细菌分离规范

不同标本涂片的临床价值尿标本涂片：尿标本涂片应无菌离心沉淀后用尿沉渣涂片，正常尿标本是无菌的，当尿培养分离出3种以上的细菌，或分离出凝固酶阴性葡萄球菌、革兰阳性棒状杆菌等非定义为致病菌的细菌，而且涂片未见到，应在报告中提示可能是污染细菌，建议结合临床表现考虑结果的价值。2眼结膜分泌物涂片：正常眼结膜应该是无细菌生长的，如培养分离出凝固酶阴性葡萄球菌或类白喉棒状杆菌，可参考涂片结果，如涂片未见到相应形态细菌，考虑可能是污染细菌，应建议重送标本。为了操作方便可要求采集2根拭子。前列腺液涂片：为了操作方便可要求采集2根拭子，一根用于涂片，一根用于培养。当标本分离出凝固酶阴性葡萄球菌或棒状杆菌，而涂片未见到，可能是污染细菌，应建议重送标本。痰涂片：由于痰标本口腔污染不可避免，对痰培养中分离到的细菌确定是否致病菌十分必要。用以下两种标准可帮助区别：涂片中见到的细菌，并有细菌吞嗜现象存在，在培养时分离出该细菌可推测为致病菌。每一视野可见到>20个/油镜或该菌占所见到细菌的50%,可推测是标本中的优势细菌，也可推测为该标本的致病菌。报告单日期涂片报告的日期和培养报告日期要对应，便于医生判别结果的参考价值。（二）如何写涂片报告基层微生物实验室应具备最基本的两种染色技术，即革兰氏染色和抗酸染色。革兰染色革兰染色报告必须包括染色反应或微生物种类和类别，描述菌种的形态或结构。如：革兰染色见到少量革兰阳性球菌，呈葡萄状排列；又如革兰染色见到大量真菌小分生孢子及菌丝；革兰染色见到真菌孢子和菌丝++，有顶囊，菌丝分隔。抗酸染色抗酸染色报告应显示找到或未找到或可疑抗酸杆菌三种结果，报告中应以加号体现标本中抗酸杆菌的存在量。如：找到抗酸杆菌++;见到染色不典型抗酸杆菌+，建议再送标本。结核菌检测也可采用金胺荧光染色，但需用荧光显微镜观察结果趋向性鉴定试验是细菌鉴定非常重要的步骤，甚至决定鉴定的基本思路趋向性鉴定试验常规鉴定中主要的趋向性鉴定试验包括触酶试验、。-溶血和氧化酶试验，在无条件深入鉴定的实验室趋向性鉴定试验是决定葡萄球菌、链球菌和肠杆菌或非发酵革兰阴性菌的重要验验。所以正确做好趋向性鉴定试验十分重要。</p>触酶试验常用3%过氧化氢，使用后应4度冰箱保存，每周更换一次。新配制试剂应用阳性反应的葡萄球菌和阴性反应的链球菌做鉴定。阳性反应：试剂加入菌液立即产生气泡，反之为阴性。反应过程不应接触铁器、血液等物质以避免假阳性。氧化酶试验氧化酶试剂可采用盐酸二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺，配制成1%的水溶液或做成纸片，纸片可于-25°C低温冰箱保存备用。1%盐酸二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺水溶液很容易失效应置4度保存。快反应细菌阳性反应应在5-10s内在沾试验菌的滤纸上出现红色到到深紫色的颜色反应，但不同细菌出现阳性时间不同。如铜绿假单孢菌反应非常快,2-3秒即可出现反应但流感嗜血杆菌需5-10分钟。生化试验条列要求实验室应该开展以下七类生化试验，并进行有效的质量控制应包括临床常见分离致病菌的生物特征：有条件的实验室建议购买商品鉴定系统，根据标本量选择手工操作的API系统或自动化的ATB系统或全自动的VITEK-2COMPACT,或PHENIX-100等，无条件的实验室可自行配制生化试剂，但应基本具备以下7类生化试验并有质量控制记录保证试剂的实效性。</p>（一） 糖醇类代谢试验1糖醇发酵试验应包括常用的糖发酵试验如：葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、乳糖、麦牙糖、甘露醇、蔗糖等。2.伏普（Voges-ProsKauer）试验（V-P）常用奥梅拉方法（O-Meara）和贝立脱（Barritt）。产气肠杆菌、阴沟肠杆菌分解葡萄糖后可将丙酮酸转换为乙酰甲基甲醇并与空气中的氧结合生存二乙酰，二乙酰与培养基中的胍基作用生成红色化合物。沙雷菌、阴沟、产气呈现阳性反应，而大肠杆菌、沙门菌、志贺菌为阴性反应。本试验常与甲基红试验呈相反的结果。3.甲基红2（MR试验）测试待检菌分解葡萄糖后是否将丙酮酸转换为乙酰甲基甲醇。某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸继续分解为甲酸、乙酸、乳酸使培养基PH降至4.5以下，当加入甲基红试剂时培养基呈红色。大肠杆菌、沙门菌、志贺菌呈阳性反应。P-半乳糖苷酶试验测试细菌是否具有半乳糖苷酶，可鉴别细菌是迟缓发酵乳糖或不能发酵乳糖。能迅速发酵乳糖的细菌含6-半乳糖苷酶和半乳糖苷渗透酶，仅含6-半乳糖苷酶能迟缓分解乳糖，用6-半乳糖苷（ONPG）类似乳糖的小分子物质可迅速获得阳性结果。七叶苷水解试验用于鉴别D群链球菌和A、B、群链球菌。D群链球菌为阳性反应。细菌分解七叶苷生成七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁结合生成黑色化合物。（二） 氨基酸和蛋白质代谢试验靛基质试验（IND）测试细菌是否具分解色氨酸的能力。细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚（靛基质）与试剂中的二甲氨基苯甲醛作用生成玫瑰吲哚呈红色。配制靛基质试验的蛋白胨应富含色氨酸。是埃希菌属和肠杆菌属重要的鉴别试验。硫化氢试验测试细菌分解含硫氨基酸的能力，细菌分解培养基中的胱氨酸产生硫化氢，硫化氢与铁或铅结合生成黑色的硫化物。在肠杆菌科内各菌属的鉴定有重要的价值。费劳地枸橼酸杆菌、爱德华菌、沙门菌中某些菌种为阳性。尿素酶测试细菌分解尿素的能力，细菌分解尿素产生大量的氨使培养基呈碱性。是变形杆菌属的重要特征，是变形杆菌属与肠杆菌其他菌属重要的鉴别试验。苯丙氨酸脱氨酶试验与尿素酶试验结合鉴定变形杆菌。氨基酸脱羧或双水解酶试验试验测试细菌分解氨基酸脱氨或水解能力。（三）有机酸盐利用试验柠檬酸盐利用试验测试细菌能否利用柠檬酸盐作为碳源。是大肠杆菌和肠杆菌属细菌重要的区别特征。丙二酸盐利用试验测试细菌能否利用丙二酸盐作为唯一的碳源。马尿酸钠水解试验是B群链球菌重要的特征。生长因子X因子、V因子、X+V因子，用于流感嗜血杆菌和非流感嗜血杆菌的鉴别。（四） 呼吸酶试验氧化酶试验测试细菌是否存在氧化酶，常作为肠杆菌科细菌和非发酵细菌鉴定的重要的趋向性试验触酶试验是鉴别葡萄球菌和链球菌的重要导向性试验。硝酸盐还原试验还原硝酸盐是鉴别肠道细菌重要特征。（五） 毒性酶类试验血浆凝固酶试验病原性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，用于区别金黄色葡萄球菌和其他葡萄球菌。溶血试验区别细菌是否含溶血素，是完全溶血或部分溶血。常用于溶血链球菌的鉴别。（六） 其他鉴定试验胆汁溶解试验肺炎链球菌有自体溶解酶，胆汁可加速肺炎链球菌的自体溶解酶产生自溶现象。是肺炎链球菌和草绿链球菌重要的鉴别试验。耐盐试验致病性嗜盐菌可在含30-60g/l的环境中生长，在无盐的培养基中不能生长是其重要的鉴别试验。血清学鉴定试验肠道致病菌生化特征符合的前提下必须有血清学的试验作最后确认，基层细菌室应具备1-3项血清试剂。＜志贺氏菌多价和单价凝集血清用于志贺痢疾菌属种间的鉴别。沙门氏菌多价和单价凝集血清用于沙门菌属种间鉴别。致病性大肠杆菌多价和单价凝结血清用于致病性大肠杆菌型间鉴别。耶尔森氏菌凝集血清用于小肠结肠炎耶尔森菌的血清型确认。真菌鉴定对酵母样真菌现在已有比较成熟的商品鉴定系统如API20C，自动细菌鉴定和药敏系统也可对念珠菌、隐球菌、毛孢子菌等多种酵母样真菌作出鉴定，但对丝状真菌的鉴定主要依赖于形态学的鉴定。在没有条件拥有自动化设备的实验室可建立玉米培养基的厚膜孢子试验或芽管生成试验鉴定白色假丝酵母，也可采用真菌呈色鉴定培养基区别白色假丝酵母和其他的念珠菌。结合葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和乳糖可初步区分念珠菌属。1. 真菌涂片每一基层实验室必须开展真菌涂片，报告临床是否找到真菌；是否见到真菌菌丝；从形态辨别曲菌或毛霉菌并告诉医生参考的信息。分离培养应具备最基本的沙保弱培养基作常见临床致病真菌的分离。真菌鉴定应区别是白色念珠菌或非白色念珠菌、是曲菌或毛霉菌，可用显色培养基或传统手工鉴定厚膜孢子的方法。对丝状真菌用小培养观察生长过程