脐血间充质干细胞喷雾剂及修复创面的实验研究可行性报告

NC市科技计划项目可行性研究报告项目名称：脐血间充质干细胞喷雾剂及修复创面的实验研究计划类别：重大项目申报单位（盖章）：NC大学第二附属医院联系人：HGG联系电话：1000000018通讯地址：NC市MD路1号管理部门：JX省卫生厅NC市科技局二○XX年X月XX日NC市科技计划项目可行性研究报告编写提纲一、总论（一）项目的主要内容及技术原理简述（二）项目的目的和意义（三）相关技术领域国内外发展现状、趋势（四）项目主要负责人的基本情况（五）有关本项目的现有工作基础和支撑条件二、项目实施方案（一）项目达到的目标及考核的主要技术经济指标（含知识产权、技术标准）（二）项目的主要研究（开发）内容（三）试验（开发）规模及地点（四）主要技术关键及创新点（五）实施方案（含技术路线、工艺流程及技术关键的解决方案）（六）分年度的工作内容、目标（七）申请单位、合作申请单位及主要人员的分工（八）组织及管理的运行机制（九）相关依托工程（含技术）的落实情况（十）有关本项目的国内外知识产权状况分析三、技术、经济效益分析（含市场风险分析、推广应用前景及产业化可行性）一、总论项目的主要内容及技术原理简述研究目的是为皮肤缺失患者提供一种新型皮肤替代物。从脐血中提取MSCs，并进行培养、纯化、扩增及表型鉴定，然后将其向表皮干细胞定向诱导培养并行表型鉴定；用培养基、水溶性无毒高分子材料等研制一种成膜喷雾剂；然后将诱导的细胞与喷雾剂混合后培养，制备含细胞的成膜喷雾剂。细胞促进创面的功能性修复；喷雾剂于肌体表面后迅速干燥并形成一层多孔性的高分子膜，具有良好的透气性，起到保护创面，防止细菌侵入的作用；用小型香猪制备烧伤动物模型，创面随机分为空白对照组，喷雾剂组，治疗A组，治疗B组。空白对照组用生理盐水喷雾到创面；喷雾剂组仅单纯覆盖喷雾剂；治疗A组用未经诱导的MSCs＋喷雾剂覆盖；治疗B组用经体外定向诱导的MSCs＋喷雾剂覆盖。观察创面愈合情况，并取材行组织学、电镜、双色免疫荧光、PCR及原位杂交等相关检测。预期该替代物细胞来源方便，而且可采用自体或配型相近的MSCs，治疗过程相对简单，并且可促进受损创面修复后的功能重建。项目的目的和意义大面积烧伤或创伤的患者，常由于缺乏可供移植的自体皮肤，创面修复困难，严重影响肢体功能与形态，甚至导致死亡。如何防止种子细胞的老化和构建血管化、含皮肤附件、可冻存，并有抗排斥能力的复合皮是组织工程皮肤的发展方向。本项目预构建增殖能力强的血管化的组织工程皮肤，具有很强的临床实用性，并为大规模产业化生产奠定基础，因而有着极其巨大的社会和商业价值。相关技术领域国内外发展现状、趋势大面积烧伤或创伤的患者，常由于缺乏可供移植的自体皮肤，创面修复困难，严重影响肢体功能与形态，甚至导致死亡。目前，临床上运用各种手段对大面积深度烧伤创面进行覆盖，其结果是消灭了创面，挽救了患者生命。但不足之处是普遍存在愈合后的表皮薄，不耐摩擦，易起水疱及无毛发和排汗功能等缺陷，严重影响患者的生活质量。推测其原因主要为移植的细胞是增殖、分化能力差的较老化细胞。促进受损创面修复后的功能重建已成为组织修复领域从基础研究到临床治疗需要解决的重大难题，具有重要的理论意义和临床应用价值[1]。脐带血是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液，主要包含造血干细胞和间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCS）。脐血作为一种具有全能干细胞特点的细胞，为中胚层发育的早期细胞，具有多项分化潜能，其形态和生物学特点与骨髓源性MSCS相似。国内外已有大量的实验证实骨髓MSCS还可以向中胚层和外胚层来源的组织分化，在一定条件的控制下可分化为肌细胞[2]、成骨细胞[3、4]、脂肪细胞[5]、神经细胞[6]、肝细胞[7]、心肌细胞[8]和表皮细胞[9、10]。Krause[11]等通过鼠骨髓移植实验和Korbling[12]等通过对人骨髓移植的患者的检测发现，MSCS在体内可以分化为表皮细胞，并可以长期存在。因此，有关MSCS能否跨胚层转化为上皮细胞的科学问题已得到初步解决。由于骨髓源性MSCS存在高度病毒污染的可能，且随着年龄增长，其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，故寻找一种能替代骨髓MSCS，并可弥补其缺陷的MSCS，已成为研究的热点。研究已证实脐血MSCS诱导分化后也能成为神经细胞[13]、心肌细胞等[14]。人脐血MSCS可替代骨髓MSCS[15]，即使冷冻保存后，也可作为实验、临床及组织工程的细胞来源[16]。于骨髓相比，脐血源性MSCS优势在于：①脐血有更充足的来源，脐血收集容易；②脐血受胎盘屏障的保护，其成分被病毒、细菌污染的几率低；③脐血的免疫源性更低，能耐受更大程度上的HLA配型不符；④脐血包含丰富的干细胞，与人骨髓中数目相当，且更为原始，具有更强的扩增、分化能力；妊娠3个月的脐带血在含10％胎牛血清的条件下，可以扩增至少20代，平均积累细胞50.3±4.5，其中含有大量的MSCS；⑤收集的脐血不仅可做异基因移植的供体，而且还可将之低温保存数10年，用于自体移植治疗相关疾病。因此，自体细胞就可作为组织工程的种子细胞[17]；⑥虽然存在异体移植的问题，一方面脐血干细胞抗原性弱，另一方面目前全国很多城市均在建立脐血库。据山东省脐血库3000份脐带血测试，所存储的脐带血具有3个以上HLA位点与待查病人的相合几率为100％，6个HLA位点相合的几率为5％。如病人所需最低单个核细胞为2.7×107/kg,则所存脐带血中有近50％可供体重为50kg左右病人应用。故脐血干细胞的作用越来越突出，可作为一种新的替代细胞来源用于各系统疾病的细胞移植及基因治疗。随着脐血库的建立完善及脐血体外扩增技术的成熟，为脐血的临床应用奠定了坚实的基础。MSCS的表型不均一，具有间质细胞、上皮细胞和内皮细胞的特点，即MSCS可表达多种黏附相关分子，如整合素亚基a3、a4、a5、β以及整合素ICAM－1，CD44H等。它对表面抗原SB-10、SH2、SH-3、CD29、CD44、CD90、CD106、CD120a和CD124等均呈阳性反应[18]，而对造血细胞的CD14、CD34、CD45抗原均呈阴性反应，也不表达以下上皮细胞和上皮干细胞的表型：如pan-cytokeratin,cytokeratin19(K19),cytokeratin5/8(K5/8)以及整合素α6等。目前没有发现公认的MSCS特异性表面抗原，无直接方法可鉴定MSCS，都是通过在培养过程中出现分化表型，然后逆推得知是否为骨髓MSCS[18、19]近来，随着对MSCS研究的深入，逐渐发现MSCS在损伤等刺激下能参与多种组织的修复，其机制尽管尚未完全阐明，但初步结果显示可能与创伤的刺激及局部创面的微环境中含有各种不同的因子有关，它们具有促进MSCS趋化以及诱导MSCS向所需要的组织或细胞分化来参与组织的修复。细胞分化依赖于细胞处的三维空间结构和相应的多维分化信号[20]。细胞与细胞、细胞与细胞外基质间相互作用直接影响干细胞的分化方向和进程。周边环境对其增殖、分化有重要作用。生物体提供了复杂微妙的微环境。我们可以借助生物体本身来进一步完成多种干细胞的诱导分化。呼和塔娜[21]报道将体外培养扩增的雄性豚鼠骨髓MSCS移植皮肤深Ⅱ度烧伤的雌性豚鼠创面，结果发现治疗组的皮肤创面修复较好，真皮与表皮结构清晰，表皮各层清楚，真皮层胶原纤维排列整齐；而对照组的皮肤创面细胞各层次不清楚，真皮层胶原纤维排列不规则。随着人们对修复质量要求的不断提高，如何使受创组织达到解剖重建与功能修复乃至“完美愈合”已成为当前组织修复中需要解决的重要问题。由于MSCS取材方便，治疗过程相对简单，采用自体MSCS移植对提高修复质量，特别是皮肤附件的再生可能是一条可行的途径[1]。MSCS移植到受损创面后，肉芽组织及新生表皮中存在MSCS来源的血管内皮细胞和表皮细胞[9、10]并初步发现MSCS参与了皮脂腺导管的构成。这些都构成了采用自体MSCS移植提高创面愈合质量的基础。本项目预采用无血清培养方法培养MSCS，可以避免由于血清中存在的复杂因子给移植物带来的免疫源性，避免含血清培养中病毒等病原体污染，不含有毒物质，符合创面修复要求，可更安全地应用于临床。本项目拟试制一种成膜喷雾剂，它可携带定向诱导后的MSCS喷到创面。其特征在于在喷雾前是液体状态，喷雾于机体表面后迅速干燥并形成一层多孔性的高分子膜，具有良好的透气性[22]。成膜剂在创面较早形成一个保护膜，起到了保护创面，防止细菌侵入的作用，并临时替代了剥脱表皮的功能，减轻疼痛、渗出，预防创面继发性感染。水溶性高分子材料如羟甲基纤维素、聚维酮等作为口服药片的包衣剂，对人体和细胞均无毒。壳聚糖来源丰富，无毒，无污染。它作为一种新型的成膜剂，不仅能成膜，而且能有效抑制细菌入侵和生长[23]。局部应用MSCS治疗促进皮肤创面愈合，提高愈合质量，可能通过以下几种途径：①MSCS分泌的细胞因子和生长因子促进创面肉芽组织的形成、再上皮化及附件的再生；②MSCS转化为表皮细胞、血管内皮细胞及皮肤附件的某些结构参与修复。由于脐血MSCS取材方便，用喷雾剂携带治疗过程相对简单，而且采用自体或配型相近的MSCS对提高修复质量，特别是皮肤附件的再生可能是一条可行的途径，预期有着广阔的研究和临床应用前景。参考文献1．FuXB,FangLJ,WangYX,etal.Enhancingtherepairqualityofskininjuryonporcineafterautograftingwiththebonemarrowmesenchymalstemcells[J].NatlMedJChina,20YY,84(11)920-924.2．WakitaniS,SaitoT,CaplanAI.Myogeniccellderivedfromratbonemarrowmesenchymalatemcellexposedto5-azacyudine[J].Musclenerve,1995,18:417~424.3．KadiyalaS,YoungRG,ThideMA.Culturedexpandedcaninemesenchymalstemcellspossessosteochondrogenicpotentialinvivoandinvitro[J].CellTransplant,1997,6:125~133.4．MachayAM,BeckSC,MurphyJM,etal.Chondrogenticdifferentiationofculturedhumanmesenchymalstemcellsfrommarrow[J].TissueEng,1998,4(4):4155．PittengerMF,MachayAM,BeckSC,etal,Multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells[J].Science,1999,284(5411):143~147.].6．AziziS,StokesD,AugelliBj,etal.Engraftmentandmigrationofhumanbonemarrowstromalcellsimplantedinbrainofalbinorats-sililaritiestoastrocytegrafts[J].ProcNatlAcadSciUSA,1998,95(7):3908.7．SchwartzRE,ReyesM,KoodieL,etal.Multipotentadultprogenitorcellsfrombonemarrowdifferentiateintofunctionalhepatocyte-likecells[J].JClinInvest,20XX,109(10):1291.8．MakinoS,FukudaK,MigoshiS,etal.Cardiomyocytescanbegeneratedfrommarrowstromalcellsinvitro[J].JClinInvest,1999,103(5):697.9．XXX，XXX，XXX，等.骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的实验研究[J].中华烧伤杂志，20XX，19：22－24.10．XXX，XXX，XXX，等.在体诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮细胞的初步观察[J].中华创伤杂志，20XX，19：212－214.11．KrauseDS,TheiseND,CollectorMI,etal.Multi-organ,multilineageengratmentbyasinglebone-derivedstemcells[J].Cell,20XX,105:369-377.12．KorblingM,KatzRL,KhannaA,etal.Hepatocytesandepithelialcellsofdonororgininrecipientsofperipheral-bloodstemcells[J].NEnglMed,20XX,346:738-746.13．YoonHa,JoongUhnChoi.DoHeumYoon,etal.Neuralphenotypeexpressionofculturedhumancordbloodcellsinvitro[J].DevelopmentalNeuroscience,20XX,12(16):3523.14．SarahA,Wexler,CraigD,etal.Adultbonemarrowisarichsourceofhumanmesenchymalstemcellsbutumbilicalcordandmobilizaedadultbloodarenot[J].BritishHaematology,20XX,121:368.15．OscarK.Lee,TomK.Kuo,Wei-MingChen,etal.Isolationofmultipotentmesenchymalstemcellsfromumbilicalcordblood[J].Blood,20YY,103(5):1669~1675.16．LeeMW,YangMS,ParkJS,etal.Isolationofmesenchymalstemcellsfromcryopreservedhumanumbilicalcordblood[J].IntJHematol.20YY,81(2):126~130.17．DortheS.,AnitaM.,StefanN,etal.Livingpatchesengineeredfromhumanumbilicalcordderivedfibroblastsandendothelialprogenitorcells[J].EuropeanJournalofCardio-ThoracicSurgery.20YY,27(5):795~800.18．CongetPA,MinguellJJ.Phenotypicalandfunctionalpropertiesofhumanbonemarrowmesenchymalprogenitorcells[J].JCellPhysiol,1999,181(1):67~73.19．MorrisonSJ,ShahNM,AndersonDJ.Regulatorymechanismsinstemcellbiology[J].Cell,1997,88（3）：287～295.20．MorrisonSJ,ShahNM,AndersonDJ.Regulatorymechanismsinstemcellbiology[J].Cell,1997,88(3):287-295.21．XXX，XX，XX，等.骨髓间充质干细胞治疗皮肤深Ⅱ度烧伤的实验研究[J].JL大学学报（医学版）：20YY，31（3）：334－336.22．XX，XX，XXX等.一种成膜喷雾剂.发明专利申请公开说明书.20XX.23．XXX.壳聚糖成膜剂特性的研究[J].食品与发酵工业，XXXX，24(1):44-48.项目主要负责人的基本情况HGG：38岁，主任医师。XXXX年毕业于JX医学院，分配在JY儿科系从事小儿整形外科工作（挂靠在JX省儿童医院）。XXX－20XX年于JX医学院攻读硕士学位，20XX年获儿科学硕士学位。20XX－20YY年于JX医学院攻读烧伤外科学博士学位。20XX年调入JX医学院第二附属医院。20YY年获烧伤外科学博士学位。承担科研项目情况1．表皮干细胞构建复合皮的实验研究国家自然科学基金（20YY-20YY）主持2．血管化组织工程复合皮肤的构建与应用研究JX省卫生厅重大招标项目（20YY-20YY）主持3．腰骶部脊神经根在硬膜外间隙的解剖研究与临床应用（已结题）JX省科技厅科技计划第二主持4．腭裂儿童术前正畸技术（已结题）JX省卫生厅科技计划主要研究人员5．婴儿唇腭裂治疗研究（已结题）JX省卫生厅科技计划主要研究人员6．联合皮肤剥脱剂在换肤术中的应用JX省中医药管理局（20XX-20YY）第三主持7．植物雌激素治疗黄褐斑的应用研究JX省中医药管理局（20YY-20YY）第三主持8.脐血干细胞向表皮样细胞诱导的研究JX省科技厅重大招标项目（20YY-20YY）主要研究人员代表作（第一作者）及专著：1．32例小婴儿腭裂修复术中华整形外科杂志20XX，52．选择性脊神经后根切断术JX医药20XX，43．腰骶部脊神经根在硬膜外间隙的解剖研究JX医学院学报20XX，114．新生儿外伤性肝破裂二例JX医学院学报XXX，35．Pierre-Robin综合征的腭裂修复术中国美容医学杂志20XX，106．腭裂术后出血的原因分析及处理办法中国实用美容整形外科杂志20YY，17．端粒酶的研究进展JX医学院学报20XX，28．利用胶原海绵膜构建人工真皮的研究YC学院学报20YY，29．组织工程皮肤的最新进展中国康复医学20YY，110．表皮干细胞的研究进展.国外医学皮肤性病学分册：20YY，311．人胎儿表皮干细胞的体外分离与培养.中国生物工程杂志：20YY，612．AnexperimentalstudyontherepairoffullskinlossofnudemicewithcompositegraftofepidermalstemcellsBurns，accepted13．组织工程活性真皮的构建研究.西安交通大学学报（医学版）：20YY，414．表皮干细胞活性复合皮肤修复裸鼠全层皮肤缺损的研究.中华医学美学美容杂志.20YY.(accepted)发表的著作：1．新编急症手册编著者JX科学技术出版社19972．美容外科学编委JX高校出版社20XX申请的专利：“皮肤干细胞胶原海绵膜人工皮肤的制备方法”已获国家专利。（第二主持）获得的成果：“表皮干细胞活性复合皮肤的构建与实验研究”通过JX省科技厅组织的鉴定，鉴定为国内领先水平（主持）。获得的奖励：“表皮干细胞活性复合皮肤的构建与实验研究”获JX省教育厅20XX～20YY年度科技成果二等奖（主持）DYC：男，研究员，烧伤外科学博士生导师。XXXX年毕业于JX医学院医疗系，毕业后在JX省医学科学研究所工作。XXXX年X月-YYYY年Y月及XXXX年X月-YYYY年Y月分别在加拿大蒙特利尔市蒙特利尔大学及麦吉尔大学留学进修造血干细胞。XXXX年建立烧伤基础研究室。XXXX年获国家科委、国家教委“全国高校科技先进工作者”称号；XXXX年获卫生部“全国卫生系统优秀留学回国人员”称号。其团队在干细胞研究领域作了系统性、创新性研究工作，在国内外有一定的影响：有从事干细胞的研究团队10人，其中博士1人，硕士1人。目前正在指导的在读博士生5人，其研究方向均涉及干细胞（皮肤干细胞、血管内皮祖细胞、神经干细胞及胚胎干细胞）。（一）主持研究的科研项目经省科技厅、卫生厅组织全国同行专家鉴定为国际先进水平2项，国际领先水平2项，国内领先水平1项：1、“慢性淋巴细胞白血病B淋巴细胞集落的形成”，鉴定意见为“达到国际先进水平”。鉴定日期XXXX年10月。2、“人类T淋巴细胞集落的形成”，鉴定意见为“填补国内空白，为国内领先水平”。鉴定日期XXXX年10月。3、“人类B淋巴祖细胞（BL-CFC）体外无血清半固体培养”，鉴定意见为“国际领先水平的创新性成果”。鉴定日期XXXX年3月。4、“无血清培养条件下恶性淋巴瘤细胞的克隆增殖与长期培养”，鉴定意见为“达到国际领先水平”。鉴定日期XXXX年10月。5、“含血清代用品的无血清培养基研究化疗药物及细胞因子诱导的血液肿瘤细胞凋亡”，鉴定意见为“达到国内领先水平，接近国际先进水平”。鉴定日期20XX年12月。（二）主持研究的科研项目先后获省（部）级一等奖2项、二等奖2项、三等奖2项：1、XXXX年，JX省优秀科学技术成果一等奖，慢性淋巴细胞白血病B淋巴细胞集落的形成，排名第一，JX省人民政府。2、XXXX年，JX省优秀科学技术成果三等奖，人类T淋巴细胞集落的形成，排名第一，JX省人民政府。3、XXXX年，卫生部科学技术进步二等奖，慢性淋巴细胞白血病B淋巴细胞集落的形成，排名第一，中华人民共和国卫生部。4、XXXX年，慢性淋巴细胞白血病B淋巴细胞集落的形成获国家科技成果证书，排名第一。5、XXXX年，JX省科学技术进步一等奖，人类B淋巴祖细胞（BL-CFC）体外无血清半固体培养，排名第一，JX省科学技术委员会。6、XXXX年，国家教育委员会科技进步三等奖，“血液干（祖）细胞的无血清克隆和长期培养”，排名第一，中华人民共和国国家教育委员会。7、XXXX年，中国人民解放军科学技术进步二等奖，《造血干细胞移植基础》编著者之一（以姓氏笔划排序），中国人民解放军总后勤部。（三）在国内外发表论文60余篇，参编造血干细胞专业书籍2本。1．DaiYC，etal，B-lymphocytecolonyformationinchroniclymphocyticleukemia．Int．J.CellCloning.1987，5：3762．DaiYC，eta1，Formationoflymphocytecoloniesunderserum-freecultureconditionsinnormalindividualsandpatientswithchroniclymphocyticleukemia．Int．J．CellCloning．1987，5：4803．DaiYC，eta1，Clonogenicassayof1eukemiccellsinserum-freeculture．InVitroCellularandDevelopmentalBiology．1992，28A：6854．DaiYC，etal，Lymphomacellcultureunderserum-freeconditions．InVitroCellularandDevelopmentalBiology1993，29A：6105.DaiYC,etal,Establishmentandcharacteristicsofhumansignetringcellgastriccarcinomacellline(SJ-89)underserum-freeconditions.InVitroCellularandDevelopmentalBiology.20XX,36:629-630.6．DaiYC，etal，Clonalproliferationandlongtermcultureofmalignantlymphomacellsunderserumfreecultureconditions.Chin.J.CancerRes.1990,2:27-30.7．DaiYC,eta1.Effectsofrareearthcompoundsongrowthandapoptosisofleukemiccelllines.InVitroCellularandDevelopmentalBiology.20XX,38(7)：373—375．8．DYC，深入开展细胞凋亡的研究（专论），中华血液学杂志，1996，17：617-618.（四）主持国家和省部级重点课题20余项，其中主持国家自然科学基金及JX省重大攻关课题有：1、人类B细胞肿瘤细胞株的无血清培养和生长因子的研究（国家自然科学基金）；2、印戒细胞癌细胞株及其自分泌生长因子的研究（国家自然科学基金，39760033）；XXXX年1月至20XX年12月。3、稀土暴露的健康效应（国家自然科学基金重点，39869003）；XXXX年1月至20XX年12月。4、组织工程人体组织构建及临床应用（JX省重大课题招标项目）；20XX年1月至20YY年12月。5、干细胞定向诱导、细胞替代治疗和组织工程产品（JX省社会发展科技攻关项目），20XX年7月至20YY年6月。6、干细胞追踪研究（JX省重大课题招标项目）；20XX年9月至20YY年9月。有关本项目的现有工作基础和支撑条件1．工作基础本课题组对干细胞的国内外动态较为了解，对创面的修复也有一定的临床经验。申请者一直从事烧伤整形外科工作。对细胞生物学、分子生物学等也进行了系统的学习。而且4年前已开始骨髓MSCS的研究工作，2年前开始脐血间充质干细胞的研究，对脐血MSCS的分离、纯化、扩增的实验技术已接近成熟。我们的研究结果不仅证实脐带血中存在大量的MSCS，而且可以得到形态较为均一的脐血MSCS群。在完成国家自然科学基金课题“表皮干细胞构建复合皮的实验研究”（30360106）、省卫生厅重大招标项目“血管化组织工程复合皮肤的构建与应用研究”和JX省重大课题招投标项目“脐血干细胞向表皮样细胞诱导的研究”，“组织工程人体组织构建及临床应用”中获得的经验和成熟的方法可供本项目借鉴。故本课题有较好的前期工作基础，所涉及的研究方法和技术路线成熟。实际上，本项目也是我们干细胞研究工作的继续，是总体计划中的组成部分。Figue1示脐血间充质干细胞的不同形态（A：培养第7d；B、C、D：培养2w）2．人员素质：课题组成员梯队合理，具有良好的科研素质和能力。课题第一负责人一直从事创面修复的临床与基础研究工作，创面的修复研究是其科研和临床主攻方向，对该方面的研究动态比较了解，熟练掌握细胞生物学，分子生物学、动物实验学等方面的实验技术。主持国家自然科学基金和省卫生厅重大招标等多项项目，所有课题均按计划完成。课题指导者为烧伤外科学博士生导师，我国第一批在加拿大进修造血干细胞的学者；一直从事干细胞研究。其团队在干细胞研究领域作了系统性、创新性研究工作，在国内外有一定的影响：有从事干细胞的研究团队10人，其中博士5人，硕士2人。目前正在指导的在读博士生3人，其研究方向均涉及干细胞（皮肤干细胞、血管内皮祖细胞、神经干细胞及胚胎干细胞）。3．实验室条件：本项目主要在JX医学院第二附属医院分子医学实验室（省重点实验室）的干细胞中心完成，该中心为国家干细胞工程技术中心的JX分中心，具有实验所需的主要仪器设备。4．目前我院与中国医学科学院协和医科大学血液病医院TJ脐血干细胞库（通过卫生部批准和国家验收）合作建立TJ脐血干细胞库JX分库，还可通过全国联网相互提供各种配型的脐血。故脐血可得到充分保证。另外，大部分试剂可购买到，还可从与本室有联系的国外学者获得技术等方面的支持。基于以上分析，我们在人力、物力及技术条件等方面考虑，都能保证本项目的完成。二、项目实施方案项目达到的目标及考核的主要技术经济指标（含知识产权、技术标准）①建立一种稳定可靠的脐血间充质干细胞分离、纯化、扩增的方法，并进行诱导培养，②制备一无毒的成膜喷雾剂，喷雾于肌体表面后迅速干燥并形成一层多孔性的高分子膜，具有良好的透气性，起到保护创面，防止细菌侵入的作用。③构建含细胞的成膜喷雾剂，使用方便，修复创面效果好。④可获国家级科技成果，获得具有独立知识产权德国家发明专利。项目的主要研究（开发）内容①脐血的收集和单个核细胞的分离②MSCS的培养、纯化、扩增及表型鉴定③MSCS向表皮干细胞的定向诱导培养及表型鉴定④研制含细胞的成膜喷雾剂⑤烧伤动物模型的制备及治疗分组⑥术后创面观察及相关检测试验（开发）规模及地点本试验主要在NC大学第二附属医院省分子医学重点实验室进行主要技术关键及创新点1．用脐血间充质干细胞局部移植修复创面，而且可采用自体或配型相近的脐血干细胞，为临床皮肤损伤后功能性修复提供新的治疗方法。2．用无血清培养方法培养间充质干细胞，避免含血清培养中病毒等病原体污染，可更安全地应用于临床。3．制备一无毒的成膜剂携带细胞，喷雾于肌体表面后迅速干燥并形成一层多孔性的高分子膜，具有良好的透气性，起到保护创面、防止细菌入侵的作用。并且治疗过程相对简单。以上经Medline十年查新，均未见相关报道。实施方案（含技术路线、工艺流程及技术关键的解决方案）技术路线脐血的收集和单个核细胞的分离→MSCS的培养、纯化、扩增及表型鉴定→MSCS向表皮干细胞的定向诱导培养及表型鉴定→研制成膜喷雾剂→研制含细胞的成膜喷雾剂→烧伤动物模型的制备及治疗分组→术后创面观察及相关检测拟采取的研究方案脐血的收集和单个核细胞的分离无菌条件下取正常足月产的脐带血50～100ml，肝素浓度为20U/ml抗凝。用Hank’s平衡盐溶液1：1稀释、混匀，叠加于Ficoll-Hypaque上，以20XXr/min离心20min，取界面层的单个核细胞。洗涤后调整细胞浓度为106/ml.2.MSCS的培养、纯化、扩增及表型鉴定①培养基采用MesencultTM培养液，加入1％Pen-strep,置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％CO2②流式细胞仪进行表型的鉴定：分别用PE、FITC、Cy3、Cy5标记的鼠抗人或兔抗人AC133、CD29、VEGF、CD45、CD34、CD105、CD44、CD54等，多色荧光流式细胞仪进行检测，以同型IgG作阴性对照。MSCS向表皮干细胞的定向诱导培养及表型鉴定脐血MSCS第2次传代后以3×105/cm2的细胞密度置于培养皿，对照组培养条件同前，实验组加EGF40ng/ml。流式细胞仪进行表型鉴定：抗体为PE或FITC标记的鼠抗人K19、K5/8、K10。用同型IgG作阴性对照。用鼠抗人FITC-CD34和PE-CD45以排外造血细胞系列。用双标记流式细胞术检测整合素α6、CD71，抗体为鼠抗人FITC－α6、和PE－CD71。4.研制含细胞的成膜喷雾剂①用培养基、水溶性高分子材料如羟甲基纤维素、聚维酮及壳聚糖等研制一种成膜喷雾剂，摸索其成膜配方和浓度。②将定向诱导的细胞与喷雾剂混合后，于培养箱内培养，分别于1，2，3d,1w,2w检测细胞的数量、活力。5.烧伤动物模型的制备及治疗分组取雌性小型香猪6只，麻醉后，背部剃毛。用自制的模具来制备烧伤动物模型。在背部中线两侧各旁开1.5cm处，由前至后各制备4个深Ⅱ度烧伤的创面（每侧4个），面积为2.5cm2.创面随机分为空白对照组、喷雾剂组、治疗A组、治疗B组，每组各12个创面。空白对照组用生理盐水1ml/创面；喷雾剂组单纯覆盖喷雾剂；治疗A组用未经诱导的MSCS＋喷雾剂覆盖；治疗B组用经体外定向诱导的MSCS＋喷雾剂覆盖。6.术后创面观察及相关检测①术后每天观察创面有无感染、分泌物、愈合面积、愈合质量等情况。②测量创面愈合面积：接种后，密切观察创面情况，于术后6，12天将创面大小描记于无菌透明膜上，按公式计算创口收缩率，记录治疗组和对照组愈合时间。创口收缩率（％）＝闭合创面面积/原创面面积×100%③组织学观察：术后1，2，3，4，6w在无菌条件下用手术刀分别切取创面组织进行组织学观察。每个时间点各取2只动物，共12个创面，每组2个创面。切取创缘1.0×1.0×1.0cm大小组织，置10％甲醛中固定，常规石蜡切片，HE染色，光镜下观察。④透射电镜检查：取各组术后1，2，3，4，6w新生皮肤，2％戊二醛和1％锇酸双固定后，磷酸缓冲液冲洗，梯度酒精脱水，环氧树脂618包埋，切成厚度1.0μm半薄切片，甲苯氨蓝染色，光镜下定位，然后制成50nm超薄切片，经醋酸钠和硝酸铅双重染色后，在透射电镜下观察其超微结构。⑤PCR或FISH技术检测Y染色体（男性胎儿脐带血干细胞喷雾到雌性小型香猪创面）：用创面新生单个核细胞DNA为模板，用Sry基因序列引物，加入Taq酶，PCR缓冲液（500mMKCl、100mMTris-HCl、1.5mMMgCl2、100μg/ml明胶或牛血清白蛋白），加入4种单核苷酸（dATP+dCTP+dGTP+dTTP）各200～250mM,94℃变性2～5分钟，进入PCR循环，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72Sry基因引物：SRY-XEST:5’-CCCGAATTCGACAATGCAATTATGCTTCTGCSRY-XESZ:5’-CTGTAGCGGTCCCGTTGCTGCGGTG用荧光标记Y染色体探针在皮肤组织切片上进行原位杂