口腔生物学-龋病微生物学

龋病微生物学

口腔生物学教研室

1教材：参考书：1.周学东，岳松龄主编《实用龋病学》人民卫生出版社，20082.周学东，施文元主编《微生物生物膜与感染》人民卫生出版社，20123.周学东，施文元主编《口腔微生态学》人民卫生出版社，2013周学东主编《实用口腔微生物学与技术》人民卫生出版社，20092主要内容1.龋病的病因学说（了解）2.致龋菌的生物学特性（掌握）3.变异链球菌是主要致龋菌（掌握）4.典型致龋菌的致病毒力因子（掌握）5.其它口腔细菌与龋病的关系（了解）3

龋病是发生于牙硬组织的慢性细菌感染性疾病，造成牙硬组织的颜色、形态、质地的改变。龋病的定义4窝沟龋根面龋5继发龋（secondarycaries)6偏光显微镜下的人工龋7SuperficialIntermediateDeepcariesPulpitisApicalabscess龋病的发展进程8蜂窝织炎（FICIALCELLULITIS）龋病并发症蜂窝织炎是指由金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌或腐生性细菌引起的皮肤和皮下组织广泛性、弥漫性、化脓性炎症。9龋病病因学10虫牙学说龋病病因学BC200011虫牙学说(legendofworm)古巴比伦；埃及；印度；中国；亚述；AFrenchcarving,datingfromthe1700s,designedtolooklikeahumanmolar.“ThetoothwormasHell’sdemon”12BC1324-1269殷墟甲骨文龋13龋＝齿＋禹(虫)虫齿14虫牙学说内源性理论体液学说活体学说龋病病因学15内源性理论

体液学说龋病是由于辛辣和腐蚀性液体的内部作用而发生中医认为，龋病是由于阴阳五行失调所致16

活体学说龋病是由牙内部发生的17虫牙学说内源性理论体液学说活体学说外源性理论化学(酸)学说寄生腐败学说龋病病因学18外源性理论近代自然科学的飞跃发展

经验科学实验科学医学19H+HealthyenamelprismsDemineralizedenamelprisms化学(酸)学说20AntonvanLeeuwenhook

"theFatherofMicrobiology"寄生腐败学说21龋病与微生物活动密切相关寄生腐败学说22虫牙学说内源性理论体液学说活体学说外源性理论化学(酸)学说寄生腐败学说龋病病因学化学细菌学说2319世纪对微生物学的发展做出了奠基性贡献，主要功绩：1.细菌分离、鉴定技术2.病原微生物确定标准3.发现结核杆菌细菌学家Koch(1843～1910)2425化学细菌学说：菌丛的化学作用

chemico-parasitictheory1889年LouisPasteur蔗糖乳酸微生物1890年W.D.Miller首次详细论证了细菌、酸和龋病三者的关系(TheMicroorganismsoftheHumanMouth)

“Thefatheroforalmicrobiologist”26Miller人工龋实验脱矿不脱矿

牙齿+面包（糖）+唾液龋牙齿+面包（糖）+煮沸唾液无龋牙齿+脂肪（肉）+唾液无龋27SugarBacteriafromplaqueAcidAcidHealthyToothDecay

细菌酵解碳水化合物产酸是龋病的病因28几个经典的动物实验Orland无菌动物实验Meclure&Hewitt抗生素实验Keyes龋病传播动物实验291.NobacterianocariesgermfreeratsSoundteethBacteriaseperatedfromcariesinoculated?Orland无菌动物实验30Enterococcusseperatedfromcarieslesioninoculatedcaries2.CariesdevelopedwithbacteriainoculatedOrland无菌动物实验平息了细菌在龋病发生中作用的争论31Meclure&Hewitt抗生素实验AntibioticsinhibitedcariesPenicillincariesMeclure&Hewitt194632Keyes龋病传播动物实验无龋仓鼠与患龋鼠混合喂养，或感染患龋鼠的排泄物，会发生龋齿给妊娠期或哺乳期的患龋鼠使用青霉素，可减少子代患龋率。KEYES.P.H..Arch.OralBio.1960,Vol.1,pp.304-320.33

微生物是龋病发生发展中的关键因素，没有微生物的参与就不会有龋病的发生34化学细菌学说的评价总结了龋病发生中的主要因素：口腔微生物在产生酸方面的作用；微生物发酵碳水化合物底物；产生的酸导致牙矿物质溶解；第一次阐明了口腔微生物、食物、酸与龋病发生的关系，抓住了龋病发生的本质35局限性：未阐明牙面微生物的存在形式不能解释龋发生的特异性部位不能解释龋发生的个体差异未确定致龋的病原菌36虫牙学说内源性理论体液学说活体学说外源性理论化学(酸)学说寄生腐败学说蛋白溶解螯合学说龋病病因学化学细菌学说蛋白溶解学说37蛋白溶解学说(proteolysistheory)釉质中有机基质的存在早期釉质龋多见于釉质有机基质丰富区龋坏区中的色素沉着是蛋白分解所致病理学的发展38蛋白溶解学说由于蛋白的溶解作用，微生物通过釉质的有机途径侵入并使龋病发生(先有有机物的分解后有无机物的脱矿)39蛋白溶解-螯合学说有机成分降解螯合矿物质溶解(proteolysis-chelationtheory)细菌产生的蛋白溶解酶将牙内有机成分分解，产生具有螯合功能的有机酸可与牙中的钙盐结合形成可溶性的螯合物，从而使牙硬组织中的无机和有机物破坏崩解40成熟釉质中不到1％的有机物分解产生的螯合剂如何螯合大量(96％)的无机磷灰石晶体？局限性41虫牙学说内源性理论体液学说活体学说外源性理论化学(酸)学说寄生腐败学说化学细菌学说现代四联因素论龋病病因学蛋白溶解学说蛋白溶解螯合学说42宿主微生物食物时间龋病的四联因素43细菌

细菌致龋的必要条件：牙面附着：GTF，FTF，GBP等产酸：LDH，Enolase等耐酸：F-ATPase，AgDS等毒力调控相关因子：QS，TCSs44食物碳水化合物（致龋）能量胞外多糖（EPS）和胞内多糖（IPS）选择含氮化合物（抗龋）尿素酶（Urease）精胺酸脱亚胺酶（ADS）精氨酸脱羧酶（ADC）45宿主牙齿：矿化程度，窝沟深浅，牙齿位置唾液：缓冲能力，唾液免疫球蛋白，乳铁蛋白，过氧化氢酶，唾液溶菌酶等全身因素：血糖浓度与牙本质小管液流动方向遗传因素：单基因遗传关联（唾液分泌及免疫球蛋白合成），全基因组关联（GWAS）46时间 Stephan曲线：进食后菌斑原位pH的变化过程甜食频率vs甜食的量再矿化vs龋病形成所需时间

47DentalCaries48虫牙学说内源性理论体液学说活体学说外源性理论化学(酸)学说寄生腐败学说化学细菌学说现代四联因素论龋病生态病因学龋病病因学蛋白溶解学说蛋白溶解螯合学说49龋病病因的新认识牙菌斑(dentalplaque)：细菌粘附于牙面或修复体上形成的生态环境，细菌在其中生长、繁殖和衰亡，并进行着复杂的物质代谢活动，在条件适当时，细菌的代谢产物可造成牙体或牙周组织的破坏JamesLeonWilliams(April18,1852–February23,1932),oneofthefoundersofIADR50龋病病因的新认识

生物膜(biofilm)

各种细菌嵌于来自其自身和/或外界环境的胞外基质内，而在固相界面上结成的有着三维立体结构的微生态环境JOHNWILLIAMCOSTERTON(July21st,1934-May12th,2012),“thefatherofbiofilm”51牙菌斑52

牙面生物膜的SEM观察5319世纪末“Non-SpecificPlaqueHypothesis”1976年“SpecificPlaqueHypothesis”1986年“Non-SpecificPlaqueHypothesis”(updated)1994年“EcologicalPlaqueHypothesis”2012年

“Keystone-PathogenHypothesis”牙菌斑致病性的认识54龋病生态病因学

口腔中没有特异性的致龋菌，引起龋病发生的细菌属于口腔的正常菌群，正常情况下口腔细菌与人体之间处于动态的生态平衡。各种因素造成平衡的破坏，正常细菌成为条件致病菌，引发龋病。龋病发生是口腔生态失调的结果。55

口腔内微生物的种类和数目繁多，包括细菌、真菌、支原体和病毒等。龋病实质上是牙齿局部生态环境（牙菌斑）平衡失调的表现。S.mutansL.caseiA.viscosusA.odontolyticusF.nucleatumS.salivarius56ORALMICROFLORA~1000humanoralmicrobialspecies:~1/3isolatedandcharacterizedbycultivation;~2/3identifiedbyculture-independentapproaches.Newspecies-levelphylotypesfoundineachnewstudy.Oralmicrobiome16SrRNAdatabasehasbeenpublishedonline.57生态菌斑假说

“EcologicalPlaqueHypothesis”58CariesandEcologicalplaquehypothesis[Review]Historicalandcontemporaryhypothesesonthedevelopmentoforaldiseases:arewethereyet?FrontCellInfectMicrobiol.2014;4:9259微生态平衡与龋病

ProtectiveFactorsSalivaflowandcomponentsFluoride-remineralization

Antibacterials-chlorhexidine,Iodine?,xylitol,new?NoCariesCariesPathologicalFactorsAcid-producingbacteriaSub-normalsalivaflowandfunctionFrequenteating/drinkingoffermentablecarbohydrates60虫牙学说内源性理论体液学说活体学说外源性理论化学(酸)学说寄生腐败学说化学细菌学说现代四联因素论龋病生态病因学龋病病因学蛋白溶解学说蛋白溶解螯合学说61

主要因素影响因素与龋病发生有关的代谢产物牙齿破坏的机理在龋病过程中的作用口腔卫生口腔细菌(量和种类)唾液(pH、成分、流速、缓冲能力)氟含量

有机酸

→无机物溶解→主要食物

螯合剂→与钙螯合→小碳水化合物的种类、浓度、摄入量和频率、方式

蛋白水解酶→在脱矿后分解有机物→在釉质口腔清除率(食物的物理性状)、食物清除率

龋中甚微，而在牙本质龋中不可忽视

年龄排列和外形矿化程度氟及其它微量元素的含量唾液的矿物质成分全身因素龋病的发生因素和发生机理致龋牙菌斑适宜的底物易感的牙齿62小结

龋病是发生在牙体硬组织（宿主）的、由微生物（细菌）代谢（食物）产酸所导致的慢性（时间）感染性疾病。AFrenchcarving,datingfromthe1700s,designedtolooklikeahumanmolar.“ThetoothwormasHell’sdemon”63致龋菌的生物学特性对牙面的黏附力；产酸性与耐酸性；合成胞内外多糖；64动物和人龋的研究表明:一些细菌能引起龋，而另一些细菌不致龋；一些细菌能引起光滑面龋和点隙裂沟龋，而另一些细菌能引起根面龋或沟裂龋。不同的细菌具有不同的致龋能力

65不同细菌对动物的致龋力牙齿细菌动物光滑面点隙沟裂根面变异链球菌++++++++鼠、仓鼠、猴血链球菌+++—鼠唾液链球菌—++仓鼠、鼠轻型链球菌—+—鼠粪链球菌—+—鼠肠球菌—+—鼠干酪乳杆菌—+—鼠嗜酸乳杆菌—+—鼠粘性放线菌—±++仓鼠、鼠内氏放线菌——+仓鼠不同细菌具有不同的致龋力引起不同部位龋的细菌种类不同所有能致龋的细菌均能产酸,但并非所有产酸菌都能致龋66菌斑细菌合成多糖的能力细菌细胞外多糖细胞内多糖

水溶性葡聚糖水不溶性葡聚糖果聚糖杂聚糖变异链球菌+++-+血链球菌+---+唾液链球菌+--+-+缓症链球菌+----+粘性放线菌--+++内氏放线菌---++衣氏放线菌----+干酪乳杆菌+--++奈瑟菌+---++

67部分细菌对不同口腔部位的粘附力粘附部位细菌牙面舌面颊粘膜

变异链球菌+++++

血链球菌++++++

唾液链球菌+++++++

缓症链球菌+++++++

放线菌++++++

韦荣球菌++++

奈瑟菌+++681.符合致龋菌应具备的生物学特性（必要条件）2.在龋损的各个时期都可分离到并可得到纯培养3.细菌量与龋病的发生密切相关4.能引起实验动物的传染性龋损5.选择性限制该菌可以减少龋病的发生致龋微生物的判断标准69人类致龋细菌的特异性人类龋的发生与变异链球菌群密切相关，变异链球菌是人类主要致龋菌；致龋菌不是单一的一种细菌，而是多种产酸和耐酸细菌；

从龋损部位分离：

变异链球菌、放线菌、乳酸杆菌等

70细菌与龋病有无关系?细菌与龋病是什么关系?

不同种类细菌与龋病有何关系?71口腔链球菌与龋病72（一）口腔链球菌(属)的一般特性

链球菌属(Streptococcus)，口腔常驻菌，在口腔天然菌群中比例最大。根据细菌的菌落形态、生理学和生物化学特性，可将口腔链球菌分为不同的种，包括：血链球菌(S.sanguis)、缓症链球菌(S.mitis)、格氏链球菌(S.gordoniii)、唾液链球菌(S.salivarius)和变异链球菌(S.mutans)。73Kingdom（界）:Bacteria

Phylum（门）:Firmicutes

Class（纲）:Bacilli

Order（目）:Lactobacillales

Family（科）:Streptococcaceae

Genus（属）:Streptococcus

Species（种）:StreptococcusmutansStrain（株）：Streptococcusmutans

UA159Streptococcusmutans

UA15974口腔链球菌在口腔的分布(%)细菌牙面菌斑舌背颊粘膜唾液龈沟血链球菌1541188缓症链球菌15860208唾液链球菌<0.5201120<0.5

变异链球菌0~50<1<1<1—米勒链球菌++

75（二）变异链球菌与龋病

1.基本表型特征

G+染色，菌体呈球形，直径0.5-0.75μm。肉汤培养基：菌细胞呈短杆状或球杆状，成

对或链状排列，链长中等，或短，不活动。菌落形态变异较大：轻唾琼脂平板(MS)：菌落形态高凸，粗糙，不透明，毛玻璃状，嵌于琼脂内。

血琼脂平板：菌落呈圆形，表面光滑，直

径0.5-1mm，周围有α(绿色)溶血环。76Streptococcalclassification致病力：弱强无77α-hemolysis(S.mitis);β-hemolysis(S.pyogenes);γ-hemolysis(non-hemolytic,E.faecalis)78AB变异链球菌（Stretococcusmutans）菌落：A：光滑型菌落B：粗糙型菌落79变异链球菌（Streptococcusmutans）细胞80变异链球菌的SEM观察

812.生长条件兼性厌氧菌（5%CO2，95%N2)最适pH7，最低pH4.3，4.5%NaCl，不被杆菌肽抑制选择性培养基：MSB(MS+杆菌肽)或MSSB（MS+杆菌肽+20%蔗糖）823.细胞壁组成（1）多糖菌株抗原性血清型（2）肽聚糖：N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸、

短肽（3）甘油磷壁酸：壁磷壁酸、膜磷壁酸（4）表面蛋白：GTF、FTF，决定变链的抗原性和在牙面的粘附834.变异链球菌群（Streptococcusmutansgroup或MutansStreptococci）变异链球菌是一族(组)异源性细菌，其表型特征相同，但遗传型和血清型不同。遗传性：七种血清型：八种(a-h)84变异链球菌群的命名、分类及其宿主命名血清型G+C（mol%）宿主变异链球菌（S.

mutans）c、e、f36~38人、猴大鼠链球菌（S.

rattus）b41~43大鼠表兄链球菌（S.sobrinus）d、g、h44~46人、猴仓鼠链球菌（S.

cricetus）a42~44仓鼠野鼠链球菌（S.ferus）c43~45野生鼠猕猴链球菌（S.

macacae）c35~36猴道恩链球菌（S.

downei）h41~42猴855.变异链球菌的致龋特性产酸性和耐酸性合成细胞内外多糖对牙面的黏附作用环境刺激应答86MatsuiandCvitkovitch,AcidtolerancemechanismsutilizedbyStreptococcusmutans.FutureMicrobiol.2010.5(3):403–417.基因表达的调控在变异链球菌的耐酸机制中发挥着非常重要的角色变异链球菌的耐酸机制87变异链球菌基因组编码大量调控基因变异链球菌的基因组编码约2000个基因。其中包括100多个转录因子，14对双组份系统，1个未配对的应答调节蛋白和1个类真核丝/苏氨酸蛋白激酶。Ajdićetal.GenomesequenceofStreptococcusmutansUA159,acariogenicdentalpathogen.ProcNatlAcadSciUSA.2002;99(22):14434-9.转录因子和双组份系统在变异链球菌对外界环境胁迫（如氧化胁迫和酸胁迫等）的应答以及重要生理功能（如产酸、合成多糖、粘附和形成生物膜的能力等）的调节过程中发挥了重要的作用。886.变异链球菌与龋病的关系（1）横向的流行病学调查表明：变异链球菌的检出率同龋病的发生呈正相关。（2）纵向的追踪调查表明：唾液或菌斑中变异链球菌的检出率与随后龋病的发生呈正相关。问题：其他细菌仍可诱发动物龋，变链和龋活跃性的关系不是恒定的。结论：变链是主要的致龋菌，但不是唯一的致龋菌。89其他龋病相关细菌90口腔乳杆菌与龋病

91（一）形态学乳杆菌属（Lactobacillus），口腔常驻菌，占口腔细菌的1%，革兰氏阳性杆菌，属兼性厌氧或专性厌氧菌。

菌体细长，直径0.6~0.9µm，不分支，无芽胞，不活动。

菌落呈圆丘形，表面光滑或粗糙，不透明，干酪样白色或淡褐色。92嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）菌落93嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）细胞94（二）分类（按代谢方式）

专性同发酵乳杆菌（Obligatelyhomofermentative，GroupI）：嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌

兼性异发酵乳杆菌（Facultativelyheterofermentative，GroupII）：干酪乳杆菌、胚芽乳杆菌

专性异发酵乳杆菌（Obligatelyheterofermentative，GroupIII）：发酵乳杆菌、短乳杆菌

homofermentative:C6H12O6→2CH3CHOHCOOH（乳酸）heterofermentative:C6H12O6→CH3CHOHCOOH（乳酸）+C2H5OH+CO295（三）培养

耐酸性很强，能耐受使其它无芽胞细菌死亡的酸度。该菌的选择性培养基—Rogosa培养基即是根据其特有耐强酸性配制的。此培养基的pH为4.7-4.8，在此pH条件下，只有乳杆菌属能生长。96（四）生化反应多数乳杆菌无蛋白分解作用，不产生吲哚，不还原硝酸盐，触酶阴性。能发酵多种糖（对糖的发酵反应视菌型而异），产酸能力强，能使菌斑pH降低至5以下。能合成胞内外多糖：干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌合成胞外多糖，而且干酪乳杆菌还可以合成胞内多糖。97（五）口腔乳杆菌的致龋性1.早期研究认为乳杆菌是主要的致龋菌。2.目前的研究表明乳杆菌不是龋病发生的初始致病菌,但参与了龋病的发展。3.对胶原黏附具有特异性，在牙本质龋和根面龋中起重要作用。

98乳杆菌对牙骨质的粘附99乳杆菌对牙本质的粘附100（一）形态学

口腔中最常见的革兰氏阳性丝状菌，主要定居在牙面，其次是龈沟和舌背，而唾液和其它口腔粘膜表面较少。无鞭毛和芽胞，菌细胞末端较膨大，形态不规则，为丝状或杆状，长短不一。呈丝状者常很长并有分支，可达10~50µm；短的杆菌体为1.5~5µm。

口腔放线菌与龋病101黏性放线菌

(Actinomycesviscosus)细胞102BAA：黏性放线菌

(Actinomyces

viscosus)菌落B：内氏放线菌

(Actinomyces

naeslundii)菌落103

透射电镜下观察，放线菌有菌毛(fimbria)，各放线菌的菌毛成分不一样，黏性放线菌有I型和II型两种类型的菌毛，而内氏放线菌只有II型菌毛。

菌毛与放线菌的黏附性能密切相关。104

透射电镜观察：黏性放线菌菌毛105

透射电镜观察:黏性放线菌菌毛106（二）分类口腔放线菌细胞壁主要由肽聚糖和各种糖类组成，其抗原物质主要来自细胞壁成分：一类是多糖抗原，另一类是由多肽或含多肽的化合物组成。

根据细胞壁抗原成分的不同，各种放线菌可进一步分为不同的血清型。

107(三）培养特性

兼性厌氧菌，但不同菌种对氧的敏感性有差异。衣氏放线菌、迈氏放线菌和龋齿放线菌在厌氧条件中生长更好。黏性放线菌、内氏放线菌补充CO2可明显促进生长。最适生长pH为6.5-7.0。

放线菌为化能异常菌，生长需要有机氮、碳水化合物、维生素和其它生长