,extension)(延伸):Thetemperatureisincreasedto72℃foroptimalpolymerizationstepwhichusesdNTPsandrequiresMg2+.2023/2/1514Taqpolymerase：isolatedfromthethermophilicbacteriumThermusaquaticus(嗜热菌）,耐热DNA聚合酶，耐高温Ithasno3’to5’proofreadingexonucleaseactivityHigh-accuracyDNApolymeraseisavailablecommercially(高保真酶）2023/2/1515PCR仪2023/2/1516DiscoveryofPCRtechnique希望大家不仅仅知道“是什么”，而且也了解“为什么”和“结论是怎么得出来的”2023/2/1517如果你的研究能力一般，那么，改革本研究领域中大家习以为常的最基本的技术，你就有可能获诺贝尔奖

-----KaryMullis(卡里.穆利斯)2023/2/1518ThereplicationofDNA2023/2/1519哥伦布竖立鸡蛋的故事DNA分子的拷贝术，复印机2023/2/1520PCR技术的发现充满传奇色彩KaryMullis(卡里.穆利斯)1972年获得加州大学伯克利分校生物化学博士学位1979年进入塞特斯公司：与DNA合成相关的工作1983年4月：PCR的最初想法高速公路的灵感230=10亿想法付诸行动1983年12月：第一个PCR反应成功1984年塞特斯公司申请PCR技术专利2023/2/1521PCR技术引来的官司谁发明了PCR？DNA聚合酶的发现者？纸上谈兵KaryMullis(卡里.穆利斯)胜诉2023/2/1522KaryMulliswonthe1993NobelPrizeinChemistryforhisinventionofthepolymerasechainreaction

心灵的裸舞-自传2023/2/15232023/2/1524MypresentresearchworkDegeneratePCRcanbeusedtoclonegenecodingforenzyme

简并引物PCR----结合自己的研究工作PCRapplication-example12023/2/1525Codon:degenerateAnticodon:wobble密码子的简并性2023/2/1526Manyaminoacidsarespecifiedbymorethanonecodon-degeneracy(简并性).Codonsspecifyingthesameaminoacidarecalledsynonyms(同义密码子).G2023/2/1527Degenerateprimers(简并引物):

anoligopoolderivedfromaproteinsequence.His-Phe-Pro-Phe-Met-Lyscangenerateaprimer5’-CAYTTYCCNTTYATGAAR-3’Y=Pyrimidine(CorT)N=anybaseR=purine(AorG)2023/2/1528DegeneratePCR(简并PCR)Myresearchwork:molecularbiologyresearchoflaccase(漆酶)producedinfungi--白腐真菌漆酶的分子生物学研究2023/2/1529白腐真菌白腐真菌（whiterotfungi)白腐真菌是一类使木材呈白色腐朽的丝状真菌的总称（主要是担子菌）已知的唯一能在纯系培养中有效地将木质素彻底降解为CO2和H2O的一类微生物2023/2/1530木质素：以芳香族为基本结构的高度复杂聚合物

Science,2007,315(5813):804-807

对与木质素结构相似的异生物质污染物也具有强大的降解能力2023/2/1531木质素过氧化物酶（LiP）

锰过氧化物酶（MnP）

漆酶（Lac）白腐真菌木质素降解酶系非立体选择性和非特异性

2023/2/1532漆酶（Laccase）含铜的多酚氧化酶,白腐真菌降解木质素的重要酶具有广泛的底物作用范围和独特的生物降解功能环境生物技术BiotechnologyAdvances24(2006)500–5132023/2/1533UsedegeneratePCR(简并PCR)toclonelaccasegene2023/2/1534Copper-bindingregionishighlyconservedCopper-bindingregionI:His-Trp-His-Gly-Phe-Phe-GlnCopper-bindingregionIV:His-Cys-His-Ile-Asp-Phe-His2023/2/1535简并引物PCR获得1.6kb漆酶基因特异性序列基因组步移技术获得2118bp漆酶全长结构基因RACE和RT-PCR克隆得到了1566bp漆酶基因全长cDNA序列122kb1kb----我们自己的研究工作2023/2/1536Question:BydegeneratePCR,onlythepartialsequenceofonegenecanbeobtained,Howcanwegettheentiregene?Chromosomewalking(染色体步移技术)

2023/2/1537LongDistance

inversePCRTechniqueforEfficientCloningofFlankingSequencesAdjacenttoKnownDNAFragmentsinversePCR(反向PCR)2023/2/1538Reversetranscriptase(RT)-PCR逆转录PCR检测基因的转录量PCRapplication-example22023/2/1539Reversetranscriptase(RT)-PCR逆转录PCRAAA(A)n5‘-CapmRNA(dT)12~18

primeranneal5‘-CapAAA(A)n3‘5‘ReversetranscriptiondNTP,RT5‘-CapAAA(A)n5‘cDNA:mRNAhybridRegularPCR2023/2/1540RT-PCRapplicationClonecDNAofspecificgeneDetectingtheexpressionlevelofgene2023/2/1541Studythistechniquefromexperiment(实战中学习)DetectingtheexpressionlevelofgenebyRT-PCRmRNAcDNART-PCRproduct2023/2/1542Rightpanel:PCRamplificationoftheclonedlac1cDNAusingthecyclenumberobtainedfromtheleftpanelValidationofsemiquantitativeRT-PCRassaysforexpressionleveloflac1(laccasegene)Leftpanel:KineticsofPCRamplificationwiththeelectrophoreticimageshownatthetop.Thecyclenumber(28)thatgenerateshalfmaximalreactionwasusedtoanalysetheexpressionofthe