中和性抗人巨细胞病毒抗体的制备及表位鉴定

中和性抗人巨细胞病毒抗体的制备及表位鉴定人巨细胞病毒 归属于疱疹病毒乙亚科的巨细胞病毒属是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒为病毒直径约基因组大小为 4人类是 的唯一宿主。这种病毒进入细胞内以后会导致细胞体积增大。根据感染的时间,人类巨细胞病毒感染可分为先天感染和后天感染。一般情况下 原发感染为隐性感染无明显的临床症状一经感染终生携带,病毒周期性地从黏膜部位释放。免疫力低下者如器官、骨髓移植病人和艾滋病患者感染 可导致视网膜炎、肺炎、脑炎等严重致命性疾病。对于孕妇来说 原发或复发感染均可引起胎儿宫内感染或围产期感染而导致新生儿畸形、智力低下和发育迟缓等。由于 感染患者大多处于潜伏感染状态即使 在体内复制活动也多为无症状性感染。目前又无有效、安全的抗 药物故对 感染的治疗仍限于症状性感染时的对症处理。有效抑制病毒复制的药物如更昔洛伟、丙氧鸟苷等已广泛用于的预防和治疗但是常会伴有骨髓抑制、肾毒性、特异性反应及耐药性等副作用。因此研究与制备中和性抗 抗体开发抗 疫苗对于 的治疗和预防有着重要的医学价值和社会意义。人巨细胞病毒基因组编码超过20种0蛋白重要的包括结构蛋白 、 、非毒力蛋白 和包膜糖蛋白、、等。目前已制备了多个以、 6 - 为抗体的结合表位的抗体在体内尽管具有较高的结合活性和效价,但是中和活性不高,无法完全阻止在体内的感染。近期研究发现,人巨细胞病毒使用了两种不同的方式感染成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和巨噬细胞。通过糖蛋白复合物、 、 感染成纤维细胞而感染上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞需要附加 复合物五聚体）回顾 疫苗开发的历史也可以发现早期开发的减毒活疫苗如 和虽然可以诱导获得短暂的中和抗体应答但不能彻底清除体内病毒阻止病毒对上皮细胞的感染。而基因检测发现两者正是缺失了五聚体基因。因此五聚体有可能是中和性抗体的关键靶抗原。本研究拟采用分子克隆和抗体工程技术等技术制备中和性抗 抗体分别在动物和个体水平检测中和性抗体的特异性明确五聚体可以作为中和性抗体的靶抗原。研究分为以下三个部分一、兔源中和性抗 单克隆抗体的制备及其特性鉴定本部分研究拟在动物水平检测抗 抗体产生的类型以及中和活性和结合活性的特点。研究首先使用经基因修饰包含有五聚体的 减毒病毒疫苗免疫家兔。再通过细胞融合和特异性筛选鉴定获得兔源单克隆抗体。使用病毒中和实验和 分别检测抗体中和活性和结合活性。采用基因工程技术获得抗体可变区序列。综合抗体特异性检测结果,对抗体可变区基因组进化聚类进化分析。结果显示成功制备株抗 兔源单克隆抗体其中具有中和抗体作用抗体株。绝大部分的结合性抗体并不同时具有中和活力而且其靶抗原多为蛋白。基因组分析结果显示株单克隆抗体来自于个细胞组组内抗体的抗原结合特性和中和活性较为统一。中和性抗体的和平均长度为和明显长于个结合性抗体的均值和。上述结果提示以五聚体作为抗原表位的抗体具有较好的中和活性。二、抗全分子人兔嵌合抗体及人源化抗体的制备及特性鉴定本部分研究旨在利用抗体工程技术开发与制备中和性抗抗体。研究采用分子克隆和基因重组的方法制备人兔嵌合抗体表达质粒。使用人源替换技术设计并优化兔单抗可变区序列并制备人源化抗体表达质粒。使用真核细胞表达系统表达全分子抗体。使用亲和层析系统纯化抗体使用病毒中和实验和分别检测抗体中和活性和结合活性。结果显示成功制备株人兔嵌合抗体和株人源化抗体。重组抗体的种属特异性更接近于人,且保持一定的中和活力或结合活力。抗体基因序列与抗体的特异性、区基因空间构象以及抗体的表达有直接作用。上述结果表明可以通过抗体工程技术制备制备、优化抗中和性抗体为相应治疗性抗体的研发奠定理论基础。三、全人源抗单克隆抗体的筛选、制备及特性鉴定本部分研究的目的是验证感染的个体中五聚体是其产生的中和性抗体的主要靶抗原。本研究选取高滴度 感染者外周血使用免疫磁珠筛选获得记忆型细胞并进行单细胞培养。设计人源抗体引物并采用单细胞 技术获得抗体可变区序列。采用抗体工程技术制备与表达全人源抗 抗体并使用病毒中和实验和分别检测抗体中和活性和结合活性。结果显示成功获得株全人源抗抗体其中中和性抗体株。个中和性抗体的靶抗原为五聚体占中和作用抗体总数的 。个中和性抗体 的轻链为 链占中和作用抗体总数的 。结果表明感染 的个体中大部分中和性抗体的表位为五聚体。从高滴度 感染者体内获取全人源高中和性抗 单克隆抗体是可行的。综上所述不